Die systemweite Analyse mehrerer Biomoleküle ist entscheidend, um funktionelle und mechanistische Einblicke in biologische Prozesse zu gewinnen. Dabei wird ein umfangreiches Protokoll zur Hochdurchsatzextraktion von Lipiden, Metaboliten, Proteinen und Stärke aus einer einzigen Probe beschrieben, die aus synchronisierter Chlamydomonas-Kultur geerntet wird.
Mikroalgen standen im Fokus der Forschung für ihre Anwendungen in der Herstellung von hochwertigen Verbindungen, Lebensmitteln und Brennstoffen. Darüber hinaus sind sie wertvolle photosynthetische Modelle, die das Verständnis der grundlegenden zellulären Prozesse erleichtern. Systemweite Studien ermöglichen ein umfassendes und vertieftes Verständnis der molekularen Funktionen der Organismen. Für Proteomik-, Lipidomik- und Metabolomik-Studien, die höhere Fehler und Variabilität enden, sind jedoch mehrere unabhängige Proben und Protokolle erforderlich. Hier wird eine robuste Hochdurchsatzextraktionsmethode zur gleichzeitigen Extraktion von Chlorophyll, Lipiden, Metaboliten, Proteinen und Stärke aus einer einzigen Probe der grünen Alge Chlamydomonas reinhardtii vorgestellt. Das illustrierte Versuchsaufbau ist für Chlamydomonas Kulturen synchronisiert unter 12 h/12 h Licht/Dunkel-Bedingungen. Die Proben wurden über einen 24-stunden-Zellzyklus gesammelt, um zu zeigen, dass die metaboliten, Lipide und Stärkedaten, die mit verschiedenen Analyseplattformen gewonnen wurden, gut konform sind. Darüber hinaus wurden Proteinproben, die mit demselben Extraktionsprotokoll gesammelt wurden, verwendet, um detaillierte Proteomikanalysen durchzuführen, um ihre Qualität und Reproduzierbarkeit zu bewerten. Auf der Grundlage der Daten lässt sich daraus schließen, dass die illustrierte Methode einen robusten und reproduzierbaren Ansatz bietet, um das Verständnis verschiedener biochemischer Pfade und ihrer Funktionen mit größerer Sicherheit sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die angewandte Forschung zu fördern.
Mikroalgen sind eine reiche Quelle für natürliche Produkte (z. B. Kraftstoffe, Menschliche und tierische Ernährung, Kosmetika und pharmakologische Substanzen). Zahlreiche Forschungsanstrengungen werden durchgeführt, um die Effizienz der Produktion von hochwertigen Produkten aus Mikroalgen1,2,3,4zu verbessern. Das Verständnis des Stoffwechsels auf Systemebene ist eine Voraussetzung, um die Qualität und den Ertrag natürlicher Produkte zu verbessern5,6,7. Mit dem Aufkommen funktioneller genomischer Techniken und verbesserter Massenspektrometriemethoden können Tausende von Genen, Transkripten, Proteinen und Metaboliten gleichzeitig überwacht werden. Für eingehende Proteomik-, Lipidomik- und Metabolomik-Studien sind jedoch mehrere Proben erforderlich, die bei einzelligen Organismen oft nur schwer zu erreichen sind, insbesondere wenn Zeitverlaufsstudien durchgeführt werden sollen. Darüber hinaus führt die Sammlung und Verarbeitung verschiedener Proben-Aliquots in Kombination mit verschiedenen Protokollen zur Erfassung der hochkomplexen Omics-Daten (d. h. proteomisch, lipidomisch und metabolomik) zu Variabilität ein und macht die Integration von Daten zu einem herausfordernde Aufgabe.
Chlamydomonas bietet nicht nur ein ausgezeichnetes mikrobielles System für die Untersuchung zellulärer Prozesse, sondern auch ein praktisches Modell, um die Koordination von Zellzyklus und Stoffwechsel zu untersuchen. Dementsprechend wurde eine starke Koordination der Transkripte Expression mit Zellzyklus gezeigt, mit hochauflösenden Transkriptom Profiling der synchronisierten Kultur von Chlamydomonas8. Ungefähr 80% der analysierten Transkripte wiesen eine robuste Periodizität über einen 24 h Zellzyklus8auf. Ebenso wurden Trockengewicht, Proteine, Chlorophyll, Aminosäuren und Fettsäuren von zwei verschiedenen Stämmen von Chlamydomonas gezeigt, dass sie mit der Zellteilung in einer Studie korrelieren, in der alle 4 h9eine Probenahme durchgeführt wurde. Kürzlich wurde berichtet, dass der Metabolit und die Lipiddynamik der Zellverschiebung basierend auf bestimmten Phasen des Zellzyklus10. Die subtilen Veränderungen in verschiedenen Biomolekülen konnten mit einem robusten Methyltert-Butyher (MTBE) überwacht werden: Methanol: wasserbasierte Extraktionsmethode, die einen idealen Ausgangspunkt für eine umfassende Multiomics-Analyse bietet10 , 11.
