L’analyse à l’échelle du système de plusieurs biomolécules est cruciale pour obtenir des informations fonctionnelles et mécanistes sur les processus biologiques. Par la présente, un protocole étendu est décrit pour l’extraction à haut débit des lipides, des métabolites, des protéines et de l’amidon à partir d’un seul échantillon récolté à partir de la culture synchronisée de Chlamydomonas.
Les microalgues ont fait l’objet de recherches pour leurs applications dans la production de composés, d’aliments et de carburant de grande valeur. En outre, ils sont de précieux modèles photosynthétiques facilitant la compréhension des processus cellulaires de base. Les études à l’échelle du système permettent une compréhension complète et approfondie des fonctions moléculaires des organismes. Cependant, plusieurs échantillons et protocoles indépendants sont nécessaires pour les études de protéomique, lipidomique et métabolomique introduisant une erreur et une variabilité plus élevées. Une méthode robuste d’extraction à haut débit pour l’extraction simultanée de chlorophylle, lipides, métabolites, protéines et amidon à partir d’un seul échantillon de l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii est présentée ici. La configuration expérimentale illustrée est pour les cultures Chlamydomonas synchronisées en utilisant 12 h/12 h de lumière/des conditions sombres. Des échantillons ont été prélevés sur un cycle cellulaire de 24 h pour démontrer que les métabolites, les lipides et les données sur l’amidon obtenus à l’aide de diverses plates-formes analytiques sont bien conformes. En outre, des échantillons de protéines prélevés à l’aide du même protocole d’extraction ont été utilisés pour effectuer une analyse protéomique détaillée afin d’évaluer leur qualité et leur reproductibilité. D’après les données, on peut en déduire que la méthode illustrée offre une approche robuste et reproductible pour faire progresser la compréhension de diverses voies biochimiques et de leurs fonctions avec une plus grande confiance pour la recherche fondamentale et appliquée.
Les microalgues sont une riche source de produits naturels (p. ex. carburants, nutrition humaine et animale, cosmétiques et substances pharmacologiques). De nombreux efforts de recherche sont réalisés pour améliorer l’efficacité de la production de produits de grande valeur à partir de microalgues1,2,3,4. La compréhension du métabolisme au niveau des systèmes est une condition préalable pour améliorer la qualité et le rendement des produits naturels5,6,7. Avec l’avènement des techniques génomiques fonctionnelles et des méthodes améliorées de spectrométrie de masse, des milliers de gènes, transcriptions, protéines et métabolites peuvent être surveillés simultanément. Cependant, plusieurs échantillons sont nécessaires pour les études approfondies de protéomique, de lipidomique et de métabolomique, qui est souvent difficile à réaliser dans les organismes unicellulaires, particulièrement si des études de cours de temps doivent être exécutées. En outre, la collecte et le traitement de différents échantillons d’aliquots en combinaison avec différents protocoles pour recueillir les données omics très complexes (c.-à-d. protéomique, lipidomique et métabolomic) introduit la variabilité, ce qui rend l’intégration des données un tâche difficile.
Chlamydomonas fournit non seulement un excellent système microbien pour l’étude des processus cellulaires, mais aussi un modèle pratique pour étudier la coordination du cycle cellulaire et le métabolisme. En conséquence, une forte coordination de l’expression des transcriptions avec le cycle cellulaire a été démontrée à l’aide du profilage transcriptome à haute résolution de la culture synchronisée de Chlamydomonas8. Environ 80% des transcriptions analysées ont montré la périodicité robuste au-dessus d’un cycle cellulaire8de 24 h. De même, le poids sec, les protéines, la chlorophylle, les acides aminés et les acides gras de deux souches différentes de Chlamydomonas ont été montrés pour corrélé avec la division cellulaire dans une étude où l’échantillonnage a été effectué tous les 4 h9. Récemment, il a été signalé que le métabolite et la dynamique lipidique du décalage cellulaire basé sur des phases spécifiques du cycle cellulaire10. Les changements subtils dans différentes biomolécules ont été possibles pour surveiller à l’aide d’un solide éther de méthyle-butyl (MTBE): méthanol: méthode d’extraction à base d’eau, qui offre un point de départ idéal pour une analyse multi-omique complète10 , 11.
Le protocole présenté guide à travers une stratégie reproductible et efficace10, pour l’extraction simultanée de lipides, métabolites, protéines et amidon à partir d’un seul échantillon aliquot, pour le temps résolu étude métabolomique et lipidomique de cultures de Chlamydomonas en croissance synchrone. En plus d’illustrer les données métaboliques et lipidomiques robustes et reproductibles10, ici, la qualité des échantillons protéomiques obtenus à partir de la même pastille est également démontrée.
Dans cet article, nous avons illustré un protocole d’extraction robuste et fortement applicable pour l’analyse complète de lipidomics, de metabolomics, d’amidon et de protéomique d’une boulette simple de 10-15 x 106 cellules. La méthode a été mise en œuvre avec succès dans plusieurs études pour un large éventail de cellules et de tissus10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Ici, nous avons présenté un pipeline stepwise pour l’analyse multi-omics de différentes biomolécules à partir d’un seul échantillon récolté à partir de Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt) culture.
Le protocole fournit une approche robuste et reproductible pour traiter plusieurs échantillons à la fois, pour l’analyse de diverses biomolécules. Cependant, un certain nombre d’étapes critiques devraient être prises en charge afin de minimiser la variation technique. Tout d’abord, la récolte des cellules doit être effectuée aussi rapidement que possible tout en maintenant les conditions uniformes pour tous les échantillons récoltés afin de préserver l’état biologique des cellules. Bien que nous ayons utilisé la centrifugation pour récolter les cellules, d’autres stratégies de récolte peuvent être utilisées pour la récolte des échantillons. Cependant, il est important de noter que différentes stratégies de récolte sont connues pour influencer l’état métabolique des cellules37, par conséquent, l’approche cohérente de récolte doit être utilisée pour tous les échantillons expérimentaux. Deuxièmement, il est important d’éviter le séchage de la phase supérieure non polaire contenant de la chlorophylle, car cela peut influencer les niveaux de chlorophylle dissous dans le solvant affectant le facteur de normalisation des échantillons. Enfin, il faut prendre soin d’enlever la phase polaire restante pour obtenir la protéine et l’amidon, afin d’éviter de déranger le granule qui peut influencer la teneur en amidon et en protéines.
Ainsi présenté le protocole d’extraction offre plusieurs avantages pour l’analyse de données multi-omics. En plus de minimiser le nombre d’aliquots d’échantillon requis, il réduit également la variation entre les résultats analytiques obtenus pour différentes biomolécules. Cela permet de comparer directement les résultats obtenus à partir des métabolites primaires, lipides et données protéomiques. De même, l’extraction simultanée de classes composées multiples permet une stratégie de normalisation cohérente et uniforme des différents ensembles de données. Ceci est particulièrement applicable si la normalisation est difficile à réaliser en utilisant le poids sec ou frais38 ou le numéro de cellule.
Le protocole peut être mis en œuvre pour le dépistage systématique d’un échantillon biologique complexe. Ces ensembles de données métabolomiques, lipidomiques et protéomiques holistiques peuvent offrir des informations complètes sur les changements systématiques dans le métabolisme. En outre, les données obtenues à partir de l’analyse protéomique, fournit un aperçu des changements quantitatifs (abondance) et qualitatives (modifications) dans les protéines par rapport aux métabolites. Par conséquent, l’intégration des données omics pourrait révéler des informations approfondies sur les changements induits par les perturbations génétiques ou biotiques et/ou abiotiques d’un système biologique. Ainsi, élucider les changements moléculaires de voies métaboliques spécifiques ou des processus cellulaires. De même, ces données à haut débit peuvent permettre l’identification de cibles pour l’ingénierie métabolique et affiner ou tester les prédictions des modèles métaboliques à l’échelle du génome37,39.
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes très reconnaissants à Gudrun Wolter et à Nne Michaelis pour l’excellente assistance technique. Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Giavalisco pour leur aide. Nous sommes reconnaissants à la Société Max Planck pour le financement de la recherche et FAPESP pour la bourse de L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |