对多个生物分子进行系统分析对于获得对生物过程的功能和机械见解至关重要。因此,描述了一个广泛的协议,用于从从同步衣原体培养中采集的单一样本中高通量提取脂质、代谢物、蛋白质和淀粉。
微藻一直是其在高价值化合物、食品和燃料生产中的应用研究的重点。此外,它们是有价值的光合模型,有助于理解基本的细胞过程。系统范围的研究有助于全面和深入地了解生物体的分子功能。然而,蛋白质组学、脂质学和代谢组学研究需要多个独立的样本和协议,这些研究具有更高的误差和可变性。这里介绍了一种强大的高通量提取方法,用于同时从绿色藻类衣原蛋白的单个样品中提取叶绿素、脂质、代谢物、蛋白质和淀粉。图示的实验设置适用于使用 12 h/12 h 光/暗条件同步的衣原体培养物。在24小时细胞周期内采集样本,证明使用各种分析平台获得的代谢物、脂质和淀粉数据均符合要求。此外,使用相同的提取方案采集的蛋白质样本进行详细的蛋白质组学分析,以评估其质量和可重复性。根据这些数据,可以推断,图示方法提供了一个强大和可重复的方法,以增进对各种生物化学途径及其功能的理解,更有信心的基础和应用研究。
微藻是天然产品(如燃料、人类和动物营养、化妆品和药理物质)的丰富来源。为了提高微藻1、2、3、4等高价值产品的生产效率,我们进行了大量研究。系统层面对新陈代谢的理解是提高天然产品的质量和产量的先决条件5,6,7。随着功能基因组技术的出现和改进的质谱方法,数千个基因、转录本、蛋白质和代谢物可以同时被监测。然而,深入蛋白质组学、脂质学和代谢组学研究需要多个样本,这在单细胞生物体中往往难以实现,特别是如果要进行时间课程研究。此外,将不同样本等分的收集和处理与不同的协议相结合,以收集高度复杂的组分数据(即蛋白质组、脂质组和代谢组学),引入可变性,从而使数据的集成成为具有挑战性的任务。
衣原体不仅为细胞过程的研究提供了优良的微生物系统,而且为研究细胞周期和代谢的协调提供了方便的模型。因此,使用对衣原体8的同步培养的高分辨率转录组分析,显示了与细胞周期的转录表达的强烈协调。约80%的被分析的转录本在24小时细胞周期8中表现出强健的周期性。同样,在一项研究中,两种不同菌株的衣原体干重、蛋白质、叶绿素、氨基酸和脂肪酸与细胞分裂相关,该研究每4小时9次进行一次取样。最近,据报道,代谢物和脂质动力学的细胞转移基于细胞周期10的特定阶段。使用坚固的甲基醚-丁基醚(MTBE):甲醇:水基萃取方法,可监测不同生物分子的细微变化,为全面的多组分分析提供了一个理想的起点。,11.
提出的协议指南通过可重复和有效的策略10,同时从单个样本等分中提取脂质,代谢物,蛋白质和淀粉,为时间解决了代谢和脂质学研究同步生长的衣原体文化。除了说明强健和可重复的代谢和脂质数据10外,这里还演示了从同一颗粒获得的蛋白酶样本的质量。
在本文中,我们展示了一个强大且高度适用的提取方案,用于从10-15 x 106细胞的单粒中进行综合脂质组学、代谢组学、淀粉和蛋白质组学分析。该方法已在多种研究中成功实现,研究范围广泛,研究范围广泛,研究范围广泛,研究范围为10、14、21、22、23、24、25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36.在这里,我们提出了一个逐步管道,用于从从衣原体(CC-1690 mt+)培养中采集的单一样本中分一步分析不同的生物分子。
该协议提供了一种强大且可重复的方法,用于同时处理多个样品,用于分析各种生物分子。但是,应注意执行一些关键步骤,以尽量减少技术差异。首先,应尽快收获细胞,同时保持所有采集样品的统一条件,以保持细胞的生物状态。虽然我们使用离心来收获细胞,但替代采集策略可用于采集样品。然而,需要注意的是,不同的收获策略已知会影响细胞的代谢状态37因此,必须对所有实验样本采用一致的采集方法。其次,避免干燥含有叶绿素的上部非极性,因为这会影响溶剂中溶解叶绿素的水平,影响样品的正常化因子。最后,在去除剩余的极性时应注意获得蛋白质和淀粉颗粒,以避免干扰可能影响淀粉和蛋白质含量的颗粒。
因此,提出的提取协议为多组分数据分析提供了几个优点。除了最小化所需的样品等分数外,它还减少了不同生物分子的分析结果之间的差异。这允许直接比较从初级代谢物、脂质和蛋白酶数据中获得的结果。同样,同时提取多个复合类允许不同数据集的一致和统一规范化策略。如果使用干重或新鲜重量38或细胞号很难实现规范化,则尤其适用。
该协议可以用于对复杂生物样品进行常规筛选。这些整体代谢、脂质和蛋白酶数据集可以提供关于代谢系统变化的全面信息。此外,从蛋白质组学分析中获得的数据提供了对蛋白质与代谢物相关的定量(丰度)和定性(修饰)变化的见解。因此,整合组学数据可以揭示关于生物系统遗传或生物和/或非生物扰动引起的变化的深入信息。因此,阐明特定代谢途径或细胞过程的分子变化。同样,这些高通量数据可以识别代谢工程的目标,并优化或测试来自基因组规模代谢模型37,39的预测。
The authors have nothing to disclose.
我们非常感谢古德伦·沃尔特和奥内·米夏里斯的出色技术援助。我们要感谢贾瓦利斯科实验室的所有成员的帮助。我们感谢马克斯·普朗克协会资助了L A Giraldi奖学金的研究和FAPESP
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |