Summary
Çoklu biyomoleküllerin sistem çapında analiz biyolojik süreçlere işlevsel ve mekanik anlayışlar elde etmek için çok önemlidir. Bu konuda geniş bir protokol, senkronize Chlamydomonas kültüründen toplanan tek bir örnekten lipidler, metabolitler, proteinler ve nişasta yüksek verimlilik ekstraksiyonu için tanımlanmıştır.
Abstract
Mikroalgler, yüksek değer bileşikleri, gıda ve yakıt üretiminde uygulamaları için araştırma odağı olmuştur. Dahası, temel hücresel süreçlerin anlayışını kolaylaştıran değerli fotosentetik modellerdir. Sistem çapında çalışmalar, organizmaların moleküler fonksiyonlarının kapsamlı ve derinlemesine anlaşılması sağlar. Ancak, proteomik, lipidomics ve metabolomikler çalışmaları için daha yüksek hata ve değişkenlik tanıtan birden fazla bağımsız numune ve protokol gereklidir. Chlorophyll, lipidler, metabolitler, proteinler ve nişasta yeşil Alga Chlamydomonas reinhardtii tek bir örnekten eşzamanlı ekstraksiyon için sağlam bir yüksek verimlilik ekstraksiyon yöntemi burada sunulmaktadır. Resimli deneysel kurulum Chlamydomonas kültürler için 12 h/12 h ışık/karanlık koşullar kullanılarak senkronize etmektir. Numuneler, çeşitli analitik platformlar kullanılarak elde edilen metabolitlerin, lipidlerin ve nişasta verilerinin iyi şekilde uyumlu olduğunu göstermek için 24 saat hücre döngüsü üzerinden toplanır. Ayrıca, aynı ekstraksiyon protokolü kullanılarak toplanan protein örnekleri, kalitesini ve yeniden üretilebilirliği değerlendirmek için ayrıntılı proteomik analiz yapmak için kullanılmıştır. Verilere dayanarak, bu resimli yöntemin çeşitli biyokimyasal yollar ve fonksiyonları hem temel hem de uygulamalı araştırma için daha fazla güven ile önceden anlamak için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar anlaşılabilirdir.
Introduction
Mikroalgler doğal ürünlerin zengin bir kaynağıdır (örneğin, yakıtlar, insan ve hayvan beslenme, kozmetik ve farmakolojik maddeler). Yüksek değerli ürünlerin üretiminin verimliliğini arttırmak için çok sayıda araştırma çalışmaları yapılır1,2,3,4. Sistem düzeyinde metabolizma anlayışı, kalite ve doğal ürünler5,6,7verim geliştirmek için bir ön şart. Fonksiyonel genomik tekniklerin ve geliştirilmiş Kütle Spektrometrisi yöntemlerinin gelişmesiyle birlikte, binlerce gen, transkripti, protein ve metabolitler aynı anda izlenebilir. Ancak, özellikle zaman kursu çalışmaları gerçekleştirildiğinde, genellikle tek hücreli organizmalarda ulaşmak zor olan derinlemesine proteomikler, lipidomics ve metabolomikler çalışmaları için birden fazla numune gereklidir. Ayrıca, son derece karmaşık omik verilerini (yani, proteomik, lipidomik ve metabolomics) toplamak için farklı örnek plakaya çeşitli protokollerle birlikte toplama ve işlenmesi, böylece veri entegrasyonu yapma, varyasyon tanıttı zorlu bir görev.
Chlamydomonas hücresel süreçlerin incelenmesi için sadece mükemmel bir mikrobiyal sistem değil, aynı zamanda hücre döngüsü ve metabolizma koordinasyonunu incelemek için uygun bir model sağlar. Buna göre, hücre döngüsü ile transkriptler ifade güçlü bir koordinasyon Chlamydomonas8senkronize kültürün yüksek çözünürlüklü transkriptom profil kullanılarak gösterilmiştir. Yaklaşık 80% analiz edilen transkriptler 24 saat hücre döngüsü8üzerinde sağlam periodicity sergiledi. Aynı şekilde, Kuru ağırlık, proteinler, klorofil, amino asitler ve Chlamydomonas iki farklı suşlarının yağ asitleri örnekleme her 4 h9gerçekleştirilen bir çalışmada hücre bölünmesi ile ilişkilendirmek için gösterildi. Son zamanlarda, hücre döngüsünün belirli aşamalarına dayalı hücre vardiyasının metaboliti ve lipid dinamiklerinin10olduğunu bildirdi. Farklı biyomoleküllerin içindeki ince değişiklikler güçlü bir metil tert-butil eter (MTBE) kullanarak izlemek mümkün oldu: metanol: su bazlı ekstraksiyon yöntemi, kapsamlı Multi-omics analizi için ideal bir başlangıç noktası sunuyor10 , 11' den itibaren.
Bir tekrarlanabilir ve verimli strateji ile sunulan protokol kılavuzları10, lipidler eşzamanlı ekstraksiyon için, metabolitler, tek bir örnek aliquot gelen nişasta, zaman için metabolomik ve lipidomic çalışma çözüldü eşzamanlı büyüyen Chlamydomonas kültürler. Güçlü ve tekrarlanabilir metabolik ve lipidomik verileri göstermenin yanı sıra10, burada, aynı Pelet elde edilen proteomik numunelerin kalitesi de gösterilmiştir.
Protocol
1. Chlamydomonas reinhardtii öncesi kültürleri
- Chlamydomonas reinhardtii (strain WILD tipi CC-1690 MT +) ' nın ön KÜLTÜRLERINI, dokunun orta olan katı plakalardan, 200 ml HSM orta12ile Erlenmeyer flsorları arasında aktararak hazırlayın.
- 100 μmoles 'de 24 °C ' de döner çalkalayıcı üzerinde kültürlerin artmasını yapın · m-2· s-1 hücre yoğunluğu ~ 2 x 106 hücreler/ml ulaştığında sürekli ışık.
2. Chlamydomonas sıvı kültürlerin fermentörlerde senkronizasyonu
Not: sıcaklık, ışık ve CO2gibi bu protokolde sunulan parametreler, CC-1690 MT + gerilimin eşitlenmesine özeldir. Başka bir gerinim kullanarak senkronize bir kültür geliştirmek için, optimum koşulları test etmek gereklidir.
- Ön kültürü bir Fermentör sistemine aktarın (özel yapılmış Fermentör tasarımı için Tamamlayıcı Şekil 1 ' e bakın), sıcaklığını korumak için bir geri dönüşümle soğutulmaya bağlı, filtrelenmiş Co2 (% 2, v/v) köpürme ile ve bir sürekli ajitasyon ile Fermentör altındaki manyetik karıştırın çubuğu.
- Senkronizasyon başlatmak için, 12:12 h, 34 °c ve 200 μmoles · m-2· s-1 ışık altında hafif-karanlık rejiminde Fermentör ayarlayın ve 1 x 106 hücreler/ml hücre yoğunluğuna sahip HSM ortamı içinde 500 ml kültür içerdiğinden emin olun.
- 24 saat döngüsünün sonunda, ilk kültür ayrı bir miktar pompa ve daha sonra pompa sağlar Peristaltik pompalar ile birlikte bir tüp sistemi kullanarak minimal pertürasyon ile taze HSM orta ile 1 x 106 hücreler/ml kültür yeniden seyreltme Otoklav Sterilized orta.
Not: peristaltik pompaları için alternatif olarak, Birmanya şırıngalar kültürü geri çekmek için kullanılabilir, taze orta gerekli hacim doğrudan Steril koşullar altında Fermentör eklenebilir iken. - Eşitlenmiş kültürler elde etmek için üç kez adım 2,3 yineleyin 4inci gün inoculation.
- Hücrelerin senkronize doğrulamak için, her 2 saat aralığında hasat örnekleri ve hücre yoğunluğu ve hücre hacmi bir hücre sayacı ve boyut analizörü kullanarak ölçmek (bkz. malzeme tablosu). Hücre yoğunluğuna bağlı olarak, 1:10 ile 1:100 arasındaki numuneleri Seyreltebilir ve 30 – 1900 μm3büyüklüğünde bir boyutta ölçülür.
3. Chlamydomonas hücrelerini toplama
- Etiket 15 mL konik Santrifüjlü tüpler ve sıvı azot dolu bir Dewar hazırlayın.
- Fermin iç cam tüpü ile bir şırınga (50 cm3) kullanarak hasat örnekleri. Numuneyi 10-15 x 106 hücre içermesi gereken konik Santrifüjlü tüplere dağıtın. Her tüp için aktarılan birim Not ve hücre yoğunluğu ve hücre sayacı ve boyut analizörü kullanarak her zaman noktasının hücre boyutunu ölçmek (bkz . malzeme tablosu)
- 4000 x g'de 5 dakika santrifüjleme ile hücreleri Pellet. Sonra supernatant atın, sıvı azot ve daha sonra mağaza içinde Pellet dondurmak-80 °C.
4. ekstraksiyon tamponları ve ekstraksiyon Chlorophyll, lipidler ve metabolitler hazırlanması
DIKKAT: metanol (MeOH) ve MTBE yanıcı ve solunum yolu, göz veya cilt uzun süreli pozlama ve/veya temas tahriş neden olabilir. Lütfen onları dikkatle sadece bir duman kaputu içinde ele ve ekstraksiyon sırasında uygun güvenlik prosedürleri kullanın (Laboratuvar ceket, güvenlik gözlükleri, eldiven, vb.).
-
Çıkarma tamponu 1
- Bir 100 mL Volumetrik Flask, 75 mL MTBE, 25 mL MeOH (UHPLC Grade) ve homojenize (3:1, Vol/Vol) ekleyin.
- Aşağıdaki iç standartlar çözümü ekleyin: 50 μL kortikoone (1 mg/ml MeOH), 50 μL 1, 2-diheptadecanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (17:0 PC) (1 mg/ml kloroform HPLC Grade), 25 μL ampisilin (1 mg/ml su UHPLC sınıfı) ve 50 μL D-Sorbitol-1-13C (1 mg/mL su UHPLC sınıfı).
- Ekstraksiyon tamponunu temiz bir cam şişeye aktarın ve solüsyonu-20 °C ' de önceden soğutur, kullanmadan önce 1 saat. Ayıklamalar için taze hazırlanmış bir çözüm kullanın. Bu çözüm 2 haftaya kadar 4 °C ' de depolanabilir.
-
Çıkarma tamponu 2
- Bir 100 mL Volumetrik Flask, 75 mL su UHPLC sınıf ve 25 mL MeOH UHPLC sınıf ve homojenize ekleyin.
- Ekstraksiyon tamponunu temiz bir cam şişeye aktarın. Ayıklamalar için taze çözüm kullanın. Bu çözüm birkaç hafta oda sıcaklığında saklanabilir.
5. klorofil, lipidler ve metabolitlerin çıkarılması
- Borular, hücre Pelet (10-15 x 106 hücre içeren), sıvı nitrojen ile düzenleyin.
- 1 mL ön soğutmalı (-20 °C) ekstraksiyon tamponu ile her tüpteki hücre pelsini yeniden resuspend 1.
Not: düşük viskozite ekstraksiyon tamponunun buharlaştırma Işlemini önlemek için bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin. Extraction buffer 1 ' i ekledikten sonra, tüpleri oda sıcaklığında koruyun. - Hücreler ekstraksiyon karışımı içinde homojenize olana kadar Vortex ve 2 ml mikrosantrifüj tüpüne karışımı kısım.
- Sonication banyosu kullanarak kültürler sonikat ( malzeme tablosunabakın) buz soğutmalı suda 10 dakika.
- 4 °C ' de 60 dk için 1000 rpm 'de orbital Shaker üzerindeki tüm numuneleri inküd.
- Faz ayrımı yapmak için ekleme 650 μL ekstraksiyon tampon 2.
- Vortex kısaca 4 °C ' de 5 dak için 20000 x g 'de santrifüjleme ile izlenir.
Not: Bu adımdan sonra, tüpün altındaki sıvı fazları ve katı bir Pelet ayrımı vardır. İki sıvı fazların karıştırılmasını önlemek için tüpleri dikkatli bir şekilde ele almak. Üst MTBE-faz lipidler ve klorofil içerir, alt faz Polar ve yarı-Polar metabolitleri içerir iken. Altta bulunan çökelmiş Pelet, proteinler, nişasta ve diğer çözünmez molekülleri içerir.
6. kesirleri aliquoting
- Transfer 500 μL üst MTBE faz (lipidler) etiketli bir 1,5 mL tüp içine. Numuneleri bir vakum konsantratörü kullanarak kurutun (bkz. malzeme tablosu) ve ölçüm kadar-80 °c ' de saklayın.
- 200 μL pipet kullanarak kalan MTBE-fazı çıkarın.