Das vorgestellte Protokoll führt durch eine reproduzierbare und effiziente Strategie10, für die gleichzeitige Extraktion von Lipiden, Metaboliten, Proteinen und Stärke aus einer einzigen Probe aliquot, für die Zeit gelöst emetonomisch und lipidomic Studie von synchron wachsende Chlamydomonas-Kulturen. Neben der Veranschaulichung der robusten und reproduzierbaren metabolischen und lipidomischen Daten10wird hier auch die Qualität der aus dem gleichen Pellet gewonnenen proteomischen Proben nachgewiesen.
In diesem Artikel haben wir ein robustes und hochanwendbares Extraktionsprotokoll für umfassende Lipidomik-, Metabolomik-, Stärke- und Proteomik-Analysen aus einem einzigen Pellet von 10-15 x 106 Zellen veranschaulicht. Die Methode wurde erfolgreich in mehreren Studien für eine breite Palette von Zellen und Geweben10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Hier präsentierten wir eine schrittweise Pipeline zur Multi-Omics-Analyse verschiedener Biomoleküle aus einer einzigen Probe, die aus der Chlamydomonas-Reinhardtii-Kultur (CC-1690 mt+) geerntet wurde.
Das Protokoll bietet einen robusten und reproduzierbaren Ansatz zur gleichzeitigen Verarbeitung mehrerer Proben für die Analyse verschiedener Biomoleküle. Es sollten jedoch eine Reihe kritischer Schritte unternommen werden, um die technischen Abweichungen zu minimieren. Erstens sollte die Ernte der Zellen so schnell wie möglich erfolgen, wobei die einheitlichen Bedingungen für alle geernteten Proben beibehalten werden sollten, um den biologischen Zustand der Zellen zu erhalten. Obwohl wir zentrifugieren, um die Zellen zu ernten, können alternative Erntestrategien für die Ernte der Proben verwendet werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass verschiedene Erntestrategien bekannt sind, um den Stoffwechselzustand der Zellen37 zu beeinflussen, daher muss ein konsistenter Ernteansatz für alle experimentellen Proben verwendet werden. Zweitens ist es wichtig, das Trocknen der oberen unpolaren Phase, die Chlorophyll enthält, zu vermeiden, da dies den Gehalt an gelöstem Chlorophyll im Lösungsmittel beeinflussen kann, der den Normalisierungsfaktor für die Proben beeinflusst. Schließlich sollte beim Entfernen der verbleibenden polaren Phase darauf geachtet werden, das Protein und Stärkepellet zu erhalten, um zu vermeiden, dass das Pellet gestört wird, was den Stärke- und Proteingehalt beeinflussen kann.
Das vorgestellte Extraktionsprotokoll bietet mehrere Vorteile für die Multiple-Omics-Datenanalyse. Neben der Minimierung der Anzahl der benötigten Proben-Aliquots reduziert es auch die Variation zwischen den analyseischen Ergebnissen, die für verschiedene Biomoleküle erzielt wurden. Dies ermöglicht einen direkten Vergleich der Ergebnisse aus den primären Metaboliten, Lipiden und proteomischen Daten. In ähnlicher Weise ermöglicht die gleichzeitige Extraktion mehrerer zusammengesetzter Klassen eine konsistente und einheitliche Normalisierungsstrategie der verschiedenen Datensätze. Dies gilt insbesondere dann, wenn die Normalisierung mit trockenem oder frischem Gewicht38 oder Zellnummer schwer zu erreichen ist.
Das Protokoll kann für das routinemäßige Screening einer komplexen biologischen Probe implementiert werden. Diese ganzheitlichen metabotomischen, lipidomischen und proteomischen Datensätze können umfassende Informationen über systematische Veränderungen im Stoffwechsel bieten. Darüber hinaus liefern die aus der Proteomik-Analyse gewonnenen Daten Einblicke in die quantitativen (Überfluss- und qualitativen) Veränderungen der Proteine in Bezug auf die Metaboliten. Daher könnte die Integration von Omics-Daten tiefgehende Informationen über Veränderungen aufdecken, die durch genetische oder biotische und/oder abiotische Störungen eines biologischen Systems verursacht werden. So, Aufklärung molekularer Veränderungen bestimmter Stoffwechselwege oder zellulärer Prozesse. In ähnlicher Weise können diese Daten mit hohem Durchsatz die Identifizierung von Zielen für die Stoffwechseltechnik ermöglichen und Vorhersagen aus genomgroßen Metabolischen Modellen37,39verfeinern oder testen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Gudrun Wolter und Änne Michaelis für die hervorragende technische Unterstützung. Wir danken allen Mitgliedern des Giavalisco-Labors für ihre Hilfe. Wir danken der Max-Planck-Gesellschaft für die Finanzierung der Forschung und FAPESP für das Stipendium von L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |