Summary
Qui, presentiamo un protocollo per prelevare campioni di sangue dalla vena subclavia dei topi.
Abstract
Il topo è il principale modello di mammiferi per lo studio della malattia umana e della salute umana. Tuttavia, raccolta di campioni di sangue da topi è impegnativo nel lavoro di ricerca. La raccolta del sangue di coda è un metodo popolare quando è necessaria una piccola quantità di campione di sangue. L'arteria orbitale potrebbe essere considerata se è necessaria una grande quantità di sangue, ma questo metodo di raccolta del sangue ha problemi etici. In precedenza, abbiamo dimostrato la fattibilità e la sicurezza della raccolta dei campioni di sangue attraverso la puntura della vena subclavia nei ratti, e qui Indaghiamo se questo metodo potrebbe essere usato nei topi. Riportiamo che questo metodo è sicuro e pratico per la raccolta di sangue nei topi. La raccolta di sangue attraverso la puntura della vena subclavia nei topi può essere un metodo conveniente nelle opere di ricerca quotidiane.
Introduction
La raccolta di campioni di sangue dai topi è essenziale nella maggior parte dei laboratori di ricerca. Gli approcci convenzionali per la raccolta del sangue nei topi sono il taglio della coda quando sono necessari meno di 100 μL di campione1. Tuttavia, se sono necessari più di 100 μL di sangue in un punto temporale non terminale, il sanguinamento retroorbitale, Submandibolare o la raccolta di sangue submentale sono le tecniche più comunemente considerate2. In alcune occasioni, la cateterizzazione della vena giugulare attraverso un'incisione chirurgica è stata adottata come metodo alternativo3.
Tuttavia, i metodi di cui sopra sono dannosi per i topi. Al meglio delle nostre conoscenze, il metodo retroorbitale non è ampiamente accettato a causa del rischio potenziale di complicazioni4,5. Trauma correlato all'operazione non solo accade nell'area visibile6,7, ma anche in profondità all'interno dell'orbita6. Inoltre, la raccolta di sangue sottomandibolare è stressante8 e potrebbe essere associata a sanguinamento eccessivo2,9. Sulla base della nostra precedente ricerca10,11, qui introduciamo una nuova strategia per la raccolta del sangue dalla vena subclavia nei topi. La sicurezza, la fattibilità e il volume di sangue ottenuto con questa tecnica sono presentati e discussi.
Protocol
Questo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Università centrale del sud per la ricerca animale dal secondo Xiangya Hospital (Changsha, Cina). Il manoscritto è stato preparato secondo le linee guida di arrivo (ricerca animale: segnalazione di esperimenti in vivo)12.
1. materiale e animale
- Preparare i materiali richiesti: 75% etanolo, nastro adesivo, agente epilante, tubo da 2 mL, siringa da 1,0 mL collegata con ago (26G), bilancia elettronica, eparina e soluzione salina (vedere tabella dei materiali).
- Animali: preparare 10 topi di Kunming, 6-8 settimane di età e di peso 21.6-28.3 g (Vedi tabella dei materiali). Mantenere i topi in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio13.
2. anestesia e posizionamento degli animali
- Pesare il mouse per calcolare il dosaggio richiesto di agente anestetico.
- Iniettare il pentobarbital di sodio (60 mg/kg) attraverso l'iniezione intraperitoneale per indurre l'anestesia generale14 (Figura 1). Applicare un unguento di lubrificazione oculare sterile all'inizio della procedura per evitare danni agli occhi esposti.
Nota: i topi sono considerati sufficientemente anestetizzati quando non mostrano alcuna risposta del motore al test del riflesso del ritiro del pedale, della coda o del pizzico di pelle addominale. - Posizionare il mouse nel tavolo operativo in posizione supina e 2-4 cm di distanza dal bordo del tavolo per facilitare la puntura venosa (Figura 2). Fissare gli arti in una posizione comoda come mostrato in Figura 2. Non è necessaria alcuna intubazione o ventilazione meccanica nell'intera procedura.
- Applicare l'agente di epilazione attorno allo spazio infraclavicolare con un batuffolo di cotone.
- Tre minuti dopo, lavare l'agente epilatore con un batuffolo di cotone bagnato per rimuovere la pelliccia e qualsiasi sporcizia visibile.
- Sterilizzare lo spazio infraclavicolare con 75% di etanolo e poi asciugare con garza pulita.
3. puntura della vena subclavia e raccolta del sangue
- Identifica la posizione dell'osso della clavicola e la fossa sternale superiore con un dito.
- Individuare il sito di puntura vicino al centro dell'osso della clavicola e caudale ad esso. Mettere il dito indice sinistro lateralmente al sito di puntura per fissare la pelle e il tessuto sottocutaneo (Figura 3).
- Spostare l'ago verso l'alto e cranialmente verso la fossa sternale superiore. Una volta che l'ago entra nel tessuto sottocutaneo, muovere il dito anulare della mano destra all'indietro per formare una pressione negativa (Figura 3).
Nota: durante questa fase, la posizione della mano destra dell'operatore dovrebbe essere leggermente inferiore rispetto alla tabella di funzionamento per far muovere l'ago verso l'alto e superiore al piano orizzontale. Questo è il motivo per cui l'animale è collocato vicino al bordo del tavolo. - Spostare la siringa in avanti 3-4 mm, ma interrompa se non c'è drenaggio di sangue nella siringa. Poi lentamente tirare indietro la siringa e mantenere la pressione negativa in esso. Nella maggior parte delle occasioni, il sangue entrerebbe nella siringa quando si disegna indietro.
- Una volta che il sangue entra nella siringa, fissare la siringa e mantenere la pressione negativa fino a quando il volume richiesto (200 μL) di sangue viene raccolto nella siringa.
- Dopo la raccolta del sangue, prelevare l'ago di puntura e premere leggermente il sito di puntura con un batuffolo di cotone per 1-2 minuti per fermare il sanguinamento. Poi, riportare i topi alla gabbia.
Nota: occasionalmente, non si poteva ottenere il sangue al suo primo tentativo. Regolare la direzione dell'ago lateralmente e ripetere i passaggi 3.3-3.5. Se 3 tentativi non riescono a ottenere il campione di sangue, passare all'altro lato. - Trasferire il campione di sangue in un tubo eparinizzato.
4. recupero dei topi
- Mentre l'anestesia pentobarbital è in vigore, il recupero di velocità fornendo supporto termico fino a quando il mouse si muove di nuovo.
Representative Results
Abbiamo ripetuto questa procedura in 10 topi di Kunming (maschio n = 5, femmina n = 5, peso 25,4 ± 2,0 g). Nove procedure sono riuscite sul lato destro. Un caso non è riuscito entro 3 tentativi nel lato destro e la raccolta di sangue è riuscita sul lato sinistro. Il corso temporale (dalla puntura all'ottenimento del volume di sangue richiesto) variava tra 35-126 secondi (media 68,4 ± 26,4 s). Il volume della raccolta ematica è stato fissato a circa 200 μL (media 203 ± 11,6 μL). La raccolta di sangue è riuscita entro 1 a 4 tentativi. Il prelievo di sangue è riuscito al primo tentativo in due topi e dopo 4 tentativi in un topo; il campionamento ha preso 2-3 tentativi negli altri topi. Tutti i dati sono stati illustrati nella tabella 1. Tutti gli animali sono sopravvissuti e recuperati entro 30 minuti dopo il prelievo di sangue. Non vi è stata alcuna differenza significativa tra i sessi per tutti i parametri osservati (tabella 1).
Figura 1 : Anestesia generale attraverso iniezione intraperitoneale Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2 : La posizione supina del mouse. Si noti che la distanza tra il margine e il mouse è 2-4 cm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Il sito di puntura e la postura delle mani dell'operatore. Si noti che il dito anulare della mano destra si muove indietro per formare una pressione negativa. La mano sinistra è posizionata lateralmente al sito di puntura per fissare la pelle e i tessuti sottocutanei. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4 : La posizione della vena subclavia, dell'osso della clavicola e della fossa sternale superiore. I corsi di vena subclavia sotto l'osso della clavicola e drenare nella vena cava superiore sotto la fossa sternale superiore. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5 : La relazione tra la parete del vaso e l'ago durante la procedura. A) le pareti della vena subclavia si attaccano l'una all'altra mentre l'ago si muove in avanti, quindi non può essere prelevato sangue. (B) ritirando l'ago all'indietro, le pareti si separano l'una dall'altra e il sangue potrebbe essere prelevato. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
| variabile | Totale (n = 10) | Maschio (n = 5) | Femmina (n = 5) | Valore P |
| Peso corporeo (g) | 25,3 ± 2,2 | 25,3 ± 3,0 | 25,4 ± 1,3 | 0,926 a |
| Volume di sangue (μL) | 203,0 ± 11,6 | 208 ± 13,0 | 198 ± 8,4 | 0,187 a |
| Corso (i) orario (i) | 68,4 ± 26,4 | 70,6 ± 35,1 | 66,2 ± 18,0 | 0,809 a |
| Prelievi | 2,3 ± 0,9 | 2,4 ± 1,1 | 2,2 ± 0,8 | 0,760 a |
| Non c'erano differenze sessuali significative per tutti i parametri osservati, tutti i valori di P > 0.05. | ||||
Tabella 1: parametri osservati tra i sessi
Discussion
Questa relazione rappresenta un'estensione della precedente ricerca sul prelievo di sangue attraverso la puntura della vena subclavia nei ratti11. Poiché il mouse è l'animale di ricerca più comunemente usato, sarebbe prezioso vedere se questa tecnica può anche essere applicata ai topi. La sfida deriva dal diametro relativamente più piccolo della vena subclavia.
Nella ricerca attuale, abbiamo scoperto che la puntura subclavia nei topi è un modo fattibile e affidabile per raccogliere il sangue. Rispetto ai metodi convenzionali come il taglio della vena di coda o la raccolta di sangue orbitale, non ci sono problemi etici del metodo attuale. Tutti gli animali sono sopravvissuti dopo questa procedura senza integratori liquidi dopo circa 200 μL di estrazione del sangue, e gli animali potrebbero essere utilizzati per ulteriori studi sperimentali. Teoricamente, l'estrazione totale del volume del campione non poteva raggiungere più del 10% del volume totale circolante di sangue ogni volta e il volume totale di un animale adulto è 55 a 70 mL/kg di peso corporeo5. Per i topi utilizzati in questa ricerca (21,6-28.3 g), l'estrazione del volume massimo dovrebbe essere di circa 200 μL. Impostiamo quindi la quantità di prelievo di sangue intorno 200 μL per ogni topo. L'incapacità di misurare la pressione sanguigna, la frequenza cardiaca e altri parametri di sollecitazione sono le principali limitazioni di questo rapporto.
Un'anestesia generale sufficiente è un'altra questione importante per garantire il successo della puntura. I topi devono rimanere silenziosi durante la procedura di puntura per evitare il rischio di ferire la nave dall'ago. Abbiamo scoperto che il pentobarbital sodico a 60 mg/kg per l'anestesia generale potrebbe soddisfare la profondità ideale di anestesia. Uno svantaggio di questo agente è il tempo di recupero relativamente lungo (media di circa 30 minuti). In alcuni istituti, l'inalazione di isoflurano viene utilizzata per il breve tempo di recupero e deve essere presa in considerazione come scelta di anestesia alternativa15.
La posizione della vena subclavia è mostrata nella Figura 4. A causa della parete sottile e della bassa pressione nella vena, la parete anteriore e posteriore della vena subclavia si attacca l'una all'altra sotto la pressione di un ago mentre l'ago si muove in avanti (Figura 5a). Mentre si ritira il pistone lentamente all'indietro, le pareti attaccate si separano spontaneamente e la punta dell'ago potrebbe penetrare nella vera cavità della nave e il sangue potrebbe scaricarsi nella siringa sotto pressione negativa sostenuta (Figura 5b). L'uso di un sistema di raccolta del sangue a vuoto16 potrebbe anche favorire la raccolta del sangue. A causa del diametro relativamente piccolo della vena subclavia topi, ci possono essere fallimenti anche per un operatore esperto. Per un novizio, si consiglia la puntura della vena subclavia nei ratti come riportato11. Dopo diversi tentativi di puntura di successo nei ratti, il tasso di successo della puntura della vena subclavia nei topi potrebbe essere significativamente migliorato. Assicurarsi che la posizione esatta della puntura sia solo caudale al centro dell'osso della clavicola. L'ago che si muove verso l'alto e il cranio verso la fossa sternale superiore sono altri punti chiave per garantire una puntura di successo.
In conclusione, la puntura della vena subclavia è un metodo sicuro ed efficace per la raccolta del sangue nei topi. Oltre al taglio della vena di coda e alla raccolta di sangue del plesso retro-orbitale, questo metodo è fattibile, sicuro e adatto per ricerche osservazionali in diversi punti temporali nei topi.
Disclosures
Nessuno ha dichiarato.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina n. 81670269, n. 81500355 e n. 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
