Summary
このプロトコルは、オープン頭蓋骨外傷性脳損傷のマウスモデルの方法論を示し、培養ヒト誘導多能性幹細胞由来細胞を傷害部位に移植する。これらの手順からの結果の行動および組織学的検査も簡単に説明される。
Abstract
外傷性脳損傷(TBI)は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。TBIによる疾患病理学は、一次機械的侮辱から、アポトーシスおよび炎症を含む二次傷害プロセスに進行する。動物のモデリングは、傷害メカニズムを解明し、潜在的な神経保護療法を評価するための検索で貴重でした。このプロトコルは、焦点、オープンヘッドTBIの制御された皮質衝撃(CCI)モデルについて説明します。具体的には、軽度の一方的皮質損傷を産生するためのパラメータが記載されている。CCIの行動結果は、両側感覚運動統合の粘着テープ除去試験を用いて分析される。TBI病理の実験療法に関しては、このプロトコルはまた、培養細胞を脳に移植するプロセスを示す。ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)に由来する神経細胞培養物は、ヒトTBI患者において優れた機能回復を示す可能性のために選択された。宿主マウス脳組織におけるhiPSCの慢性生存は、修飾されたDAB免疫組織化学プロセスを用いて検出される。
Introduction
外傷性脳損傷(TBI)は、頭部への打撃または物体または爆風波からの直接的な損傷による間接的な機械的力(回転加速度/減速または逆クーデター)による脳への後天的損傷の一般的な用語である。TBIは、世界の死亡者の約9%の原因であると推定されており、年間5,000万例の症例が1,2例と推定されています。米国疾病管理予防センターの2017年の報告書によると、2013年には、米国のTBIによる合計280万人の病院訪問と死亡がありました。多くの穏やかなTBAは毎年報告されていません。深刻なTBIは、認知、運動機能、および生活の全体的な質の生涯の障害につながることができます。軽度のTBI、特に反復的なスポーツ関連のTBIの結果は、最近、彼らの陰湿な健康影響4、5のために高く評価されています。
前臨床モデリングは、TBIの新しい機械的洞察と潜在的な修復療法を開発する上で重要な要素です。TBIの制御された皮質衝撃(CCI)モデルは皮質への機械的挫傷のオープンヘッドモデルである。衝撃パラメータは、軽度から重度の6までのCCI傷害を生成するために変更することができます。CCIの傷害は、TBIの他の閉じた頭部モデルと見られるように、拡散ではなく焦点である。CCIは、反対方皮質が内部比較器として機能するように、一方的な傷害を誘発するために行うことができる。このプロトコルは、一次身体感覚および運動領域を包含する皮質の一部に対する軽度のCCIの特性を示す。この皮質領域は、多数の行動検査が傷害による欠陥7を検出できる感覚運動行動への関与のために選ばれた。TBIの治療介入による行動改善も検出できる。
TBIの特徴は、負傷した地域における広範な神経機能障害である。負傷したニューロンは細胞死を受け、ニューロンネットワーク接続は8,9.TBIは内因性幹細胞の募集を妨害し、さらに下流行動の赤字10,11を引き起こした。 神経幹細胞と幹細胞由来細胞の移植は、傷ついた脳の機能を回復させる可能性として探求されている。損傷した神経回路を回復させる可能性に加えて、移植された細胞は、TBI12からの神経生存および機能回復を促進するパラクリン効果を発揮する。様々な細胞型が前臨床移植され、神経疾患13、14、15のモデルにおけるそれらの修復可能性を評価した。誘導多能性幹細胞技術16の最近の普及は、実験的使用のための多数のヒト幹細胞株の開発を促進している。hiPSC由来細胞による前臨床試験は、ヒト疾患に対する特定の細胞株の潜在的な治療有効性を特徴付ける重要な第一歩である。本研究室では、外傷性脳損傷からの回復を支援する移植可能な細胞を追求するために、hiPSCを神経型17に区別するためのプロトコルを開発した。
このプロトコルの実験は、一方的なCCIを使用して、成体マウスの左身体感覚および運動皮質にTBIを誘導する。軽度のCCI損傷は、機能回復に対するhiPSC由来神経細胞移植の影響を追跡するために使用される右前足の持続的な機能的欠損をもたらす。このプロトコルにおけるフォアポーセンサ運動試験は、Bouetおよび同僚18によって確立された方法論から適応され、フレミングと同僚19によって以前に実証された。 このプロトコルは、実験的脳損傷、hiPS細胞の治療移植、および実験結果測定の行動および組織学的分析を行うための完全なワークフローを概説する。
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Protocol
このプロトコルに記載されているすべての実験は、ユニフォームサービス大学動物ケアおよび使用委員会によってレビューされ、承認されました。
1. 頭蓋切除術と制御された皮質影響
- 制御された皮質衝撃装置および外科用品の準備。
- 創傷灌漑用の無菌生理生理生殖水の0.5 mLで1 mLのスリップチップシリンジをロードします。25Gの針を注射器に取り付けて灌漑を制御します。
- 1mg/mLの最終濃度にDMSOでCsAの希釈溶液を調出します。免疫抑制のためのシクロスポリンA(CsA)溶液の0.5 mLで2番目の1 mLスリップチップシリンジをロードします。25G以上の針をCsAシリンジに取り付けます。
- 制御された皮質衝撃ピストンを立体フレームのアームに取り付け、15°の角度に設定します。3mmのインパクトプローブをピストンに取り付けます。
- 衝撃速度を 1.5 m/s に設定し、衝撃のドッディング時間を 0.1 s に設定して、軽度の皮質損傷を引き起こす。
- 一方的な頭蓋切除術を行う
- 圧縮酸素源を持つイソファル気化器に接続された麻酔誘導室にマウスを置きます。~0.7 L/分酸素で~3%イソファランで麻酔を誘導する。つま先ピンチに対する応答の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
- 電気バリカンを使用して頭皮を剃り、緩い毛皮を拭き取ります。
- マウスを麻酔配達鼻コーンを付けた立体フレームに入れます。
- マウスの下の立体フレームに37°Cに設定された温めパッドを置き、麻酔下で体温を維持します。耳の棒と一口棒で頭を固定し、頭蓋骨の前頭骨が水平になっきる方向に頭を向けます。手術期間中、約1.5%-2%のイソファランで麻酔を維持する。
- 術前ケアおよび無菌外科的製剤を行うには、無菌綿棒を使用して目に抗生物質眼科のオトメントを適用する。剃った頭皮の領域にヨウ素ベースの溶液を適用します。70%エタノールでこれを取り除きます。頭の上が見えるが目が覆われているように、フェネルスの外科ドレープで動物を覆います。
- メスやはさみを使用して頭皮に中線切開(1.5〜2センチメートル)を作ります。 無菌綿棒を使用して傷をきれいにし、ブレグマで中線左の筋膜をクリアします。
- インパクトプローブを使用して、頭蓋切除部位を特定します。
- 立体基準点(X = 0、Y = 0)をブレグマに設定します。 プローブを中間線の左 2 mm に横に調整します。細かい先端の外科的に安全なマーカーを使用して、プローブの周りに5mmの直径の円を輪郭を描きます。インパクトを上げて回転させます。
- 高速ロータリーマイクロモーターキットハンドツールを使用して、最大速度~70%~80%のラウンドチップ0.6mmまたは0.8mmバリドリルビットを使用して頭蓋骨に開いた穴を作ります。この境界線を細くするために5mmの円周輪郭に沿って掘削しながら、頭蓋骨に光圧を加える。
- 掘削中は余分な圧力をかけない。振動、圧縮、または偶発的な浸透による皮質損傷を引き起こす可能性があります。ドリルビットの速度で作業を行います。
- 頭蓋骨の余分な摩擦加熱を避けるためにあまりにも長い間、任意の特定のスポットにドリルしないでください。破片を取り除き、回転ツールからの加熱を減らすために、滅菌生理生理で時折頭蓋切除術を灌漑します。
- これらの点は出血に対して脆弱であるので、コロナ縫合線の上に掘削しながら細心の注意を払ってください。
- 頭蓋骨切開の輪郭が十分に薄くなったときに、細かいピンセットを使用して頭蓋骨のフラップを取り除きます。フラップを中間的につかみ、放射状の動きで横にゆっくりと持ち上げて引きます。
- フラップを持ち上げるときにデュラマターを損傷しないでください。これは、重度の傷害や出血を引き起こす可能性があります。
- 軽度の制御された皮質衝撃損傷を行う
- 無菌アルコール準備パッドでインパクタープローブをきれいにします。インパクタープローブを露出した皮質の上の位置に戻します。プローブがデュラマター表面に触れるまで下げます。この位置を Z = 0 としてマークします。
- ピストンを引き出し、Z = -1.0 mm に移動します。
- 素早くピストンを上げ、アームを位置から外します。損傷後に皮質を刺激するために生理食生の寛大な量を適用します。必要に応じて生理生理生理知で手術部位をすすいで、5.0シルク縫合糸で簡単に中断したステッチを使用して頭皮切開を縫合します。
- マウスの術後ケアを行う
- 麻酔を中止する。皮下注射によりCsAを10mg/kgの用量でスクラフに投与する。マウスを清潔で温めた術後ケージに入れなさい。
- 1.0 mg/mLで飲料水中のアセトアミノフェン鎮痛薬を提供します。
注:適切なIACUC標準の操作手順に従い、実験結果変数(例えば、鎮食、神経炎症)を考慮して鎮食剤を提供する。 - 水分補給と回復を支援するために、温められた回復ケージで湿ったチョウの食べ物を提供します。
- 頭蓋切除術(シャム)コントロールを実行する場合は、セクション2からセクション4に進みます。
2. 細胞懸濁液の立体移植
- 頭蓋切除術後約24時間の細胞移植手順を開始する。
- 細胞移植装置と外科用品の準備
- 創傷灌漑用の無菌生理生殖器で1mLのスリップチップ注射器を充填します。25Gの針を注射器に取り付けて灌漑を制御します。
- 免疫抑制のためのCsA溶液で1 mLスリップチップシリンジを充填します。25G以上の針をCsAシリンジに取り付けます。手術の間に必要に応じてCsA注射器を補充する。
- 標準的な方法を使用して1.0 mm ODホウケイ酸塩ガラスキャピラリーピペットからガラス針を準備します。
- 細かいピンセットを使用して、針の先端を約 200 μm の直径に折ります。針の円筒軸が2.5 cmを超えていないことを確認します。
- 10 μL シリンジで使用するシリンジポンプを校正します。 流量 0.2 μL/min を入力して、総体積を 2.0 μL にします。
- ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)懸濁液を調造する。
- 標準的な滅菌処理技術を使用して、細胞培養BSL-2フード内のすべての細胞処理を実行します。
- 細胞型に対して定義された標準条件に従って、あらかじめ細胞培養を準備する。例として、リシュカら17を参照してください。
注:このデモで示す実験では、hiPSC由来の様々な神経表現型細胞を用いた。 - 細胞剥離溶液、またはその他の好ましい酵素または化学的手段を使用して、細胞を単細胞懸濁液に穏やかに解離する。
- 懸濁液中の細胞をカウントし、その後、1.7 mLフリップトップ試験管内の最小細胞培養培地(例えば、DMEM)で懸濁液を5 x 104セル/μLに希釈する。
- 移植に関する次の注意事項に従います。
- 手順の間、37 °Cで懸濁液中の細胞を維持します。
- イントラレンキマル注射を行う直前に注射器をロードしてください(下のステップ4.5)。
注:重力は、セルサスペンションが落ち着くか、その側に置かれた場合、シリンジの側面にしがみつく可能性があります。これは、注入された細胞の数の不規則性につながる。 - 1日で複数の細胞移植手順を行う場合は、マウス当たり約5 x 105細胞(10μL懸濁液)を割り当てる。
- 立体移植手術の実行
- 圧縮酸素源を持つイソファル気化器に接続された麻酔誘導室にマウスを置きます。~0.7 L/分酸素で~3%イソファランで麻酔を誘導する。
- 麻酔鼻コーンを取り付けた立体フレームにマウスを置きます。
- 耳の棒と一口棒で頭を固定し、頭蓋骨の前頭骨が水平になっきる方向に頭を向けます。手術期間中、約1.5%-2%のイソファランで麻酔を維持する。
- 術前ケアと無菌製剤の実施
- 綿棒を使用して目に抗生物質を含む水和眼学のチントを適用します。
- 滅菌生理生理生殖器で切開部位を洗浄し、部位をきれいにし、縫合糸を緩めます。綿棒で70%エタノールを静かに塗布し、切開部位を殺菌します。
- 細かいピンセットと眼用ハサミを使用して縫合糸を取り除きます。豊富な無菌生理生殖を伴う灌漑部位および頭蓋切除術。
- 皮質が過度のヘルニア、変色、血管の乱れ、出血などの不適格な特性を表示する場合は、除外のために動物を検討してください。
- 細胞移植注射器をロードする
- 細胞懸濁液を37°Cインキュベーターから細胞培養バイオセーフティフードに移動します。チューブをゆっくりと旋回またはタップして、均質な細胞懸濁液を確保します。
- マイクロピフェッタを使用して、プランジャー端を通してハミルトンシリンジに約7.5 μLセルサスペンションをロードします。
- プランジャーの端を下向きにして、シリンジを約120°の角度で保持します。プランジャーを挿入し、サスペンションとプランジャーチップの間に気泡を発生させないように注意してください。
- ガスケットアセンブリをピペット針に取り付け、注射器に針を取り付けます。
- プランジャーを押して、細胞懸濁液をピペット針に移動します。 懸濁液の流出に対する耐性がある場合は、細かいピンセットを使用して針先を折り、直径を拡大します。
- シリンジをステレオタックスシリンジポンプに取り付けます。 プランジャーを進め、シリンジポンプアセンブリが正しく動作していることを確認します。
- 注射のために針を座標に移動します。
- 針先をブレグマに合わせます。X 座標と Y 座標を 0 に設定します。その後、針の先端を頭蓋切除術の上に2.0mmの横向きに、-1.0mm後部をブレグマに移動します。 針先をデュラマターサーフェスにタッチし、立体座標をZ = 0に設定します。
- 脳に針を導入する前に、細胞懸濁液が十分に流れていることを確認するためにプランジャーを押します。
- 脳に針を入れてZ = -1.4 mmの深さに入れ。これらの立体座標は、深い皮質20の灰色物質白質境界に移植片を置く。
- シリンジポンプを起動してセルサスペンションを注入します。ラボベンチタイマーを15分に設定し、タイマーを開始します。長い作業距離顕微鏡を使用して、細胞懸濁液の流出を監視します。
- 組織の水分補給を維持するために注射中に無菌生理生理生殖術で手術部位を灌漑する。
- 15分で、ゆっくりと移植針を引き出す。 生理理生理で手術部位を灌漑し、縫合糸で切開部を閉じます。
- 術後ケアの実行
- 麻酔を中止する。皮下注射によりCsAを10mg/kgの用量でスクラフに投与する。マウスを清潔で温めた術後ケージに入れなさい。
- 1.0 mg/mLで飲料水中のアセトアミノフェン鎮痛薬を提供します。
注:適切なIACUC標準動作プロトコル(SOP)に従い、実験的な結果変数を考慮して鎮鎮鎮剤を提供します。 - 水分補給と回復を支援するために、湿ったチョウ食品回収ケージを提供します。
- マウスの生存期間を通じて 10 mg/kg で毎日 CsA 注射を続ける.
3. 官能運動統合の粘着テープ除去試験
- 動作テストを行う前に、小さなかみそりナイフを使用して、電気テープを3mm x 5mmのストリップに切ります。接着剤ストリップを切断するための滑らかなガラス表面を使用してください。
注:マウスは、これらの色21を区別するのが難しいように、黄色と赤のテープを使用してください。- 透明なプラスチック製の箱の中によく収まる小さなミラーを選択します。
- 下から動物の行動を見るために、粘土や粘着テープをモデリングして、約45°の角度でミラーを固定します。
- ボックスとミラーアセンブリを静かな専用動作テストルームのベンチに置きます。 鏡の上のプラスチック製の箱にシリンダーを配置します。
- 取り扱い布、ピンセット、粘着ストリップを、動作テストボックスの横のベンチに配置します。
- 70%のエタノールとペーパータオルで箱とシリンダーをきれいにします。 表面を完全に乾燥させます。
- マウスを行動検査室に連れて行きます。マウスが行動テストの前に少なくとも30分間試験室に順応できるようにします。
- テスト中に排尿イベントを最小限に抑えるためにケージから水の供給を取り除き、効率的なテスト性能を妨げる可能性があります。
- 透明なプラスチック製の箱の中によく収まる小さなミラーを選択します。
- 接着剤除去試験を行う
注: この動作テストは、ストップウォッチを操作する研究者が 2 ~ 3 人、マウスを処理して動作を観察する場合の 1 つ、および 2 つの調査者によって実行されるのが最適です。- 各ツイザを使用して、各色の1つの接着剤ストリップを剥がします。
- どのストリップカラーがどのフォアポーに対応するかを選択し、トライアルを通じて一貫性を保つ。
- ハンドリングクロスを使用して、首と背中の擦り傷によってマウスを拘束し、マウスが前足を体と頭から遠ざける。
- ピンセットを使用して、各前足の足底面に接着剤ストリップを配置します。繊細で一貫した指圧を使用して、足にストリップを固定します。
- マウスをプラスチック製のシリンダーに素早く入れます。マウスがプラスチック製のボックスに4本の足をすべて持っているときに、2つのストップウォッチを起動します。
- 2 つのストップウォッチを使用して、左足通知、左足除去、右足の注意、右足の取り外しの 4 つのイベントの遅延を記録します。
- 動物が足を振ったり、ひったり、ストリップを噛んだりして、接着剤ストリップを明確に認識する場合は、通知イベントを記録します。
- 動物が効果的に前足底の表面からストリップを削除するときに削除イベントを記録します。
注: 削除イベントは、ストリップ読み取りまたはストリップがフォアポーの横面にしがみつく場合に失格になりません。 - 対応するストリップが取り外されていない場合は、タイマーを 120 s で停止します。
- データ シート上の 4 つのイベントの経過時間を記録します。
- 各マウスで 2 回目の試行を実行する
- 個々のマウスの試行の間に最低5分を経過させてストレスを軽減し、テストの効率的なパフォーマンスを妨げる可能性があります。
- 単一のケージから複数のマウスをテストする場合は、テストマウスの間にペーパータオルで装置をきれいにし、廃棄物を除去します。
- 複数のケージからマウスをテストする場合は、70%のエタノールとペーパータオルで装置を徹底的に洗浄します。
- セッションの 2 回目の試行では、色の配置順序を逆にして、色の効果をランダム化します。
- 各動物の 1 日のセッションごとに 2 つの試行の間の各イベントの平均待機時間を計算します。
- 各ツイザを使用して、各色の1つの接着剤ストリップを剥がします。
- 装置と布を水で十分に清掃し、ケージの水を交換し、マウスを保持施設に戻します。
- 繰り返し測定トライアル設計のための連続した実験時間ポイントで手順 3.1-3.2 を繰り返します。
注: 動物をタスクに順応させるために、データ収集の前に 5 日間毎日手順 3.2.1-3.2.5.3 を繰り返します。手術前のベースラインデータ取得をお勧めします。
4. ジアミノベンジジン(DAB)移植片生存および傷害病理の免疫組織化学分析
- 動物を安楽死させ、心膜灌流を行う。
- PBSで0.1Mリン酸緩衝生理食生(PBS)および4%パラホルムアルデヒド(PFA)の溶液を調製する。両方のソリューションの pH を 7.4 にバランスさせます。
- 2つの溶液をヒュームフードの氷の上に置きます。フュームフードに蠕動ポンプを置き、PBSでチューブを満たすためにポンプを実行します。ポンプの流量を~7ml/分に設定します。 25G針をポンプの流出管に接続します。
- フードに柔らかい基板を備えた排水トレイを置きます。灌流液が下端まで排出するように、トレイの一方の端をわずかな角度で上げます。
- 麻酔誘導室にマウスを置きます。圧縮された100%酸素車のガスを使用して4%のイソファランでチャンバーを埋めます。
- 麻酔マウスをチャンバーから鼻コーンに移動します。イソファランを2%に減らす。
- 心臓を露出させるために胸部切り裂剖を行う。胸部切除は安楽死を引き起こすので、麻酔を中止する。
- 心臓の長い軸に沿って左心室に灌流ポンプの流出針を慎重に置きます。これは貧しい灌流を引き起こすので、心臓中隔を突き刺さらさらしないでください。
- 右のアトリウムをカットするために小さなはさみを使用し、すぐに蠕動ポンプをオンにします。
- 右心房を離れる流体が血液から消えるまでPBSの流れを続けます。
- ポンプの電源を切れポンプ吸気管をPFAの容器に移動します。ポンプを再起動します。動物が十分に剛性になるまで、または20 mLの体積がポンプでくみ上げになるまで、PFAを注入し続けます。
- ポンプの電源を切れ心臓から流出針を取り外します。吸気管をPFAからPBSに移動し、チューブからPFAを完全に洗い流します。
- 慎重な解剖によって頭蓋骨から脳を取り除く。4%のパラホルムアルデヒドで満たされた小さな容器に脳を置き、脳が4°Cで一晩後に修正できるようにします。
- 固定後の翌日に、PをPBSと0.1%のアジドナトリウムに置き換えます。このソリューションに脳を保存し、解剖の準備を行います。
- 凍結マイクロトームまたは室温ビブラートームを介してホルムアルデヒド固定脳組織の40-50 μmセクションを収集します。
- 水中の0.3%過酸化水素中のプレトリート組織は、内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、非特異的染色を生じさせることができる。
- クエン酸バッファー(クエン酸ナトリウム10m、ポリソルベート-20、pH 6.0)を60°Cで30分間使用して抗原検索を行います。
- 標準的な方法で抗体標識を行う。 ルンデルら' を参照してください。詳細については、この研究室から22を報告します。
- 内因性抗体との交差反応性を低減するには、マウスIgG中和キット(材料の表を参照)を使用してください。IgG中和バッファー内の組織を室温(RT)で少なくとも1時間インキュベートし、メーカーの指示に従ってインキュベートします。
- ヒトiPSC由来細胞を移植する際には、マウス抗ヒト核抗原原抗体(hNA;1:500希釈)を使用して移植細胞を見つけます。穏やかな撹拌を用いて4°Cで一次抗体を用いて組織を48~72時間インキュベートする。
- 一次抗体溶液を洗い流した後、HRP結合抗マウス二次抗体を用いた組織をRTで2時間希釈1:250希釈する。
- 標準的な方法でDAB染色体反応を行い、免疫標識を明らかにする。Rtで5~10分間DAB反応を発育できるようにします。
- 染色したティッシュをスライドに取り付け、標準的な方法でカバースリップを適用します。
- 前述の23,24のように、公平なステレオタイプを使用して標識された細胞の数を定量化する。20 μm の光学セクションと 3 の断面間隔を使用して解析を実行します。
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Representative Results
頭蓋切除手術は、実験的な脳損傷と治療細胞移植を容易にする:脳損傷およびその後の細胞移植療法の制御された皮質衝撃モデルは、上の頭蓋骨の慎重な除去を必要とする。頭蓋切除術は、目的の脳領域への操作を可能にするために、頭蓋骨の任意の後部面で行われてもよい。図1の図は、原発性身体感覚および運動皮質を明らかにするために、直径5mmの頭蓋切除術の回路図を示している(図1A)。頭蓋切除術後24時間に、ヒトiPSC由来神経細胞懸濁液を皮質の深層に注入する2回目の手術を行った(図1B)。いくつかの脳浮腫は、頭蓋切除術の後の最初の日、特にCCIの後に正常である。しかし、この手順のすべての段階で脳血管系スペアリングは、皮質の生存のために重要です。図2は、最小限の脳ヘルニア、最小限の出血、および広範な皮質血管化を伴うマウスにおける細胞移植手順を示す。これらの特徴は成功した外科のよい予後の指標である。
粘着テープ除去試験は、一方的な脳損傷後の感覚運動障害を明らかにする:上述の脳損傷モデルのパラメータは、前肢感覚および運動機能に影響を与えると予測された。粘着テープ除去試験は、前肢機能欠損の重症度、および細胞移植の潜在的な治療上の利点を評価するために選択された。マウスは5日間の試験手順で訓練を受け、その後、ベースライン挙動試験の前に2日間休息させた。手術はベースライン試験の翌日に行われた。本研究における行動試験は、術後1日目、3日目、5日目、7日目、10日目、14日、21日、28日、35日目、および42日目に行われた。図3は、頭蓋骨切除術単独(シャム)とCCI損傷を有するマウスの前肢機能をナイーブマウスの前肢機能と比較したパイロット実験の結果を示す(n=11ナイーブ、12シャム、11 CCI)。手術を受けたマウスは、手術直後の1~3日間、一過性の遅延増加を示した(図3A,B)。 マウスは、前駆体からの接着剤除去において一時的な術後欠損を示した(図3C)。しかし、CCIを受けたマウスは、術後28日目までのナイーブマウスと比較して、損傷に対して逆に前足の運動性能に著しい欠損を示した(図3D)。これらのデータはまた、CCIを持たない頭蓋骨マウスにおける感覚運動喪失の予想外の重症度を記述し、この領域に対する外科的頭蓋骨切除もTBI関連の神経機能障害を誘発することを示す。
