Summary
Die systemweite Analyse mehrerer Biomoleküle ist entscheidend, um funktionelle und mechanistische Einblicke in biologische Prozesse zu gewinnen. Dabei wird ein umfangreiches Protokoll zur Hochdurchsatzextraktion von Lipiden, Metaboliten, Proteinen und Stärke aus einer einzigen Probe beschrieben, die aus synchronisierter Chlamydomonas-Kultur geerntet wird.
Abstract
Mikroalgen standen im Fokus der Forschung für ihre Anwendungen in der Herstellung von hochwertigen Verbindungen, Lebensmitteln und Brennstoffen. Darüber hinaus sind sie wertvolle photosynthetische Modelle, die das Verständnis der grundlegenden zellulären Prozesse erleichtern. Systemweite Studien ermöglichen ein umfassendes und vertieftes Verständnis der molekularen Funktionen der Organismen. Für Proteomik-, Lipidomik- und Metabolomik-Studien, die höhere Fehler und Variabilität enden, sind jedoch mehrere unabhängige Proben und Protokolle erforderlich. Hier wird eine robuste Hochdurchsatzextraktionsmethode zur gleichzeitigen Extraktion von Chlorophyll, Lipiden, Metaboliten, Proteinen und Stärke aus einer einzigen Probe der grünen Alge Chlamydomonas reinhardtii vorgestellt. Das illustrierte Versuchsaufbau ist für Chlamydomonas Kulturen synchronisiert unter 12 h/12 h Licht/Dunkel-Bedingungen. Die Proben wurden über einen 24-stunden-Zellzyklus gesammelt, um zu zeigen, dass die metaboliten, Lipide und Stärkedaten, die mit verschiedenen Analyseplattformen gewonnen wurden, gut konform sind. Darüber hinaus wurden Proteinproben, die mit demselben Extraktionsprotokoll gesammelt wurden, verwendet, um detaillierte Proteomikanalysen durchzuführen, um ihre Qualität und Reproduzierbarkeit zu bewerten. Auf der Grundlage der Daten lässt sich daraus schließen, dass die illustrierte Methode einen robusten und reproduzierbaren Ansatz bietet, um das Verständnis verschiedener biochemischer Pfade und ihrer Funktionen mit größerer Sicherheit sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die angewandte Forschung zu fördern.
Introduction
Mikroalgen sind eine reiche Quelle für natürliche Produkte (z. B. Kraftstoffe, Menschliche und tierische Ernährung, Kosmetika und pharmakologische Substanzen). Zahlreiche Forschungsanstrengungen werden durchgeführt, um die Effizienz der Produktion von hochwertigen Produkten aus Mikroalgen1,2,3,4zu verbessern. Das Verständnis des Stoffwechsels auf Systemebene ist eine Voraussetzung, um die Qualität und den Ertrag natürlicher Produkte zu verbessern5,6,7. Mit dem Aufkommen funktioneller genomischer Techniken und verbesserter Massenspektrometriemethoden können Tausende von Genen, Transkripten, Proteinen und Metaboliten gleichzeitig überwacht werden. Für eingehende Proteomik-, Lipidomik- und Metabolomik-Studien sind jedoch mehrere Proben erforderlich, die bei einzelligen Organismen oft nur schwer zu erreichen sind, insbesondere wenn Zeitverlaufsstudien durchgeführt werden sollen. Darüber hinaus führt die Sammlung und Verarbeitung verschiedener Proben-Aliquots in Kombination mit verschiedenen Protokollen zur Erfassung der hochkomplexen Omics-Daten (d. h. proteomisch, lipidomisch und metabolomik) zu Variabilität ein und macht die Integration von Daten zu einem herausfordernde Aufgabe.
Chlamydomonas bietet nicht nur ein ausgezeichnetes mikrobielles System für die Untersuchung zellulärer Prozesse, sondern auch ein praktisches Modell, um die Koordination von Zellzyklus und Stoffwechsel zu untersuchen. Dementsprechend wurde eine starke Koordination der Transkripte Expression mit Zellzyklus gezeigt, mit hochauflösenden Transkriptom Profiling der synchronisierten Kultur von Chlamydomonas8. Ungefähr 80% der analysierten Transkripte wiesen eine robuste Periodizität über einen 24 h Zellzyklus8auf. Ebenso wurden Trockengewicht, Proteine, Chlorophyll, Aminosäuren und Fettsäuren von zwei verschiedenen Stämmen von Chlamydomonas gezeigt, dass sie mit der Zellteilung in einer Studie korrelieren, in der alle 4 h9eine Probenahme durchgeführt wurde. Kürzlich wurde berichtet, dass der Metabolit und die Lipiddynamik der Zellverschiebung basierend auf bestimmten Phasen des Zellzyklus10. Die subtilen Veränderungen in verschiedenen Biomolekülen konnten mit einem robusten Methyltert-Butyher (MTBE) überwacht werden: Methanol: wasserbasierte Extraktionsmethode, die einen idealen Ausgangspunkt für eine umfassende Multiomics-Analyse bietet10 , 11.
Das vorgestellte Protokoll führt durch eine reproduzierbare und effiziente Strategie10, für die gleichzeitige Extraktion von Lipiden, Metaboliten, Proteinen und Stärke aus einer einzigen Probe aliquot, für die Zeit gelöst emetonomisch und lipidomic Studie von synchron wachsende Chlamydomonas-Kulturen. Neben der Veranschaulichung der robusten und reproduzierbaren metabolischen und lipidomischen Daten10wird hier auch die Qualität der aus dem gleichen Pellet gewonnenen proteomischen Proben nachgewiesen.
Protocol
1. Vorkulturen von Chlamydomonas reinhardtii
- Bereiten Sie die Vorkulturen von Chlamydomonas reinhardtii (Stamm wild Typ CC-1690 mt+) durch Übertragung von Zellen von festen Platten von TAP Medium auf Erlenmeyer Kolben mit 200 ml HSM medium12.
- Wachsen Sie die Vorkulturen auf einem rotatorischen Shaker bei 24 °C bei 100 moles-m-2s-1 kontinuierliches Licht, bis die Zelldichte 2 x 106 Zellen/ml erreicht.
2. Synchronisation von Chlamydomonas flüssigen Kulturen in Fermentern
HINWEIS: Die in diesem Protokoll dargestellten Parameter,wie Temperatur, Licht und CO 2, sind spezifisch für die Synchronisation der Dehnung CC-1690 mt+. Um eine synchronisierte Kultur mit einer anderen Sorte zu entwickeln, ist es notwendig, die optimalen Bedingungen zu testen.
- Übertragen Sie die Vorkultur auf ein Fermentersystem (siehe Zusatzabbildung 1 für das kundenspezifische Fermenter-Design), das mit einem Umwälzkühler verbunden ist, um die Temperatur zu halten, mit Sprudelung von gefiltertem CO2 (2%, v/v) und gerührt mit einem magnetische Rührstange an der Unterseite des Fermenters mit ständiger Rührung.
- Um die Synchronisation zu initiieren, stellen Sie den Fermenter auf ein hell-dunkles Regime von 12:12 h, unter 34 °C und 200 moles-m-2s-1 Licht und stellen Sie sicher, dass er 500 ml Kultur in HSM-Medium mit einer Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml enthält.
- Am Ende des 24-Stunden-Zyklus die Kultur auf 1 x 106 Zellen/ml mit frischem HSM-Medium mit minimaler Störung durch Verwendung eines Rohrsystems in Kombination mit peristaltischen Pumpen, die es ermöglichen, zuerst eine deutliche Menge an Kultur auspumpen und anschließend in autoklavsterilisiertes Medium.
HINWEIS: Als Alternative zu peristaltischen Pumpen können Impfspritzen verwendet werden, um die Kultur zurückzuziehen, während das erforderliche Volumen an frischem Medium direkt in den Fermenter unter sterilen Bedingungen hinzugefügt werden kann. - Wiederholen Sie Schritt 2.3 dreimal, um die synchronisierten Kulturen am 4. Tag der Impfung zu erhalten.
- Um die Synchronisierung von Zellen zu validieren, ernten Sie Proben in einem Intervall von jeweils 2 h und messen Sie die Zelldichte und das Zellvolumen mit einem Zellzähler und einem Größenanalysator (siehe Tabelle der Materialien). Je nach Zelldichte die Proben zwischen 1:10 und 1:100 verdünnen und in einem Größenbereich von 30 – 1900 m3messen.
3. Ernte von Chlamydomonas-Zellen
- 15 ml konische Zentrifugenrohre etikettieren und einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Dewar vorbereiten.
- Ernteproben mit einer Spritze (50 cm3) durch das innere Glasrohr des Fermenters. Verteilen Sie die Probe in konische Zentrifugenröhrchen, die 10-15 x 106 Zellen enthalten sollten. Beachten Sie das auf jedes Rohr übertragene Volumen und messen Sie die Zelldichte und die Zellgröße jedes Zeitpunkts mithilfe des Zellzählers und des Größenanalysators (siehe Materialtabelle)
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 4000 x g. Dann den Überstand entsorgen, die Pellets in flüssigem Stickstoff einfrieren und später bei -80 °C lagern.
4. Herstellung von Extraktionspuffern und Extraktionschlorophyll, Lipiden und Metaboliten
VORSICHT: Methanol (MeOH) und MTBE sind entzündlich und können bei längerer Exposition und/oder Kontakt zu Reizungen der Atemwege, des Auges oder der Haut führen. Bitte behandeln Sie sie sorgfältig nur in einer Dunstabzugshaube und verwenden Sie die entsprechenden Sicherheitsverfahren während der Extraktion (Labormantel, Schutzbrille, Handschuhe, etc.).
-
Extraktionspuffer 1
- In einem 100 ml volumetrischen Kolben 75 ml MTBE, 25 ml MeOH (UHPLC-Grade) hinzufügen und homogenisieren (3:1, vol/vol).
- Fügen Sie die folgenden internen Standardlösungen hinzu: 50 l Corticosteron (1 mg/ml in MeOH), 50 l 1,2-Diheptadecanoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholin (17:0 PC) (1 mg/ml in Chlorform HPLC-Grade), 25 l Ampicillin (1 mg/ml in Wasser UHPLC-Grade) und 50 D-Sorbitol-1-13C (1 mg/ml in Wasser UHPLC-Grade).
- Den Extraktionspuffer in eine saubere Glasflasche geben und die Lösung vor Gebrauch bei -20 °C, 1 h vorkühlen. Verwenden Sie frisch zubereitete Lösung für die Extraktionen. Diese Lösung kann bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
-
Extraktionspuffer 2
- In einem 100 ml volumetrischen Kolben 75 ml Wasser UHPLC-Grade und 25 ml MeOH UHPLC-Grade hinzufügen und homogenisieren.
- Übertragen Sie den Extraktionspuffer in eine saubere Glasflasche. Verwenden Sie frische Lösung für die Extraktionen. Diese Lösung kann mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
5. Extraktion von Chlorophyll, Lipiden und Metaboliten
- Ordnen Sie die Rohre mit dem Zellpellet (enthält 10-15 x 106 Zellen) in flüssigem Stickstoff an.
- Setzen Sie das Zellpellet in jedem Rohr mit 1 ml vorgekühltem (-20 °C) Extraktionspuffer 1 wieder auf.
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt schnell aus, um die Verdunstung des Extraktionspuffers mit niedriger Viskosität zu vermeiden. Nach dem Hinzufügen des Extraktionspuffers 1 die Rohre bei Raumtemperatur aufbewahren. - Wirbel, bis die Zellen innerhalb des Extraktionsgemisches gut homogenisiert sind und das Gemisch in 2 ml Mikrozentrifugenrohr ausbilden.
- Beschallen Sie die Kulturen mit Beschallungsbad (siehe Tabelle der Materialien) in eisgekühltem Wasser für 10 min.
- Alle Proben auf einem Orbital-Shaker bei 1000 Umdrehungen pro Minute für 60 min bei 4 °C inkubieren.
- Um die Phasentrennung zu induzieren, fügen Sie 650 L Extraktionspuffer 2 hinzu.
- Vortex kurz gefolgt von Zentrifugation bei 20000 x g für 5 min bei 4 °C.
HINWEIS: Nach diesem Schritt gibt es eine Trennung von flüssigen Phasen und einem festen Pellet im Boden des Rohres. Behandeln Sie die Rohre mit Vorsicht, um eine Vermischung der beiden flüssigen Phasen zu vermeiden. Die obere MTBE-Phase enthält Lipide und Chlorophyll, während die untere Phase die polaren und halbpolaren Metaboliten enthält. Das gefällte Pellet am Boden enthält Proteine, Stärke und andere unlösliche Moleküle.
6. Aliquotierung der Fraktionen
- Übertragen Sie 500 l obere MTBE-Phase (Lipide) in ein markiertes 1,5 ml-Rohr. Trocknen Sie die Proben mit einem Vakuumkonzentrator (siehe Materialtabelle) und lagern Sie sie bis zur Messung bei -80 °C.
- Entfernen Sie die verbleibende MTBE-Phase mit einer 200-L-Pipette.
- Übertragen Sie 650 l der unteren Phase (polare und halbpolare Metaboliten) auf ein neues beschriftetes Rohr. Trocknen Sie die Proben mit einem Vakuumkonzentrator (siehe Materialtabelle) und lagern Sie sie bis zur Messung bei -80 °C.
- Entfernen Sie die verbleibende untere Phase, indem Sie das überschüssige Volumen abpfeifen.
- Einfrieren des festen Pellets in flüssigem Stickstoff und Lagern Bei -80 °C bis zur weiteren Extraktion.
7. Bestimmung polarer Metaboliten (primäre Metaboliten)
- Das getrocknete Pellet der Polarphase (Schritt 6.3) in Methoxyamin-Hydrochlorid/Pyridinlösung zur Methoxymisierung von Carbonylgruppen wieder aufsetzen.
- Erhitzen Sie die Proben bei 37 °C für 90 min.
- Die Proben mit N-Methyl-N-Trimethylsilyltrifloracetamid (MSTFA) 30 min bei 37 °C ableiten, wie zuvorbeschrieben 13.
- Verwenden Sie die Gaschromatographie gekoppelt mit der Zeit-of-Flight-Massenspektrometrie (GC-TOF-MS), um die primären Metaboliten zu analysieren. Die verwendeten Gradientenparameter entsprachen dem zuvor beschriebenen Protokoll14.
8. Bestimmung von unpolaren Metaboliten (Lipide)
- Das getrocknete Pellet der unpolaren Phase (Schritt 6.1) in einer Mischung aus Acetonitril:isopropanol (7:3, v:v) wieder aufsetzen.
- Zentrifuge bei 20000 x g und getrennt auf einer umgekehrten Phase C8-Säule (100 mm x 2,1 mm x 1,7 m Partikel), mit einem UPLC-System (siehe Tabelle der Materialien). Die beiden beweglichen Phasen waren Wasser mit 1% 1 M Ammoniumacetat, 0,1% Essigsäure (Puffer A) und Acetonitril:Isopropanol (7:3) mit 1% 1 M Ammoniumacetat, 0,1% Essigsäure (Puffer B).
- Verwenden Sie die Gradientenparameter gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll14.
9. Bestimmung des Chlorophyllgehalts
- Mischen Sie 100 l der MTBE-Phase (Schritt 6.1) mit 900 l 90% Methanol für ein Verfahren leer sowie die experimentellen Proben.
- Messen Sie die Absorption mit spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 665 nm und 652 nm, um zwischen Chlorophyll a und Chlorophyll b zu unterscheiden.
HINWEIS: Die Absorption sollte bei einer gültigen Konzentrationsberechnung zwischen 0,1 und 1 liegen. Verdünnen Sie die Proben, falls erforderlich. - Berechnen Sie den Chlorophyll-A- und b-Gehalt sowie den Gesamtchlorophyllgehalt nach den folgenden Formeln.
Chla = 16.82A665 – 9.28A652
Chlb = 36,92A652 – 16,54A665
Chla=b = 0.28A665 + 27.64A652
HINWEIS: Die Formeln wurden von Bar-Nun und Ohad15beschrieben.
10. Extraktion und Bestimmung des Proteingehalts, Verdauung und Analyse
ANMERKUNG: Um das Protein wieder auszusetzen, wurde Pelletharnstoff/Thiourea-Puffer (6 M Harnstoff, 2 M Thioureaand-Protease- und Phosphatase-Inhibitoren) mit Modifikationen im zuvor beschriebenen Protokoll16verwendet. Allerdings kann jeder Puffer der Wahl für die Resuspension von Proteinen verwendet werden.
- Bereiten Sie den Proteinpuffer mit den folgenden Konzentrationen vor: 6 M Harnstoff und 2 M Thiourea.
- Lösen Sie das Pellet (Schritt 6.5) in 200 l Proteinpuffer (10,1).
- Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 30 min, gefolgt von Zentrifugation bei 20000 x g für 5 min.
- Übertragen Sie den Überstand, der die Proteine enthält, in eine neue Röhre.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration durch Bradford Assay17.
- Verdauen Sie 50 g Protein in-Lösung mit einem Protokoll der Wahl. Verwenden Sie hier das folgende Protokoll.
- Reduzieren Sie 50 g Proteinproben mit 5 mM DTT für 30 min, gefolgt von Alkylierung mit 10 mM Iodoacetamid für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Trypsin/Lys-C Mix bei einem 25:1-Protein:Protease-Verhältnis (w/w) hinzufügen, mischen und für 3 h bei 37 °C inkubieren.
- Verdünnen Sie die Proben sechsfach mit 50 mM TrisHCl (pH 8) und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
- Beenden Sie die Verdauung durch Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) zu einer Endkonzentration von 0,5–1%.
- Führen Sie nach der Verdauung die Entsalzung der Peptide vor der Massenspektrometrie mit C 18-Stufenspitzen durch und elute die verdauten Peptide18.
- Konzentrieren Sie die Proben auf nahezu Trockenheit, so dass 2-5 l Lösung in einem Vakuumkonzentrator (siehe Materialtabelle) ohne Erhitzung.
- Setzen Sie die Proben im Ladepuffer (5% Acetonitril, 0,5% Ameisensäure) wieder auf und analysieren Sie die Peptidgemische mit LC-MS/MS mit einem hochauflösenden Massenspektrometer (siehe Materialtabelle), das mit einem Nano-UPLC-System verbunden ist.
- Trennen Sie die Peptide mit dem UPLC-System (siehe Materialtabelle) auf einer 20 cm-Reverse-Phase-Charged-Surface-Hybrid-Säule (siehe Materialtabelle)mit einem Innendurchmesser von 75 m und einer Partikelgröße von 1,7 m.
- Laden Sie 4 l Der Probe und laufen Sie durch 90 min Gradient bei einer Durchflussrate von 300 nL/min.
- Legen Sie den Farbverlauf fest. Verwenden Sie partielle Loop-Offline-Einstellungen mit isokratischem Gradienten, der auf 3% des Puffers B (99,9% Acetonitril + 0,1% Ameisensäure) 14 min gehalten wird, bevor die Schleife mit der Spalte in die Online-Position verschoben wird, danach wird der Gradient linear für 50 min erhöht, bis 20% Puffer B erreicht ist.
- Erhöhen Sie innerhalb der nächsten 15 min die Konzentration des Puffers B auf 30%. Erhöhen Sie dann in den folgenden 15 min puffer B auf 40%, bevor Sie nach weiteren 4 min 90% des Puffers B erreichen. Führen Sie den Waschschritt, der zum Reinigen der Säule erforderlich ist, bei 400 nL/min durch und halten Sie weitere 10 min (siehe Tabelle 1 für detaillierte Gradienten). Bedingungen).
- Stellen Sie das System schließlich auf eine Durchflussrate von 300 nL/min und eine Konzentration von 3% Puffer B innerhalb von 1 min zurück. Stellen Sie die Säule 15 min aus, bevor die nächste Probe injiziert wird.
ANMERKUNG: Eine vollständige Liste der identifizierten Proteine nach der LCMS/MS-Analyse ist in Tabelle 2dargestellt.
11. Extraktion und Bestimmung des Stärkegehalts
HINWEIS: Zur Bestimmung des Gesamtprotein- und Stärkegehalts wurde das feste Pellet in einem zweistufigen Verfahren extrahiert, wie zuvorbeschrieben 10.
- Fügen Sie dem Zellpellet (Schritt 6.5) 500 l 80 % (v/v) Ethanol hinzu und 10 min bei 80 °C inkubieren.
- Zentrifuge bei 4000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Lösen Sie dann das Pellet in 250 l sterilem Wasser, gefolgt von der Zugabe von 250 l von 100 mM Natriumacetat.
- Die Stärke durch Erhitzen 3 h bei 99 °C hydrolysieren. Verdauen Sie die gelöste Stärke über Nacht in Glukosemonomere, indem Sie einen Enzymmix aus '-Amylase (4,2 Einheiten pro Probe) und '-amyloglucosidase (10 Einheiten pro Probe) hinzufügen. Inkubieren Sie die Rohre bei 37 °C über Nacht.
HINWEIS: Nach der Inkubation können Proben einige Tage bei -20 °C oder mehrere Monate bei -80 °C eingefroren werden, bevor Glukosemessungen durchgeführt werden. - Zentrifugieren Sie den verdauten Extrakt bei 20000 x g für 5 min und sammeln Sie den Überstand. Lösen Sie den Überstand (mit den stärkeabgeleiteten Glukosemonomeren) in 100 mM HEPES-Puffer (pH 7), der 5 mM MgCl2, 60 mg/ml ATP, 36 mg/ml NADP und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (1 Einheit pro Probe) enthält.
- Um den Stärkegehalt zu analysieren, messen Sie zunächst die Basisabsorption bei 340 nm. Fügen Sie dann Hexokinase (1 Einheit pro Probe) hinzu, um die Reaktion zu starten. Schließlich messen Sie den Anstieg von NADPH+H+ (Anzeige des Stärkespiegels auf Glukose) bei 340 nm mit einem 96-Well-Plattenleser.
ANMERKUNG: Die Differenz des Maximalwertes bei 340 nm (sollte den linearen Bereich von 1 nicht überschreiten) und die Basislinie entspricht der Glukosekonzentration der verdauten Stärke. Zur Bestimmung der Glukosekonzentration in nmol Glukose pro ml sollte eine Glukosekurve erstellt werden.
Representative Results
Chlamydomonas reinhardtii CC-1690-Kultursynchronisierung
Um die repräsentativen Ergebnisse für das gegebene Protokoll zu demonstrieren, stellen wir die Beispiel-Multi-Omics-Daten vor, die nach der Ernte und Extraktion von Proben aus synchronisierten Chlamydomonas reinhardtii Kulturen10gewonnen wurden. Synchronisierte Kulturen von Chlamydomonas bestehen aus Zellen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt zur gleichmäßigen Wachstumsphase gehören. Die Chlamydomonas-Kulturen wurden bei 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus, 34 °C mit einer Lichtintensität von 200 x-2s-1 und der CO2-Konzentration von 2%, v/v, als optimale Konzentration für Dehnung CC-1690 mt+ 10 beschrieben synchronisiert. . Diese Bedingungen waren zuvor mit verschiedenen Zellzyklusparametern10optimiert und validiert worden. Abbildung 1 zeigt die mit Coulter Counter gemessene Zellgrößenverteilung zu unterschiedlichen Zeitpunkten synchronisierter Kulturen. Eine Verschiebung des Zellvolumens kann beobachtet werden, wenn die Zellen während der Lichtphase in der Größe wachsen, gefolgt von der Freisetzung von Tochterzellen ab dem Ende der Lichtphase von 10 h. Sobald alle Tochterzellen freigegeben sind, kann eine Verschiebung des Zellvolumens beobachtet werden, wenn die neu freigegebenen Tochterzellen bereit sind, den nächsten Zyklus 10 zu beginnen (Abbildung 1).
Probenentnahme, -handling und -extraktion
Die schnelle Entnahme der Proben erfolgt mittels Zentrifugation und nach dem Wegwerfen des Überstandes können die Pellets bis zur Extraktion bei -80 °C gelagert werden. Wie oben beschrieben (Schritt 5), ergebnisse die MTBE-Extraktion in drei verschiedenen Phasen: a) die organische Phase wurde zur Messung von Lipiden sowie Chlorophyllspiegeln (Normalisierungsfaktor) verwendet, b) die polare Phase wurde gesammelt, um Metaboliten an GCMS zu messen, während c) das Pellet verwendet wurde. Stärkegehalt und Proteine zu messen. Abbildung 2zeigt einen Überblick über die Verteilung der verschiedenen Phasen und ihre Beschäftigung.
Polare und unpolare Metaboliten
Basierend auf der GCMS-Analyse der Polarfraktion wurden 65 Metaboliten kommentiert, die Aminosäuren, Nukleinsäuren, Zwischenprodukte der Glykolyse, Gluconeogenese, Tricarbonsäurezyklus, Pentosephosphatweg und Polyamonien umfassen (Abbildung 3A). Die LCMS-Analyse neutraler Lipidphasen führte zur Identifizierung von 204 verschiedenen Lipidarten, die verschiedene Lipidklassen abdecken, nämlich Phosphatidylglycerine, Phosphatidylethanolamin, Sulfoquinovosyldiacylglycerolen, Monogalactosyldiacylglycerols, Digalactosyldiacylglycerole, Diacylglyceryltrimethylhomoserin, Fettsäuren, Diacylglyceride und Triacylglyceride. Um die globalen Verschiebungen in den Metaboliten und Lipiden über den Zellzyklus hinweg zu visualisieren, wurde die Hauptkomponentenanalyse (PCA) verwendet. Das PCA zeigt eine Trennung von hellen und dunklen Phasen für metabolomics und lipidomische Daten. Darüber hinaus kann für beide Daten ein semizyklischer (teilweise offener Kreis) festgestellt werden (Abbildung 3C,D). Die partielle Lücke im kreisförmigen Muster wird darauf zurückgeführt, dass die Proben bei 24 h des Zellzyklus im Gegensatz zu den zu Beginn des Zellzyklus nach 0,25 h Exposition gegenüber dem Licht gesammelten Proben unter Dunkel entnommen wurden (Abbildung3C ,D).
Protein- und Stärkeanalyse
Um die Qualität des proteinpellets zu untersuchen, das durch die MTBE-Extraktion gewonnen wurde, wurden 6 Proben für die proteomische Analyse verwendet. Die Qualität der Proteomik-Daten, die durch die Verdauung von 50 g Protein/Probe gewonnen wurden, wurde mit einem computergestützten Qualitätskontrolltool -Proteomics Quality Control (PTXQC)19untersucht, was auf reproduzierbare und hohe Qualität der Proteomik-Daten aus alle Replikationen (Ergänzende Abbildung 1). Die molekulare funktionelle Abdeckung von Proteinen wurde mit REVIGO20untersucht. Eine Übersicht über die funktionelle Anreicherung der 2463 identifizierten Proteine (siehe Tabelle 2), ist in Abbildung 4Adargestellt. Das verbleibende Pellet nach der Proteinextraktion wurde zur reproduzierbaren Quantifizierung der Stärke verwendet, wie durch geringe Standardabweichung zwischen verschiedenen Replikationen angezeigt (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Illustratives Beispiel für die Veränderungen des Zellvolumens in verschiedenen Phasen des Zellzyklus in Chlamydomonas reinhardtii. Die x-Achse, die das Zellenvolumen darstellt, während die y-Achse die Zellenzahl darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Illustrierter Workflow für den Einsatz verschiedener Phasen bei Multi-Omics Extraktionszellpellets. Die Figur wurde von Juppner, J.et al. wiederverwendet. 10. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentatives Beispiel für Metaboliten und Lipide, die mit dem beschriebenen Protokoll identifiziert wurden. (A) Metabolitenklassen, die durch die GCMS-Analyse identifiziert wurden. (B) Lipidarten, die verschiedenen Klassen angehören, die durch LCMS-Analysen identifiziert wurden. (C) Prinzipiellkomponentenanalyse der Metabolitenspiegel über den 24 h-Zellzyklus. (D) Prinzipiellkomponentenanalyse der Lipide über den 24 h-Zellzyklus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentatives Beispiel für die Protein- und Stärkedaten. A) Molekulare funktionelle Anreicherung der mit LCMS-Analyse identifizierten Proteine, Baumkarte gezeichnet mit REVIGO 20 B) repräsentativen Stärkedaten, die die Reproduzierbarkeit des Protokolls anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Maßgeschneidertes Design des Fermentersystems für das Temperatur- und Belüftungsgesteuerte synchrone Wachstum von Chlamydomonas-Kulturen. Die Figur wurde von Juppner, J.et al. wiederverwendet. 10. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Repräsentatives Ergebnis für die Datenqualität der Proteomik. Heatmap mit dem computergestützten PTXQC-Tool19geplottet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
| Zeit (min) | % Puffer B in Puffer A | |
| 0 bis 15 min | Linearer Gradient von 0 bis 3% | Puffer A: 0,1% Ameisensäure in UPLC-Wasser |
| 15 bis 75 Min. | Linearer Gradient von 3% bis 30% | Puffer B: 0,1% Ameisensäure in 60% UPLC-Acetonitril |
| 75 bis 90 Min. | Linearer Gradient von 30% bis 40% | Durchfluss 300 nL/min |
| 90 bis 94 Min. | Linearer Gradient von 40% bis 90% | Injektionsvolumen 4 l |
| 94 bis104 Min. | Waschsäule mit 90% | |
| 105 bis 120 Min. | Ausgleich der Säule für 15 min bei 3% |
Tabelle 1: Flüssigchromatographie von Peptidproben, Gradientenparameter.
Tabelle 2: Liste der nach der LCMS/MS-Analyse identifizierten Proteine. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
In diesem Artikel haben wir ein robustes und hochanwendbares Extraktionsprotokoll für umfassende Lipidomik-, Metabolomik-, Stärke- und Proteomik-Analysen aus einem einzigen Pellet von 10-15 x 106 Zellen veranschaulicht. Die Methode wurde erfolgreich in mehreren Studien für eine breite Palette von Zellen und Geweben10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Hier präsentierten wir eine schrittweise Pipeline zur Multi-Omics-Analyse verschiedener Biomoleküle aus einer einzigen Probe, die aus der Chlamydomonas-Reinhardtii-Kultur (CC-1690 mt+) geerntet wurde.
Das Protokoll bietet einen robusten und reproduzierbaren Ansatz zur gleichzeitigen Verarbeitung mehrerer Proben für die Analyse verschiedener Biomoleküle. Es sollten jedoch eine Reihe kritischer Schritte unternommen werden, um die technischen Abweichungen zu minimieren. Erstens sollte die Ernte der Zellen so schnell wie möglich erfolgen, wobei die einheitlichen Bedingungen für alle geernteten Proben beibehalten werden sollten, um den biologischen Zustand der Zellen zu erhalten. Obwohl wir zentrifugieren, um die Zellen zu ernten, können alternative Erntestrategien für die Ernte der Proben verwendet werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass verschiedene Erntestrategien bekannt sind, um den Stoffwechselzustand der Zellen37 zu beeinflussen, daher muss ein konsistenter Ernteansatz für alle experimentellen Proben verwendet werden. Zweitens ist es wichtig, das Trocknen der oberen unpolaren Phase, die Chlorophyll enthält, zu vermeiden, da dies den Gehalt an gelöstem Chlorophyll im Lösungsmittel beeinflussen kann, der den Normalisierungsfaktor für die Proben beeinflusst. Schließlich sollte beim Entfernen der verbleibenden polaren Phase darauf geachtet werden, das Protein und Stärkepellet zu erhalten, um zu vermeiden, dass das Pellet gestört wird, was den Stärke- und Proteingehalt beeinflussen kann.
Das vorgestellte Extraktionsprotokoll bietet mehrere Vorteile für die Multiple-Omics-Datenanalyse. Neben der Minimierung der Anzahl der benötigten Proben-Aliquots reduziert es auch die Variation zwischen den analyseischen Ergebnissen, die für verschiedene Biomoleküle erzielt wurden. Dies ermöglicht einen direkten Vergleich der Ergebnisse aus den primären Metaboliten, Lipiden und proteomischen Daten. In ähnlicher Weise ermöglicht die gleichzeitige Extraktion mehrerer zusammengesetzter Klassen eine konsistente und einheitliche Normalisierungsstrategie der verschiedenen Datensätze. Dies gilt insbesondere dann, wenn die Normalisierung mit trockenem oder frischem Gewicht38 oder Zellnummer schwer zu erreichen ist.
Das Protokoll kann für das routinemäßige Screening einer komplexen biologischen Probe implementiert werden. Diese ganzheitlichen metabotomischen, lipidomischen und proteomischen Datensätze können umfassende Informationen über systematische Veränderungen im Stoffwechsel bieten. Darüber hinaus liefern die aus der Proteomik-Analyse gewonnenen Daten Einblicke in die quantitativen (Überfluss- und qualitativen) Veränderungen der Proteine in Bezug auf die Metaboliten. Daher könnte die Integration von Omics-Daten tiefgehende Informationen über Veränderungen aufdecken, die durch genetische oder biotische und/oder abiotische Störungen eines biologischen Systems verursacht werden. So, Aufklärung molekularer Veränderungen bestimmter Stoffwechselwege oder zellulärer Prozesse. In ähnlicher Weise können diese Daten mit hohem Durchsatz die Identifizierung von Zielen für die Stoffwechseltechnik ermöglichen und Vorhersagen aus genomgroßen Metabolischen Modellen37,39verfeinern oder testen.
Disclosures
Die Autoren haben keine Angaben.
Acknowledgments
Wir danken Gudrun Wolter und Änne Michaelis für die hervorragende technische Unterstützung. Wir danken allen Mitgliedern des Giavalisco-Labors für ihre Hilfe. Wir danken der Max-Planck-Gesellschaft für die Finanzierung der Forschung und FAPESP für das Stipendium von L A Giraldi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Equipment | |||
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
| Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |
References
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