- Transfer 650 μL alt faz (kutup ve yarı Polar metabolitler) yeni bir etiketli tüp. Numuneleri bir vakum konsantratörü kullanarak kurutun (bkz. malzeme tablosu) ve ölçüm kadar-80 °c ' de saklayın.
- Aşırı hacminin pipetleme tarafından kalan alt faz çıkarın.
- Sıvı nitrojen içinde Katı Pelet dondurmak ve mağaza-80 °c daha fazla ekstraksiyon kadar.
7. Polar metabolitlerin belirlenmesi (primer metabolitler)
- Karbonil gruplarının methoxymization için methoxyamine-hidroklorür/pyridine çözeltisi içinde Polar faz (adım 6,3) kurutulmuş Pelet resuspend.
- 37 °C ' de örnekleri 90 dk. ısı ile ısıtın.
- Daha önce13olarak açıklandığı gibi 37 °c ' de 30 dakika boyunca n-metil-n-trimethylsilyltrifloracetamid (mstfa) örnekleri derivatize.
- Primer metabolitleri analiz etmek için uçuş süresi kitle spektrometresi (GC-TOF-MS) ile birlikte gaz kromatografi kullanın. Kullanılan degrade parametreleri önceden açıklanan protokol14' e göre yapıldı.
8. Polar olmayan metabolitlerin belirlenmesi (lipidler)
- Asetonitril karışımı olarak (adım 6,1) Polar olmayan faz kurutulmuş Pelet yeniden askıya: isopropanol (7:3, v:v).
- 20000 x g 'de santrifüjler ve bir ters faz C8 sütununda (100 mm × 2.1 mm × 1.7 μm parçacıklar), BIR UPLC sistemi kullanarak (bkz. malzeme tablosu). İki mobil faz 1% 1 M amonyum asetat, 0,1% asetik asit (tampon A), ve Asetonitril: Isopropanol (7:3) 1% 1 M amonyum asetat,% 0,1 asetik asit (tampon B) içeren su vardı.
- Degrade parametrelerini önceden açıklanan protokol14' e göre kullanın.
9. klorofil içeriğinin belirlenmesi
- Mix 100 MTBE-faz μL (adım 6,1) ile 900 μL, bir yöntem için% 90 metanol ve deneysel numunelerin yanı sıra boş.
- 665 nm ve 652 nm dalga boyu spektrofotometre kullanarak emilme ölçmek klorofil a ve klorofil b ayırt etmek .
Not: emilim, geçerli konsantrasyon hesaplaması için 0,1 ile 1 arasında değişir. Gerekirse numuneleri seyreltin. - Aşağıdaki formüllere göre klorofil a ve b içeriğini ve aynı zamanda toplam klorofil içeriğini hesaplayın.
CHLa = 16.82 a665 – 9.28 a652
CHLb = 36.92 a652 – 16.54 a665
CHLa = b = 0.28 a665 + 27.64 a652
Not: formüller Bar-nun ve Ohad15tarafından tanımlanmıştır.
10. protein içeriğinin ekstraksiyon ve belirlenmesi, sindirim ve analiz
Not: proteinin pelletini için, Pelet Urea/Thiourea tampon (6 m Urea, 2 m thioureaand proteaz ve fosfataz inhibitörleri) daha önce açıklanan protokolde değişiklikler ile kullanıldı16. Ancak, herhangi bir tampon seçim proteinleri Resuspension için kullanılabilir.
- Protein tamponunu aşağıdaki konsantrasyonları kullanarak hazırlayın: 6 m üre ve 2 m Thiourea.
- 200 μL protein tampon (10,1) içinde Pelet (adım 6,5) çözülür.
- Numuneleri 30 dakika boyunca oda sıcaklığında, 20000 x g 'de ise 5 dakika santrifüjleme ile inkübasyon yapın.
- Proteinleri içeren süpernatant 'ı yeni bir tüpe aktarın.
- Bradford tahlil tarafından protein konsantrasyonu belirlemek17.
- Özet 50 μg protein içinde-solüsyon ile bir seçenek seçeneği. Burada, aşağıdaki protokolü kullanın.
- 5 mM DTT kullanarak 30 dakika boyunca 10 mM iodoacetamid ile 30 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında% 50 μg protein örneğini azaltın.
- Bir 25:1 protein: proteaz oranı (w/w) Trypsin/LYS-C Mix ekleyin, mix ve 37 °C ' de 3 h için inkük.
- 50 mM TrisHCl (pH 8) kullanarak altı kıvrım numuneleri seyreltir ve 37 °C ' de gecede Inküye yapın.
- Trifluoasetik asit ekleyerek sindirimi sonlandırmak (TFA) son konsantrasyon için 0,5 – 1%.
- Sindirim sonra, kitle spektrometresi önce C18 aşama ipuçları ve sindirilmiş peptitler elute kullanarak peptitler Petrolün tuzsuzlaşması gerçekleştirmek18.
- Numuneleri, vakum Konsantratöründe (bkz. malzeme tablosu) ısıtma olmadan 2-5 μL çözüm bırakarak, yakın kuruluk için konsantre.
- Yükleme arabelleği (% 5 acetonitrile, 0,5% formik asit) numunelerini resuspend ve LC-MS/MS ile peptid karışımlarının bir nano-UPLC sistemine bağlı yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (bkz. malzeme tablosu) kullanarak analiz edin.
- 75 μm bir iç çapı ve 1,7 μm bir parçacık boyutu ile 20 cm ters faz şarj edilmiş yüzey melez (CSH) sütun (bkz. malzeme tablosu) üzerinde UPLC sistemi (bkz. malzeme tablosu) kullanarak peptidler ayırın.
- 4 μL örnek yükleyin ve 300 nL/dak akış hızında 90 dk gradyan ile çalıştırın.
- Gradyan ayarlayın. Tampon B (99,9% Asetonitril + 0,1% formik asit)% 3 ' ünde izokrat gradyan kümesi ile kısmi döngü çevrimdışı ayarlarını kullanın, döngü sütun ile çevrimiçi pozisyona kaymadan önce 14 dakika boyunca tutulan, sonra degrade için doğrusal olarak artmıştır 50 dk, kadar 20% B arabelleğine ulaşıldı.
- Sonraki 15 dakika içinde,% 30 tampon B konsantrasyonu artırın. Daha sonra aşağıdaki 15 dakika içinde,% 40 için tampon B 'yi% 90 ' e ulaşmadan önce 4 dk. sonra tampon B 'ye ulaşmak için dört dakika. sütun temizlemek için gerekli olan yıkama adımını gerçekleştirin, 400 nL/dak 'da ve ek 10 dakika tutun (ayrıntılı degrade için Tablo 1 ' e bakın) koşulları).
- Son olarak, sistemi 300 nL/min akış hızına ve 1 dk içinde% 3 tampon B konsantrasyonuna geri ayarlayın. sonraki örnek enjekte edildikten önce 15 dakika için sütunu Equilibrate.
Not: LCMS/MS analizinden sonra tanımlanan proteinlerin tam listesi Tablo 2' de sunulmuştur.
11. nişasta içeriğinin çıkarılması ve belirlenmesi
Not: Toplam protein ve nişasta içeriğinin belirlenmesi için, katı Pelet daha önce açıklandığı gibi iki adımlı bir işlemde çıkarıldı10.
- 80% (v/v) etanol 500 μL hücre Pelet (adım 6,5) ekleyin ve 10 dk için 80 °c ' de inkübe.
- Oda sıcaklığında 10 dakika 4000 x g Santrifüjü. Sonra 250 μL steril su içinde Pelet çözülür ve 250 μL 100 mm sodyum asetat ilavesi ile takip edilir.
- 99 °C ' de 3 saat Isıtma ile nişasta hydrolyze. Α-amilaz (numune başına 4,2 adet) ve α-amyloglucosidase (örnek başına 10 adet) enzim karışımı ekleyerek, bir gecede glukoz monomerine çözünmüş nişasta sindirin. Bir gecede 37 °C ' de tüpleri kulküat.
Not: kuluçtan sonra, örnekler glikoz ölçümlerinden önce, birkaç gün için-20 °C veya birkaç ay-80 °C ' de dondurulabilir. - Santrifüjün sindirilmiş ekstresi 20000 x g 5 dakika ve supernatant toplamak. 5 mM MgCl2, 60 mg/ml ATP, 36 mg/ml NADP ve glikoz-6-fosfat-dehidrogenaz (örnek başına 1 adet) Içeren 100 mm HEPES-tampon (pH 7) içinde süpernatant (nişasta türeyen glikoz monomerlerle) çözülür.
- Nişasta içeriğini analiz etmek için, ilk 340 Nm 'de temel emici ölçmek. Sonra reaksiyonu başlatmak için hekzokinaz (örnek başına 1 adet) ekleyin. Son olarak (glikoz sindirilmiş nişasta seviyesini belirten) NADPH + H+ artış ölçmek 340 bir 96-Well plaka okuyucu ile Nm.
Not: 340 Nm 'de maksimum değerin farkı (doğrusal aralığı 1 ' i aşmamalıdır) ve taban çizgisi sindirilmiş nişasta glikoz konsantrasyonuna eşdeğerdir. Bir glikoz eğrisi mL başına glikoz nmol glikoz konsantrasyonu belirlemek için yapılmalıdır.
Representative Results
Coşkun yavuz CC-1690 kültür eşitlemesi
Belirli bir protokol için temsili sonuçları göstermek için, numune toplama ve ekstraksiyon Chlamydomonas reinhardtii kültürler10dan sonra elde edilen örnek Multi-omics veri sunuyoruz. Chlamydomonas 'ın senkronize kültürleri, belirli bir zaman noktasında Tekdüzen büyüme aşamasına ait hücrelerden oluşur. Chlamydomonas kültürlerinin 12 h/12 h ışık/karanlık döngüsünde senkronize edildi, 34 °C ışık yoğunluğu ile 200 μmol · m-2· s-1 ve Co2 konsantrasyonu OF2%, v/v, en iyi konsantrasyon olarak tanımlanan gerilim CC-1690 MT +10 . Bu koşullar daha önce optimize edilmiş ve çeşitli hücre döngüsü parametreleri10kullanılarak doğrulandı. Şekil 1 senkronize kültürler farklı zaman noktalarında Coulter Counter ile ölçülen hücre boyutu dağılımı görüntüler. Hücreler ışık aşaması boyunca boyutu büyümek gibi hücre hacminde bir vardiya görülebilir, 10 h ışık aşaması sonunda başlayan kız hücrelerinin serbest bırakılması tarafından takip. Tüm kız hücreleri serbest bırakıldığında, yeni yayımlanan kız hücreleri bir sonraki döngüye 10 (Şekil 1) başlamak için atıldığından hücre hacminde vardiya gözlemlenebilir.
Numune toplama, işleme ve çıkarma
Numune hızlı hasat santrifüjleme kullanılarak gerçekleştirilir ve supernatant atarak sonra, Pelet saklanabilir-80 °C ekstraksiyon kadar. Yukarıda açıklandığı gibi (adım 5), MTBE ekstraksiyon sonuçları üç ayrı aşamada: a) Organik faz lipidlerin yanı sıra klorofil seviyeleri ölçmek için kullanılan (normalleştirme faktörü), b) Polar faz GCMS üzerinde metabolitleri ölçmek için toplandı iken, c) Pelet kullanıldı Nişasta içeriği ve proteinleri ölçmek için. Farklı aşamaların dağılımına genel bakış ve onların istihdam Şekil 2' de gösterilmiştir.
Polar ve Polar olmayan metabolitler
Polar fraksiyonunun GCMS analizine dayanarak, 65 metabolitleri, amino asitler, nüklik asitler, glikoliz, glukoneogenez, tricarboksilik asit döngüsü, pentoz fosfat yolu ve polyaminler (Şekil 3A) kapsayan detaylandırıldı. Lipidler içeren nötr faz LCMS Analizi çeşitli lipid sınıfları yani fosfatidilgliserler, fosfatidiltenolin, sulfoquinovosyl diacylgliserin kapsayan 204 farklı lipid türlerinin tanımlanması için yol açtı, monogalactosyldiacylgliserler, digalactosyldiacylgliserler, diacylglisiltrimetilhomoserin, yağ asitleri, diacylgliserin ve triacylglisenitler. Hücre döngüsü boyunca metabolitlerin ve lipidlerin küresel vardiyalarını görselleştirmek için, asıl bileşen analizi (PCA) kullanılmıştır. PCA, hem metabolomikler hem de lipidomik veriler için hafif ve koyu faz ayrımı gösterir. Dahası, yarı döngüsel (kısmen açık daire) her iki veri için de fark edilebilir (Şekil 3c, D). Dairesel desendeki kısmi boşluk, hücre döngüsünün 24 h 'deki örneklerin, ışık maruz kaldıktan sonra 0,25 h sonra hücre döngüsünün başlangıcında toplanan örneklerin aksine karanlık altında toplanma gerçeğini atfedilir (Şekil 3c , D).
Protein ve nişasta Analizi
MTBE ekstraksiyon sonucunda elde edilen protein peleminin kalitesini incelemek için proteomik analiz için 6 numune kullanılmıştır. 50 μg protein/numune sindirerek elde edilen proteomik verilerin kalitesi, Hesaplamalı kalite kontrol aracı kullanılarak incelendi-proteomik kalite kontrolü (PTXQC)19, yeniden üretilebilen ve yüksek kalitede proteomik veri elde edilen Tüm çoğaltır (Tamamlayıcı Şekil 1). Proteinlerin moleküler fonksiyonel kapsamı REVIGO20kullanılarak incelendi. 2463 tanımlanan proteinlerin fonksiyonel zenginleştirme genel bir bakış (bkz: Tablo 2), Şekil 4Asunulmaktadır. Protein ekstraksiyonu sonrasında kalan Pelet, çeşitli çoğaltır (Şekil 4b) arasında düşük standart sapma ile belirtildiği gibi nişasta tekrarlanabilir kantifikasyon için kullanılmıştır.
Şekil 1: Chlamydomonas reinhardtii'de hücre döngüsünün farklı aşamalarında hücre birimindeki değişikliklerin açıklayıcı örneği. Hücre numarasını temsil eden y ekseni sırasında hücre birimini temsil eden x ekseni. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Multi-omics ekstraksiyon hücre peletler sırasında farklı aşamaları istihdam Için resimli iş akışı. Rakam Juppner, J.et al yeniden kullanılmıştır. 10. lütfen buraya tıklayın Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için.
Şekil 3: açıklanan protokol kullanılarak tanımlanan metabolitlerin ve lipidlerin temsili örneği. (A) GCMS analizi ile tanımlanan metabolite sınıfları. (B) LCMS analizi ile tanımlanan farklı sınıflara ait lipid türleri. (C) 24 saat hücre döngüsü boyunca metabolit düzeylerinin ilke bileşen analizi. (D) 24 saat hücre döngüsü boyunca lipidlerin ilke bileşeni analizi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: protein ve nişasta verilerinin temsili örneği. A) LCMS analizi kullanılarak tanımlanan Proteinlerin moleküler fonksiyonel zenginleşmesi, REVIGO 20 B kullanılarak çizilmiş treemap) protokolün yeniden üretilebilirliği gösteren nişasta verileri temsili. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 1: Chlamydomonas kültürlerinin sıcaklık ve havalandırması kontrollü senkron büyüme için Fermentör sisteminin özelleştirilmiş tasarımı. Rakam Juppner, J.et al yeniden kullanılmıştır. 10. bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 2: proteomik veri kalitesi Için temsilci sonucu. Heatmap Hesaplamalı PTXQC aracı kullanarak çizilen19. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
| Zaman (dak) | Buffer A arabellek B | |
| 0 ila 15 dk | Doğrusal gradyan 0 to3% | Tampon A:% 0,1 UPLC sınıfı suda formik asit |
| 15 ila 75 dk | % 3 ' ten% 30 ' a kadar doğrusal degrade | Tampon B: 0,1% 60 UPLC dereceli Asetonitril içinde% formik asit |
| 75 ila 90 dk | % 30 ' dan% 40 ' e kadar doğrusal degrade | Akış hızı 300 nL/min |
| 90 ila 94 dk | Doğrusal gradyan 40% ila 90% | Enjeksiyon hacmi 4 μL |
| 94 to104 dak. | % 90 ile yıkama sütunu | |
| 105 ila 120 dk | Sütunu% 3 ' ü 15 dakika dengelentir |
Tablo 1: peptit numunelerinin sıvı kromatografi, gradyan parametreleri.
Tablo 2: LCMS/MS analizinden sonra tanımlanan proteinlerin listesi. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu yazıda, 10-15 x 106 hücreli tek bir pelemden kapsamlı lipidomics, metabolomics, nişasta ve proteomik analizi için sağlam ve son derece uygulanabilir bir ekstraksiyon Protokolü tasvir ettik. Yöntem, geniş bir yelpazede hücreler ve dokular için çeşitli çalışmalarda başarıyla uygulandı10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Burada, Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 MT +) kültüründen hasat edilen tek bir örnekten farklı biyomoleküllerin çok omics analizi için aşamalı bir boru hattı sundu.
Protokol, çeşitli biomolecules analizi için aynı anda birden fazla numune işlemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar. Ancak, kritik adımlar bir dizi teknik varyasyonu en aza indirmek için bakımı alınmalıdır. İlk olarak, hücrelerin biyolojik durumunu korumak için tüm hasat edilen numuneler için üniforma koşullarını korurken hücrelerdeki hasat mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Hücreleri hasat etmek için santrifüjleme kullanılsa da, numunelerin hasat edilmesi için alternatif hasat stratejileri kullanılabilir. Ancak, farklı hasat stratejileri hücrelerin metabolik durumunu etkileyen bilinen dikkat etmek önemlidir37 bu nedenle, tutarlı hasat yaklaşımı tüm deneysel örnekler için kullanılmalıdır. İkincisi, bu numuneler için normalleştirme faktörü etkileyen solvent çözünmüş klorofil seviyelerini etkileyebilir çünkü, klorofil içeren üst olmayan kutupsal faz kurutulması önlemek önemlidir. Son olarak, protein ve nişasta peletini elde etmek için kalan kutup fazı kaldırılırken bakım alınmalıdır, nişasta ve protein içeriğini etkileyebilecek Pelet rahatsız önlemek için.
Böylece sunulan ayıklama Protokolü birden fazla omics veri analizi için çeşitli faydalar sunar. Gerekli örnek plakaya sayısını minimize yanı sıra, aynı zamanda farklı biomolecules için elde analitik sonuçlar arasındaki varyasyonu azaltır. Bu, primer metabolitlerin, lipidlerin ve proteomik verilerden elde edilen sonuçların doğrudan karşılaştırılmasını sağlar. Benzer şekilde, birden çok bileşik sınıfın eşzamanlı ayıklama farklı veri kümeleri tutarlı ve Tekdüzen normalleştirme stratejisini sağlar. Normalleştirme kuru veya taze ağırlık38 veya hücre numarası kullanarak elde etmek zor ise bu özellikle geçerlidir.
Protokol, kompleks biyolojik numunenin rutin taraması için uygulanabilir. Bu bütünsel metabolomik, lipidomik ve proteomik veri setleri metabolizmada sistematik değişiklikler hakkında kapsamlı bilgiler sunabilir. Ayrıca, proteomik analizinden elde edilen veriler, metabolitler ile ilgili olarak proteinlerde niceliksel (bolluk) ve nitel (Modifikasyon) değişikliklerine ilişkin öngörüler sağlar. Bu nedenle, omik veri entegre bir biyolojik sistemin genetik veya biyotik ve/veya abiyotik perturbations tarafından indüklenen değişiklikler hakkında derinlemesine bilgi ortaya olabilir. Bu nedenle, spesifik metabolik yolların veya hücresel süreçlerin moleküler değişikliklerinin aydınlatılmasına. Benzer şekilde, bu yüksek verimlilik verileri, metabolik Mühendislik için hedeflerin tanımlanmasına izin verebilir ve genom ölçekli metabolik modeller37,39' den tahminler iyileştirebilir veya test edilir.
Disclosures
Yazarların açıklamaları yok.
Acknowledgments
Mükemmel teknik yardım için Gudrun Wolter ve Änne Michaelis 'e çok minnettarız. Biz onların yardımı için Giavalisco laboratuvarının tüm üyelerine teşekkür etmek istiyoruz. L A Giraldi 'nin kardeşliği için araştırma ve FAPESP finansmanı için Max Planck Derneği 'ne minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Equipment | |||
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
| Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |
References
- Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).
- Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
- Pulz, O., Gross, W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).
- Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).
- Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).
- Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7, 518 (2011).
- Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5 (2011).
- Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation. Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).
- Willamme, R., et al. Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions. Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).
- Juppner, J., et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Harris, E. H. 1, Elsevier. 248-249 (2009).
- Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).
- Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Bar-Nun, S., Ohad, I. [34] Chloroplast membrane polypeptides. Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics. Proteomics. 17 (3-4), 1600159 (2017).
- Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PloS one. 6 (7), e21800 (2011).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. Frontiers in Plant Science. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nature Communications. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).
- Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae. Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).
- Allwood, J. W., et al. Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics. Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
