複数の生体分子のシステム全体の分析は、生物学的プロセスに関する機能的および機械的な洞察を得るために重要です。本明細書により、同期クラミドモナス培養から採取された単一のサンプルから脂質、代謝産物、タンパク質およびデンプンの高スループット抽出について広範なプロトコルが記載されている。
微細藻類は、高価な化合物、食品、燃料の生産における彼らのアプリケーションのための研究の焦点となっています。さらに、それらは基本的な細胞プロセスの理解を促進する貴重な光合成モデルである。システム全体の研究は、生物の分子機能の包括的かつ詳細な理解を可能にします。しかし、プロテオミクス、リピドミクス、メタボロミクス研究では、より高い誤差と変動性を導入するために、複数の独立したサンプルとプロトコルが必要です。緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの単一サンプルからクロロフィル、脂質、代謝産物、タンパク質およびデンプンを同時抽出するための堅牢な高スループット抽出方法をここに提示する。図示された実験セットアップは、12時間/12時間の光/暗い条件を使用して同期されたクラミドモナス培養用です。サンプルを24時間の細胞周期で収集し、様々な分析プラットフォームを使用して得られた代謝産物、脂質およびデンプンデータが十分に適合していることを実証した。さらに、同じ抽出プロトコルを用いて収集したタンパク質サンプルを用いて、その品質と再現性を評価するために詳細なプロテオミクス分析を行った。このデータに基づいて、図示された方法は、様々な生化学的経路とその機能の理解を進めるための堅牢で再現性の高いアプローチを提供し、基礎研究と応用研究の両方に対する自信を持って提供できると推測できる。
微細藻類は、天然物(例えば、燃料、ヒトおよび動物の栄養、化粧品および薬理学的物質)の豊富な供給源である。微細藻類1、2、3、4からの高価な製品の生産の効率を高めるために多数の研究が行われている。新陳代謝のシステムレベルの理解は、天然物の品質と収量を向上させるための前提条件である 5,6,7.機能的ゲノム技術の出現と改良された質量分析法により、何千もの遺伝子、転写産物、タンパク質、代謝産物を同時に監視することができます。しかし、詳細なプロテオミクス、リピドミクス、メタボロミクス研究には複数のサンプルが必要であり、特に時間コース研究を行う場合は、単細胞生物では達成が困難であることが多い。さらに、異なるサンプルアリコートの収集と処理を異なるプロトコルと組み合わせて、非常に複雑なオミクスデータ(すなわち、プロテオミック、リピドミック、メタボロミクス)を収集すると、変動性が生じ、データの統合が可能になります。挑戦的な仕事。
クラミドモナスは、細胞プロセスの研究のための優れた微生物システムを提供するだけでなく、細胞周期と代謝の調整を研究するための便利なモデルを提供します。従って、細胞周期との転写発現の強い協調は、クラミドモナス8の同期培養の高解像度トランスクリプトームプロファイリングを用いて示された。分析された転写物の約80%は、24時間の細胞周期8にわたって堅牢な周期性を示した。同様に、乾燥重量、タンパク質、クロロフィル、アミノ酸およびクラミドモナスの2つの異なる株の脂肪酸は、4時間9ごとにサンプリングを行った研究において細胞分裂と相関することが示された。最近、細胞周期10の特定の相に基づく細胞シフトの代謝産物および脂質ダイナミクスが報告された。異なる生体分子の微妙な変化は、堅牢なメチルテルト-ブチルエーテル(MTBE):メタノール:包括的なマルチオミクス分析のための理想的な出発点を提供する水ベースの抽出方法を使用して監視することが可能でした10,11.
提示されたプロトコルガイドは、単一のサンプルアリコートからの脂質、代謝産物、タンパク質およびデンプンの同時抽出のために、再生可能で効率的な戦略10を通して、時間解決されたメタボロミックおよび脂質学的研究を導く同期的に成長するクラミドモナス文化。堅牢で再現可能な代謝およびリピドミックデータ10を示すほか、ここでは、同じペレットから得られるプロテオミクス試料の品質も実証されている。
この記事では、10-15 x 106細胞の単一ペレットからの包括的な脂肪学、メタボロミクス、デンプンおよびプロテオミクス分析のための堅牢で非常に適用可能な抽出プロトコルを示した。この方法は、細胞および組織の広い範囲のためのいくつかの研究で正常に実施されている10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 、35、36。ここでは、クラミドモナス・ラインハルティ(CC-1690 mt+)培養物から採取した単一サンプルから異なる生体分子のマルチオミクス解析のための段階的なパイプラインを提示した。
このプロトコルは、様々な生体分子の分析のために、複数のサンプルを一度に処理する堅牢で再現性の高いアプローチを提供します。ただし、技術的なバリエーションを最小限に抑えるために、多くの重要な手順を考慮する必要があります。第一に、細胞の生物学的状態を維持するために、すべての採取されたサンプルの均一な条件を維持しながら、細胞の収穫を可能な限り迅速に行う必要があります。遠心分離を使用して細胞を収穫しましたが、代替の収穫戦略を用いてサンプルの収穫を行うことができます。しかしながら、異なる収穫戦略が細胞37の代謝状態に影響を与ることが知られていることに注意することが重要であり、したがって、一貫した収穫アプローチは、すべての実験サンプルに使用されなければならない。第二に、クロロフィルを含む上部非極性相の乾燥を避けることは重要であり、これはサンプルの正規化因子に影響を与える溶媒中の溶解クロロフィルのレベルに影響を与えることができるので。最後に、残りの極相を除去しながら、タンパク質およびデンプンペレットを得る間、デンプンおよびタンパク質含有量に影響を与えることができるペレットを乱すことを避ける必要があります。
それによって提示された抽出プロトコルは、複数のオミクスデータ分析のためのいくつかの利点を提供する。必要なサンプルアリコートの数を最小限に抑えるだけでなく、異なる生体分子に対して得られる分析結果間の変動も減少します。これにより、一次代謝産物、脂質およびプロテオミックデータから得られた結果を直接比較することができます。同様に、複数の複合クラスを同時に抽出することで、異なるデータセットの一貫した統一正規化戦略を可能にします。これは、乾燥または新鮮な重量38またはセル数を使用して正規化が達成することが困難な場合に特に適用されます。
プロトコルは、複雑な生物学的サンプルの定期的なスクリーニングのために実装することができる。これらの全体的なメタボロミック、リピドミックおよびプロテオミクスデータセットは、代謝の系統的変化に関する包括的な情報を提供することができます。さらに、プロテオミクス分析から得られたデータは、代謝産物に関連するタンパク質の定量的(豊富)および定性的(修飾)変化に関する洞察を提供する。したがって、オミクスデータを統合することで、生物学的システムの遺伝的または生物学的および/または非生物的摂動によって引き起こされる変化に関する詳細な情報が明らかになる可能性があります。したがって、特定の代謝経路または細胞過程の分子変化を解明する。同様に、これらのハイスループットデータは、代謝工学の標的を同定し、ゲノムスケールの代謝モデル37、39からの予測を絞り込んだりテストしたりすることを可能にする。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、優れた技術支援を受けてくださったグドラン・ウォルターとアーン・ミカニスに心から感謝しています。私たちは、彼らの助けのためにジャヴァリスコラボのすべてのメンバーに感謝したいと思います。私たちは、L Aジラルディのフェローシップのための研究とFAPESPに資金を提供するためのマックスプランク協会に感謝しています
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |