Çoklu biyomoleküllerin sistem çapında analiz biyolojik süreçlere işlevsel ve mekanik anlayışlar elde etmek için çok önemlidir. Bu konuda geniş bir protokol, senkronize Chlamydomonas kültüründen toplanan tek bir örnekten lipidler, metabolitler, proteinler ve nişasta yüksek verimlilik ekstraksiyonu için tanımlanmıştır.
Mikroalgler, yüksek değer bileşikleri, gıda ve yakıt üretiminde uygulamaları için araştırma odağı olmuştur. Dahası, temel hücresel süreçlerin anlayışını kolaylaştıran değerli fotosentetik modellerdir. Sistem çapında çalışmalar, organizmaların moleküler fonksiyonlarının kapsamlı ve derinlemesine anlaşılması sağlar. Ancak, proteomik, lipidomics ve metabolomikler çalışmaları için daha yüksek hata ve değişkenlik tanıtan birden fazla bağımsız numune ve protokol gereklidir. Chlorophyll, lipidler, metabolitler, proteinler ve nişasta yeşil Alga Chlamydomonas reinhardtii tek bir örnekten eşzamanlı ekstraksiyon için sağlam bir yüksek verimlilik ekstraksiyon yöntemi burada sunulmaktadır. Resimli deneysel kurulum Chlamydomonas kültürler için 12 h/12 h ışık/karanlık koşullar kullanılarak senkronize etmektir. Numuneler, çeşitli analitik platformlar kullanılarak elde edilen metabolitlerin, lipidlerin ve nişasta verilerinin iyi şekilde uyumlu olduğunu göstermek için 24 saat hücre döngüsü üzerinden toplanır. Ayrıca, aynı ekstraksiyon protokolü kullanılarak toplanan protein örnekleri, kalitesini ve yeniden üretilebilirliği değerlendirmek için ayrıntılı proteomik analiz yapmak için kullanılmıştır. Verilere dayanarak, bu resimli yöntemin çeşitli biyokimyasal yollar ve fonksiyonları hem temel hem de uygulamalı araştırma için daha fazla güven ile önceden anlamak için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar anlaşılabilirdir.
Mikroalgler doğal ürünlerin zengin bir kaynağıdır (örneğin, yakıtlar, insan ve hayvan beslenme, kozmetik ve farmakolojik maddeler). Yüksek değerli ürünlerin üretiminin verimliliğini arttırmak için çok sayıda araştırma çalışmaları yapılır1,2,3,4. Sistem düzeyinde metabolizma anlayışı, kalite ve doğal ürünler5,6,7verim geliştirmek için bir ön şart. Fonksiyonel genomik tekniklerin ve geliştirilmiş Kütle Spektrometrisi yöntemlerinin gelişmesiyle birlikte, binlerce gen, transkripti, protein ve metabolitler aynı anda izlenebilir. Ancak, özellikle zaman kursu çalışmaları gerçekleştirildiğinde, genellikle tek hücreli organizmalarda ulaşmak zor olan derinlemesine proteomikler, lipidomics ve metabolomikler çalışmaları için birden fazla numune gereklidir. Ayrıca, son derece karmaşık omik verilerini (yani, proteomik, lipidomik ve metabolomics) toplamak için farklı örnek plakaya çeşitli protokollerle birlikte toplama ve işlenmesi, böylece veri entegrasyonu yapma, varyasyon tanıttı zorlu bir görev.
Chlamydomonas hücresel süreçlerin incelenmesi için sadece mükemmel bir mikrobiyal sistem değil, aynı zamanda hücre döngüsü ve metabolizma koordinasyonunu incelemek için uygun bir model sağlar. Buna göre, hücre döngüsü ile transkriptler ifade güçlü bir koordinasyon Chlamydomonas8senkronize kültürün yüksek çözünürlüklü transkriptom profil kullanılarak gösterilmiştir. Yaklaşık 80% analiz edilen transkriptler 24 saat hücre döngüsü8üzerinde sağlam periodicity sergiledi. Aynı şekilde, Kuru ağırlık, proteinler, klorofil, amino asitler ve Chlamydomonas iki farklı suşlarının yağ asitleri örnekleme her 4 h9gerçekleştirilen bir çalışmada hücre bölünmesi ile ilişkilendirmek için gösterildi. Son zamanlarda, hücre döngüsünün belirli aşamalarına dayalı hücre vardiyasının metaboliti ve lipid dinamiklerinin10olduğunu bildirdi. Farklı biyomoleküllerin içindeki ince değişiklikler güçlü bir metil tert-butil eter (MTBE) kullanarak izlemek mümkün oldu: metanol: su bazlı ekstraksiyon yöntemi, kapsamlı Multi-omics analizi için ideal bir başlangıç noktası sunuyor10 , 11‘ den itibaren.
Bir tekrarlanabilir ve verimli strateji ile sunulan protokol kılavuzları10, lipidler eşzamanlı ekstraksiyon için, metabolitler, tek bir örnek aliquot gelen nişasta, zaman için metabolomik ve lipidomic çalışma çözüldü eşzamanlı büyüyen Chlamydomonas kültürler. Güçlü ve tekrarlanabilir metabolik ve lipidomik verileri göstermenin yanı sıra10, burada, aynı Pelet elde edilen proteomik numunelerin kalitesi de gösterilmiştir.
Bu yazıda, 10-15 x 106 hücreli tek bir pelemden kapsamlı lipidomics, metabolomics, nişasta ve proteomik analizi için sağlam ve son derece uygulanabilir bir ekstraksiyon Protokolü tasvir ettik. Yöntem, geniş bir yelpazede hücreler ve dokular için çeşitli çalışmalarda başarıyla uygulandı10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Burada, Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 MT +) kültüründen hasat edilen tek bir örnekten farklı biyomoleküllerin çok omics analizi için aşamalı bir boru hattı sundu.
Protokol, çeşitli biomolecules analizi için aynı anda birden fazla numune işlemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar. Ancak, kritik adımlar bir dizi teknik varyasyonu en aza indirmek için bakımı alınmalıdır. İlk olarak, hücrelerin biyolojik durumunu korumak için tüm hasat edilen numuneler için üniforma koşullarını korurken hücrelerdeki hasat mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Hücreleri hasat etmek için santrifüjleme kullanılsa da, numunelerin hasat edilmesi için alternatif hasat stratejileri kullanılabilir. Ancak, farklı hasat stratejileri hücrelerin metabolik durumunu etkileyen bilinen dikkat etmek önemlidir37 bu nedenle, tutarlı hasat yaklaşımı tüm deneysel örnekler için kullanılmalıdır. İkincisi, bu numuneler için normalleştirme faktörü etkileyen solvent çözünmüş klorofil seviyelerini etkileyebilir çünkü, klorofil içeren üst olmayan kutupsal faz kurutulması önlemek önemlidir. Son olarak, protein ve nişasta peletini elde etmek için kalan kutup fazı kaldırılırken bakım alınmalıdır, nişasta ve protein içeriğini etkileyebilecek Pelet rahatsız önlemek için.
Böylece sunulan ayıklama Protokolü birden fazla omics veri analizi için çeşitli faydalar sunar. Gerekli örnek plakaya sayısını minimize yanı sıra, aynı zamanda farklı biomolecules için elde analitik sonuçlar arasındaki varyasyonu azaltır. Bu, primer metabolitlerin, lipidlerin ve proteomik verilerden elde edilen sonuçların doğrudan karşılaştırılmasını sağlar. Benzer şekilde, birden çok bileşik sınıfın eşzamanlı ayıklama farklı veri kümeleri tutarlı ve Tekdüzen normalleştirme stratejisini sağlar. Normalleştirme kuru veya taze ağırlık38 veya hücre numarası kullanarak elde etmek zor ise bu özellikle geçerlidir.
Protokol, kompleks biyolojik numunenin rutin taraması için uygulanabilir. Bu bütünsel metabolomik, lipidomik ve proteomik veri setleri metabolizmada sistematik değişiklikler hakkında kapsamlı bilgiler sunabilir. Ayrıca, proteomik analizinden elde edilen veriler, metabolitler ile ilgili olarak proteinlerde niceliksel (bolluk) ve nitel (Modifikasyon) değişikliklerine ilişkin öngörüler sağlar. Bu nedenle, omik veri entegre bir biyolojik sistemin genetik veya biyotik ve/veya abiyotik perturbations tarafından indüklenen değişiklikler hakkında derinlemesine bilgi ortaya olabilir. Bu nedenle, spesifik metabolik yolların veya hücresel süreçlerin moleküler değişikliklerinin aydınlatılmasına. Benzer şekilde, bu yüksek verimlilik verileri, metabolik Mühendislik için hedeflerin tanımlanmasına izin verebilir ve genom ölçekli metabolik modeller37,39‘ den tahminler iyileştirebilir veya test edilir.
The authors have nothing to disclose.
Mükemmel teknik yardım için Gudrun Wolter ve Änne Michaelis ‘e çok minnettarız. Biz onların yardımı için Giavalisco laboratuvarının tüm üyelerine teşekkür etmek istiyoruz. L A Giraldi ‘nin kardeşliği için araştırma ve FAPESP finansmanı için Max Planck Derneği ‘ne minnettarız.
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |