다중 생체 분자의 시스템 전반의 분석은 생물학적 과정에 대한 기능적 및 기계적 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 따라서, 광범위한 프로토콜은 동기화된 클라미도모나스 배양으로부터 수확된 단일 샘플로부터 지질, 대사산물, 단백질 및 전분의 높은 처리량 추출에 대해 설명된다.
미세 조류는 고부가가치 화합물, 식품 및 연료 생산에 대한 연구의 초점이었습니다. 또한, 그들은 기본적인 세포 과정의 이해를 용이하게 귀중한 광합성 모델입니다. 시스템 전반의 연구를 통해 유기체의 분자 기능에 대한 포괄적이고 심층적인 이해를 가능하게 합니다. 그러나, 더 높은 오차 및 가변성을 소개하는 프로테오믹스, 지질학 및 대사체학 연구 결과를 위해 다중 독립적인 견본 및 프로토콜이 요구됩니다. 녹색 조류 클라미도모나스 라인하르트티의 단일 샘플에서 엽록소, 지질, 대사 산물, 단백질 및 전분을 동시에 추출하기 위한 강력한 높은 처리량 추출 방법이 여기에 제시되어 있습니다. 도시된 실험 설정은 12h/12h 의 빛/어두운 조건을 사용하여 동기화된 클라미도모나스 문화권용입니다. 샘플은 다양한 분석 플랫폼을 사용하여 얻은 대사산물, 지질 및 전분 데이터가 잘 부합한다는 것을 입증하기 위해 24시간 세포 주기에 걸쳐 수집하였다. 또한, 동일한 추출 프로토콜을 사용하여 수집된 단백질 샘플을 사용하여 상세한 프로테오믹스 분석을 수행하여 품질 및 재현성을 평가했습니다. 데이터를 기반으로, 설명 된 방법은 기본 및 응용 연구 모두에 대한 더 큰 자신감으로 다양한 생화확적인 경로와 그 기능에 대한 이해를 사전에 강력하고 재현 가능한 접근 방식을 제공한다는 것을 추론 할 수 있습니다.
미세 조류는 천연 제품의 풍부한 소스 (예를 들어, 연료, 인간및 동물 영양, 화장품 및 약리학 물질). 미세조류1,2,3,4에서고부가가치 제품의 생산 효율을 높이기 위해 수많은 연구가 수행되고 있다. 신진 대사의 시스템 수준의 이해는 품질과 천연 제품의 수율을 개선하기위해 필수 조건이다 5,6,7. 기능성 게놈 기술과 향상된 질량 분석 방법의 출현으로 수천 개의 유전자, 전사체, 단백질 및 대사 산물을 동시에 모니터링할 수 있습니다. 그러나, 시간 과정 연구가 수행되는 경우에, 단세포 유기체에서 달성하기 위하여 수시로 수시로 어려운 심층적인 proteomics, lipidomics 및 metabolomics 연구 결과를 위해 다중 견본이 요구됩니다. 더욱이, 매우 복잡한 omics 데이터(즉, 프로테오믹, 지질학 및 대사체학)를 수집하기 위해 다른 프로토콜과 조합하여 상이한 샘플 aliquots의 수집 및 처리는 가변성을 도입하여 데이터의 통합을 만들어 내고, 이는 도전적인 작업을 수행합니다.
클라미도모나스는 세포 과정의 조사를위한 우수한 미생물 시스템뿐만 아니라 세포 주기와 신진 대사의 조정을 연구할 수있는 편리한 모델을 제공합니다. 이에 따라, 클라미도모나스 8의 동기화 배양물의 고분해능 전사체 프로파일링을 사용하여 세포 주기와함께 전사체 발현의 강력한 조정이 나타났다. 분석된 전사체의 약 80%는 24시간 세포 주기8에걸쳐 견고한 주위를 나타내었다. 마찬가지로, 건조 중량, 단백질, 엽록소, 클라미도모나스의 두 가지 상이한 균주의 아미노산 및 지방산은 샘플링이 매 4h 9마다수행된 연구에서 세포 분열과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 최근에는세포주기(10)의특정 단계에 기초하여 세포이동의 대사산물 및 지질역학이 변화하는 것으로 보고되었다. 상이한 생체 분자의 미묘한 변화는 강력한 메틸 테르트-butyl 에테르 (MTBE)를 사용하여 모니터링 할 수 있었다 : 메탄올 : 수성 추출 방법, 이는 포괄적 인 다중 omics 분석을위한 이상적인 출발점을 제공10 , 11.
제시된 프로토콜은 단일 샘플 aliquot에서 지질, 대사 산물, 단백질 및 전분을 동시에 추출하기 위한 재현 가능하고 효율적인 전략10을통해, 시간 해결된 대사체및 지질학적 연구를 위한 가이드 클라미도모나스 문화를 성장시키는 동기적 성장. 강력하고 재현 가능한 대사 및 지질학적 데이터(10)를예시하는 것 외에도, 여기서 동일한 펠릿으로부터 수득된 단백질성 샘플의 품질도 입증된다.
이 문서에서는, 우리는 10-15 x 106 세포의 단 하나 펠릿에서 포괄적인 지질학, 대사체학, 전분 및 단백질학 분석을 위한 강력하고 높게 적용 가능한 추출 프로토콜을 설명했습니다. 이 방법은 10,14,21,22,23,24,25의 광범위한 세포 및 조직에 대한 여러 연구에서 성공적으로 구현되었습니다. ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. 여기에서, 우리는 클라미도모나스 라인하르트티 (CC-1690 mt+) 문화에서 수확한 단 하나 견본에서 다른 생체 분자의 다중 omics 분석을 위한 단계적인 파이프라인을 제출했습니다.
이 프로토콜은 다양한 생체 분자의 분석을 위해 여러 샘플을 한 번에 처리하기 위한 강력하고 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 그러나 기술적 변화를 최소화하기 위해 여러 가지 중요한 단계를 고려해야 합니다. 첫째, 세포의 수확은 세포의 생물학적 상태를 보존하기 위해 모든 수확 된 샘플에 대한 균일 한 조건을 유지하면서 가능한 한 신속하게 수행해야합니다. 우리는 세포를 수확하기 위해 원심 분리를 사용했지만, 대체 수확 전략은 샘플의 수확에 사용할 수 있습니다. 그러나, 다른 수확 전략이 세포의 대사 상태에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다37 따라서, 일관된 수확 방법은 모든 실험 샘플에 사용되어야한다. 둘째, 엽록소를 함유하는 상부 비극성 상이 건조되는 것을 피하는 것이 중요하며, 이는 용매에서 용해된 엽록소의 수준에 영향을 미칠 수 있기 때문에 샘플의 정규화 인자에 영향을 미칠 수 있다. 마지막으로, 단백질과 전분 펠릿을 얻기 위해 남은 극성 상을 제거하는 동안 주의를 기울여야하며, 전분 및 단백질 함량에 영향을 줄 수있는 펠릿을 방해하지 않도록해야합니다.
이에 따라 제시된 추출 프로토콜은 다중 omics 데이터 분석을 위한 몇 가지 이점을 제공한다. 필요한 샘플 aliquots의 수를 최소화 하는 것 외에도, 그것은 또한 다른 생체 분자에 대 한 수 득실 분석 결과 사이의 변이를 감소. 이것은 1 차적인 대사 산물, 지질 및 단백질 성 데이터에서 얻은 결과의 직접적인 비교를 허용합니다. 마찬가지로, 여러 복합 클래스의 동시 추출은 서로 다른 데이터 세트의 일관되고 균일한 정규화 전략을 허용합니다. 이는 건조또는 신선중량38 또는 셀 번호를 사용하여 정규화가 달성하기 어려운 경우에 특히 적용가능하다.
프로토콜은 복잡한 생물학적 샘플의 일상적인 스크리닝을 위해 구현될 수 있다. 이러한 전체적인 대사체, 지질학 및 단백질 데이터 세트는 신진 대사의 체계적인 변화에 대한 포괄적 인 정보를 제공 할 수 있습니다. 추가적으로, 단백질학 분석에서 얻은 데이터는, 대사 산물과 관련하여 단백질의 정량적(풍부) 및 정성적(수정) 변화에 대한 통찰력을 제공한다. 따라서, 오믹 데이터를 통합하면 생물학적 시스템의 유전적 또는 생물학적 및/또는 생체 학적 교란에 의해 유발 된 변화에 대한 심층적 인 정보를 공개 할 수 있습니다. 따라서, 특정 신진 대사 경로 또는 세포 과정의 분자 변화를 해명. 유사하게, 이러한 높은 처리량 데이터는 대사 공학을 위한 표적의 식별을 허용하고 게놈 규모 대사 모델37,39로부터의 예측을 구체화또는 테스트할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 훌륭한 기술 지원을 위해 Gudrun Wolter와 에엔 마이클리스에게 매우 감사드립니다. Giavalisco 연구소의 모든 회원들에게 도움을 주셔서 감사드립니다. 우리는 L A 히랄디의 교제를위한 연구 및 FAPESP 자금에 대한 막스 플랑크 사회에 감사드립니다
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |