System dækkende analyse af flere biomolekyler er afgørende for at opnå funktionel og mekanistisk indsigt i biologiske processer. Herved beskrives en omfattende protokol for udvinding af lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve høstet fra synkroniseret Chlamydomonas-kultur.
Mikroalger har været fokus for forskning for deres anvendelser i produktionen af høj værdi forbindelser, fødevarer og brændstof. Desuden er de værdifulde fotosyntetiske modeller lette forståelsen af de grundlæggende cellulære processer. System dækkende undersøgelser muliggør omfattende og dybtgående forståelse af organismers molekylære funktioner. Der kræves imidlertid flere uafhængige prøver og protokoller for proteomics, lipidomics-og metabolomics-undersøgelser, som indfører højere fejl og variabilitet. Her præsenteres en robust ekstraktionsmetode med høj gennemløb for samtidig ekstraktion af klorofyl, lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve af den grønne Alga chlamydomonas Calabaria . Den illustrerede eksperimentelle opsætning er for Chlamydomonas kulturer synkroniseret ved hjælp af 12 h/12 h lys/mørke forhold. Der blev indsamlet prøver over en 24-timers celle cyklus for at påvise, at metabolitter, lipider og stivelses data opnået ved hjælp af forskellige analytiske platforme er godt konforme. Desuden blev protein prøver indsamlet ved hjælp af samme ekstraktions protokol anvendt til at gennemføre detaljerede proteomics-analyser for at evaluere deres kvalitet og reproducerbarhed. Baseret på de data, kan det udledes, at den illustrerede metode giver en robust og reproducerbar tilgang til at fremme forståelsen af forskellige biokemiske veje og deres funktioner med større tillid til både grundlæggende og anvendt forskning.
Mikroalger er en rig kilde til naturlige produkter (f. eks. brændstoffer, menneskers og dyrs ernæring, kosmetik og farmakologiske stoffer). Der gennemføres talrige forskningsbestræbelser for at øge effektiviteten af produktionen af produkter af høj værdi fra mikroalger1,2,3,4. System-niveau forståelse af metabolisme er en forudsætning for at forbedre kvaliteten og udbyttet af naturlige produkter5,6,7. Med fremkomsten af funktionelle genomteknikker og forbedrede massespektrometri metoder, tusindvis af gener, udskrifter, proteiner, og metabolitter kan overvåges samtidigt. Der kræves dog flere prøver til dybdegående proteomics, lipidomics og metabolomics undersøgelser, som ofte er svære at opnå i unicellulære organismer, især hvis der skal udføres tidskursus undersøgelser. Desuden introducerer indsamling og behandling af forskellige prøve aliquoter i kombination med forskellige protokoller til indsamling af de meget komplekse omik-data (dvs. proteomic, lipidomic og metabolomics) variabilitet, hvilket gør integrationen af data til en udfordrende opgave.
Chlamydomonas giver ikke kun et fremragende mikrobielt system til undersøgelse af cellulære processer, men også en bekvem model til at studere koordineringen af celle cyklus og metabolisme. Derfor er en stærk koordination af transskriptioner udtryk med celle cyklus blevet vist ved hjælp af høj opløsning transkriptom profilering af synkroniseret kultur af Chlamydomonas8. Omkring 80% af de analyserede udskrifter udstillet robust periodicitet over en 24 h celle cyklus8. Ligeledes, tør vægt, proteiner, chlorophyll, aminosyrer og fedtsyrer af to forskellige stammer af Chlamydomonas viste sig at korrelere med celledeling i en undersøgelse, hvor prøvetagning blev udført hver 4 h9. For nylig blev det rapporteret, at metabolitten og lipid dynamikken i celle skiftet baseret på specifikke faser af cellen cyklus10. De subtile ændringer i forskellige biomolekyler var mulige at overvåge ved hjælp af en robust methyltert-butylether (MTBE): methanol: vandbaseret ekstraktionsmetode, som giver et ideelt udgangspunkt for omfattende multi-omics-analyse10 , 11.
Den præsenterede protokol guider gennem en reproducerbar og effektiv strategi10, for samtidig ekstraktion af lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve alikvot, for den tid, der er løst metabolomic og lipidomisk undersøgelse af synkrone voksende Chlamydomonas kulturer. Ud over at illustrere de robuste og reproducerbare metaboliske og lipidomiske data10, her, er kvaliteten af de proteiske prøver opnået fra samme pellet også påvist.
I denne artikel, vi illustrerede en robust og meget anvendelig udvinding protokol for omfattende lipidomics, metabolomics, stivelse og proteomics analyse fra en enkelt pellet af 10-15 x 106 celler. Metoden er blevet implementeret med succes i flere undersøgelser for en bred vifte af celler og væv10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Her præsenterede vi en trinvis pipeline for multi-omics analyse af forskellige biomolekyler fra en enkelt prøve høstet fra chlamydomonas Calabaria (CC-1690 MT +) kultur.
Protokollen giver en robust og reproducerbar tilgang til behandling af flere prøver på én gang, til analyse af forskellige biomolekyler. Men, en række kritiske skridt bør tages hånd om for at minimere den tekniske variation. For det første bør høst af cellerne ske så hurtigt som muligt, samtidig med at de ensartede betingelser for alle høstede prøver bevares for at bevare cellernes biologiske tilstand. Selvom vi brugte centrifugering til at høste cellerne, kan alternative høst strategier anvendes til høst af prøverne. Men, det er vigtigt at bemærke, at forskellige høst strategier er kendt for at påvirke den metaboliske tilstand af cellerne37 derfor, konsekvent høst tilgang skal anvendes til alle eksperimentelle prøver. For det andet er det vigtigt at undgå tørring af den øvre ikke-polære fase, der indeholder klorofyl, da dette kan påvirke niveauerne af opløst klorofyl i opløsningsmidlet, som påvirker normaliserings faktoren for prøverne. Endelig bør man være forsigtig med at fjerne den resterende Polar fase for at opnå protein-og stivelses pellet for at undgå at forstyrre den pellet, der kan påvirke indholdet af stivelse og protein.
Derved præsenteret udvinding protokol tilbyder flere fordele for multiple-omics dataanalyse. Ud over at minimere antallet af påkrævede prøve-aliquoter reducerer det også variationen mellem de analytiske resultater, der er opnået for forskellige biomolekyler. Dette muliggør direkte sammenligning af resultaterne fra de primære metabolitter, lipiderne og de proteomiske data. På samme måde muliggør den samtidige ekstraktion af flere sammensatte klasser en ensartet og ensartet normaliserings strategi for de forskellige datasæt. Dette gælder især, hvis normalisering er svært at opnå ved hjælp af tør eller frisk vægt38 eller celle nummer.
Protokollen kan gennemføres med henblik på rutinemæssig screening af en kompleks biologisk prøve. Disse holistiske metabolomic, lipidomiske og proteomisk datasæt kan tilbyde omfattende information om systematiske ændringer i stofskiftet. Desuden giver de data, som er indhentet fra proteomics-analysen, indsigt i de kvantitative (overflod) og kvalitative (ændringer) ændringer i proteiner i forhold til metabolitterne. Integrationen af omik-data kunne således afsløre dybtgående oplysninger om ændringer, der skyldes genetiske eller biotiske og/eller abiotiske forstyrrelser i et biologisk system. Således, belyse molekylære ændringer af specifikke metaboliske veje eller cellulære processer. På samme måde kan disse data med høj dataoverførselshastighed gøre det muligt at identificere mål for metaboliseringsteknik og raffinere eller afprøve forudsigelser fra metaboliske modeller af genomskala37,39.
The authors have nothing to disclose.
Vi er meget taknemmelige for Gudrun Wolter og Änne Michaelis for fremragende teknisk assistance. Vi vil gerne takke alle medlemmerne af Giavalisco Lab for deres hjælp. Vi er taknemmelige for Max Planck Society for finansiering af forskning og FAPESP for Fællesskabet af L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |