Den nylige epidemi af Zikavirus fremhæver vigtigheden af at etablere omvendte genetiske tilgange til at udvikle vacciner og/eller terapeutiske strategier. Her beskriver vi protokollen til at redde en infektiøs rekombinant Zikavirus fra en fuld længde cDNA-klon samlet i et bakterielt kunstigt kromosom under kontrol af det humane Cytomegalovirus umiddelbare tidlige promotor.
Sammenslutningen af zikavirus (ZIKV) infektion med neurologiske komplikationer under det seneste verdensomspændende udbrud og manglen på godkendte vacciner og/eller antivirale lægemidler har understreget det presserende behov for at udvikle ZIKV omvendte genetiske systemer for at lette undersøgelse af ZIKV biologi og udvikling af terapeutiske og/eller profylaktiske tilgange. Men, ligesom med andre flavivira, generation af ZIKV fuld længde infektiøse cDNA kloner er blevet hæmmet på grund af toksiciteten af virale sekvenser under dens forstærkning i bakterier. For at løse dette problem har vi udviklet en ikke-traditionel tilgang baseret på brugen af bakterielle kunstige kromosomer (BACs). Ved hjælp af denne fremgangsmåde genereres den fulde cDNA-kopi af ZIKV-stammen Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) fra fire syntetiske DNA-fragmenter og samles i en enkelt kopi pBeloBAC11 plasmid under kontrol af humant Cytomegalovirus (CMV) hurtig promotor. Den samlede BAC cDNA-klon er stabil under formering i bakterier, og infektiøs rekombinant (r) zikv genvindes i Vero-celler efter transfektering af BAC-cDNA-klonen. Den protokol, der er beskrevet her, giver en effektiv teknik til generering af infektiøse kloner af flavivira, herunder ZIKV, og andre positive-streng RNA-vira, især dem med store genomer, som har stabilitetsproblemer under bakterielle udbredelse.
ZIKV er et myg-båret medlem af flavivirus slægten i Flaviviridae familien, som i øjeblikket udgør en global folkesundheds nødsituation1. Ligesom andre flavivira er ZIKV et kappebærende RNA-virus med en icosahedral-lignende struktur, der indeholder en positiv fornemmelse, enkeltstrenget RNA-molekyle på ca. 10,8 KB (figur 1)2. Det virale genom koder et stort polyprotein på ca. 3.423 aminosyrer, der behandles af virale og cellulære proteaser i tre strukturelle proteiner (capsid [C], premembran/membran [prM/M] og konvolut [E]), der er involveret i dannelsen af virale partikler og syv ikke-strukturelle (NS) proteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B og NS5), der deltager i genom-replikation, virus samling og unddragelse af værts immunrespons (figur 1)3.
Historisk, zikv infektion har været forbundet med en mild febril sygdom4,5. Men den eksplosive nylige pandemi af zikv infektioner i hele syd-og Mellemamerika, det sydlige Stillehav, og Caribien6,7,8, og dets tilknytning til forekomsten af Guillain-Barré syndrom og microcephaly9,10,11,12,13, har ændret den historiske opfattelse og potenseret relevansen af zikv som en vigtig menneskelig patogen. I denne forstand vil udviklingen af molekylære værktøjer, såsom infektiøse cDNA-kloner, lette studiet af viral patogenese og udvikling af genetisk definerede vacciner og identifikation af antivirale lægemidler til behandling af ZIKV-infektion. Som beskrevet for andre flavivira er genereringen af ZIKV infektiøse kloner vanskelig på grund af tilstedeværelsen af kryptiske bakterie promotorer i det virale genom14 , der muliggør utætte ekspression af giftige virale proteiner under udbredelsen af cDNA kloner i bakterier ved hjælp af standard høj-kopi-nummer plasmider15,16,17. For at overvinde dette toksicitets problem er flere ikke-traditionelle tilgange blevet gennemført med succes i de sidste to år18. Disse omfatter brugen af lav-kopi-nummer plasmider19,20, indsættelse af introner til at forstyrre de giftige områder21,22,23, in vitro-ligationen af cDNA-fragmenter 24 , 25, Mutations hæmning af kryptiske bakterielle promotorer til stede i det virale genom26,27, infektiøse subgenomic amplikoner (ISA)28,29, den Gibson assembly metode30 , og brugen af cirkulær polymeraseforlængelses reaktion (CPER)31.
Heri beskriver vi den detaljerede protokol for konstruktion af en cDNA-klon i fuld længde af zikv-stammen zikv-RGN13ved hjælp af en BAC til at overvinde toksicitets problemet og redning af infektiøs rzikv ved direkte transfektering af BAC cDNA-klonen i Vero celler32, en cellelinje godkendt af Food and Drug Administration (FDA) til udvikling af humane vacciner33. I dette system samles cDNA-kopien af det virale genom i fuld længde i BAC plasmid pBeloBAC1134 (figur 2a), et plasmid med lav kopi (en til to kopier pr. celle) afledt af Escherichia coli F-faktor35. som minimerer toksiciteten af flavivirus sekvenser under dets udbredelse i bakterier. CDNA af zikv genom er samlet i pBeloBAC11 under kontrol af human CMV umiddelbar tidlig promotor, at tillade ekspression af viral (v) RNA i kernen af transficeret celler af cellulære RNA polymerase II, og flankeret ved 3 ‘-ende af hepatitis Delta virus (HDV) ribozymer (RZ), efterfulgt af sekvenser af kvæg væksthormon (BGH) opsigelse og polyadenylering signaler til fremstilling af syntetiske RNAs forsynet med autentiske 5 ‘-og 3 ‘-ender af det virale genom, henholdsvis (figur 2b). Dette cDNA-lancerede system resulterer i det intracellulære udtryk af udjævnet viral RNA, hvilket gør det muligt at inddrive infektiøs ZIKV uden behov for et in vitro transkriptionstrin. BAC-tilgangen giver en effektiv metodologi, der anvendes til at konstruere stabile og fuldt funktionelle infektiøse cDNA-kloner til andre flavivira, samt andre positive-strengede RNA-vira36,37, 38,39,40,41.
Infektiøse cDNA-kloner udgør essentielle molekylære værktøjer til grundforskning af RNA-vira og udvikling af vacciner og/eller identificering af antivirale strategier. Men for mange positive-strandede RNA-vira, herunder flavivira, er genereringen af infektiøse cDNA-kloner vanskelige på grund af ustabiliteten i de klonede Cdna’er, når de spredes i bakterier ved hjælp af standard plasmider af høj kopi-nummer. I tilfælde af zikv og andre flavivira skyldes denne ustabilitet hovedsagelig det utætte udtryk af giftige virale proteiner fra kryptiske bakterie promotorer, der er til stede i det virale genom14,15,16,17 . Her beskriver vi en alternativ og kraftfuld protokol til at generere en stabil ZIKV fuld længde infektiøs cDNA-klon som en enkelt plasmid, baseret på brugen af BAC plasmid pBeloBAC1134 (figur 2a) for at overvinde toksicitets problemet, brugen af CMV Promoter til at give mulighed for at ekspression af vrna i kernen af transficeret celler, og HDV RZ til at generere vrnas med nøjagtige 3 ‘-Ends (figur 2b). Ved hjælp af denne metode, har vi med succes genereret en fuldt stabil infektiøs klon af zikv stamme RGN, der giver mulighed for effektiv og pålidelig genopretning af infektiøs rzikv efter direkte transfektering af følsomme Vero celler (figur 3 og Figur 4).
En enorm indsats er blevet gjort i de sidste par år for at overvinde de ustabilitet problemer forbundet med zikv infektiøse cDNA kloner, og flere tilgange er blevet gennemført18, herunder in vitro-ligering af cDNA-fragmenter24 ,25, lav-kopi plasmider19,20, inaktivering af kryptiske bakterie promotorer ved indførelsen af tavse mutationer26,27, intron indsættelse21, 22 , 23, Gibson assembly metode30, ISA metode28,29, og brugen af cper31. Selv om disse tilgange overvinde toksiciteten problem og er nyttige til at generere zikv infektiøse cDNA kloner, nogle af dem er omstændelig og præsentere flere ulemper, herunder behovet for in vitro-ligering og transkriptionstrin, der reducerer virus nyttiggørelse effektivitet eller indførelsen af et stort antal tavse mutationer at inaktivere kryptiske bakteriel promotor, der kan påvirke viral fitness, blandt andre. Den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne protokol, giver følgende fordele. i) BAC plasmid pBeloBAC1134 har en strengt kontrolleret replikation, der holder en eller to eksemplarer af plasmid pr. celle, hvilket minimerer toksicitet og muliggør stabil vedligeholdelse i bakterier af ustabile cdnas. II) formering og modifikation af BAC plasmider er næsten ligner dem af konventionelle plasmider, i betragtning af de små ændringer beskrevet i denne protokol til at manipulere store størrelse BAC-DNA-fragmenter og lav-kopi plasmider. Især kan BAC cDNA-klon også modificeres til E. coli ved homologe rekombination ved hjælp af det røde rekombinationsystem42,43,44. III) brugen af CMV Promoter gør det muligt at intracellulære udtryk af udjævnet ZIKV vRNA og genopretning af infektiøse vira uden at kræve et in vitro transkriptionstrin. IV) infektiøs rzikv genereres efter direkte transfektering af modtagelige celler (f. eks. Vero) med BAC-cDNA-klonen. Da DNA-transfektering i pattedyrsceller er mere effektivt end RNA-transfektering, er virus genvindingseffektiviteten med BAC-tilgangen højere end den, der observeres ved hjælp af RNA-udskrifter, hvilket reducerer antallet af passager i kultur celler for at generere en viral bestand, og derfor begrænse indførelsen af uønskede mutationer ved cellekultur tilpasning.
Endelig er potentialet i BAC-tilgangen understøttet af en vellykket anvendelse af denne metode (med mindre modifikationer) til at konstruere infektiøse cDNA-kloner af andre flavivira, herunder dengue-virus36, og flere coronaviruser med stor virkning i menneskers og dyrs sundhed, såsom overførbare gastroenteritis coronavirus37 (tgev), Feline infektiøs peritonitis virus38 (fipv), Human coronavirus OC4339 (hcov-OC43), svær Akut respiratorisk syndrom coronavirus40 (SARS-CoV), og Mellemøsten respiratorisk syndrom coronavirus41 (MERS-COV), blandt andre.
I den her beskrevne protokol er der to vigtige trin, der bør tages i betragtning. En vigtig overvejelse er at identificere passende unikke restriktionssteder i det virale genom, der er fraværende i BAC plasmid. Hvis der ikke findes nogen passende begrænsnings steder, kan der genereres nye begrænsnings steder under klonings designet ved at indføre tavse nukleotidmutationer. Et andet vigtigt spørgsmål er, at BAC-plasmiderne kun er til stede i en eller to eksemplarer pr. celle, og derfor opnås der lave udbytter af BAC-plasmider med en høj kontaminering af bakteriel genomisk DNA ved hjælp af standardprotokoller designet til høj-og medium-kopi-nummer Plasmids. Dette potentielle problem er let at overvinde ved hjælp af store kultur mængder og rense BAC plasmid med et kommercielt kit specielt udviklet til BAC rensning.
Sammenfattende har vi udviklet en kraftig ZIKV reverse genetisk tilgang baseret på brugen af en BAC, der kunne tilpasses til at generere stabile og fuldt funktionelle infektiøse cDNA-kloner af andre positive-strandede RNA-vira for at lette studiet af biologi af disse virus og udvikling af vacciner og/eller lette identifikationen af antivirale lægemidler.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Carla Gómez for hendes tekniske assistance i BAC cDNA Clone generation og Snezhana Dimitrova for at hjælpe med video forberedelsen. Dette arbejde blev delvis støttet af tilskud fra det spanske økonomi-og konkurrence ministerium (MINECO, Grant Number BFU2016-79127-R) til F.A.T. og de nationale institutter for sundhed (NIH, Grant nummer 1R21AI120500) til L.M.S. og F.A.T.
1. Molecular Biology Reagents | |||
Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 units/mL |
AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 units/mL |
BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 units/mL |
BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 units/mL |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 units/mL |
Oligonucleotides | IDT | N/A | |
Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 units/mL |
Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/mL |
SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 units/mL |
2. Cell Culture Reagents | |||
6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
Agar Noble | VWR | 214230 | |
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
Cell Culture Dishes (100×21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
High-Speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
Vortexer | Varies | N/A |