マウス脳切片におけるヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)由来細胞移植片の免疫検出:ヒトiPSC由来神経細胞がマウス脳における長期移植を生き残るかどうかを決定する実験を行った。iPSCに由来するヒト神経幹細胞(NSC)は、確立された方法17を用いてインビトロで未熟なニューロンまたは星状細胞のいずれかに分化した。3つの神経細胞表現型のそれぞれの移植は、上述の手順を用いて外傷性脳損傷のCCIモデルで試験し、図2に示した。マウスを移植後7日目に組織学的分析のために安楽死させた。マウス脳切片をヒト核抗原(hNA)に対して免疫染色した。ヒト細胞移植片は、偽の手術およびCCI脳における宿主組織と明確に区別することができる(図4)。アストロサイト移植片(n=3シャム、2CCI)は、NSC(n=12シャム、15CCI)およびニューロン(n=11シャム、10 CCI)と比較して生存率が低く、将来の実験では考慮されなかった。
図 1: 外科的操作の座標パラメータ。興味のあるマウスの脳領域の漫画の描写。赤い円は、直径約5mmの頭蓋切除術を示す。赤い十字は、頭蓋骨切除の中心点を2mm横からブレグマに示す。(A)上図の大脳皮質のシェード領域は、下図に示すように頭蓋切除術を行った場合に軽度のCCIの影響を受ける。(B)上図の青い矢印は、皮質面からの深さ1.4mmの細胞注入のおおよその位置を示しています。下図の青い十字は、細胞注入2mm横および1mm後部のブレグマの配置を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 細胞懸濁液注入の術中モニタリング。閉トラレンキマル細胞注射中に長時間の作業距離顕微鏡を介して撮影した写真。解剖学的特徴は明快さのためにアヌター化される。頭皮は、手術中の脱水を最小限に抑えるために手術部位を部分的に覆い隠します。示されているように針の浸透中に軽度の出血が起こる可能性があり、大きな皮質血管が無傷のままである場合、心配の原因にはならない。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 脳損傷後の感覚運動統合の行動評価頭蓋切除術およびCCIを受けたマウスは、ナイーブコントロールと、偽の手術のみを受けたマウスと比較した(n= 11ナイーブ、12シャム、11 CCI)。データはグループ平均遅延として提示され、CCIを受けたマウスは、最初の術後の日に前足に適用される接着剤刺激を認識するために遅延が増加したことを示す誤差バーを示す。(B)頭蓋切除術またはCCIを受けたマウスは、術後1および3日目に反対前足に適用される接着剤刺激に気付くために実質的に増加した待ち時間を示した。(C)頭蓋切除術またはCCIを受けたマウスは、術後1および3日目に前足から接着剤刺激を除去するために実質的に増加した待ち時間を示した。(D)頭蓋切除術またはCCIを受けたマウスは、術後1-5日目に反対前足から接着剤刺激を除去するために実質的に増加した待ち時間を示した。CCIを有するマウスの運動障害は、傷害後28日間強く持続した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: マウス脳におけるヒト細胞移植片に対するDAB免疫組織化学ヒトiPSCは、インビトロで神経幹細胞(NSC)、ニューロン、または星状細胞に分化した。細胞培養物は、CCIの有無にかかわらずマウス脳に移植した。マウスは細胞移植の7日後に組織学的分析のために安楽死させた。顕微鏡写真は、ヒト核抗原染色の代表的な結果を示す。黒いインセットは、細胞数(シアン)および移植片体積(赤)の立体的定量のためのマーカーを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
実験再生療法の試験モデルシステムとしての軽度CCI
CCIモデルは皮質への機械的損傷の後の組織機能不全のメカニズムを調査するための貴重な用具である。傷害の変数の力性はこのモデルの魅力的な特徴である。衝撃のZ深度を変化させる、速度、または所望時間は、研究者が所望する傷害の重症度を、研究者10、25によって増減させることができる。連続性脳損傷の軽度のCCIモデルは、正しく行われると、適度な皮質細胞死および最小限のキャビテーションを引き起こすはずである。頭蓋切除術と頭蓋骨フラップ除去は細心の注意を払って行う必要があります。頭蓋切除トトレンチの掘削中に過度の下方力が加えられ、加熱や振動による皮質損傷を引き起こす可能性があります。頭蓋骨のフラップ除去中の硬膜の機械的破壊は、ほぼ均一に重度の皮質損傷を予測する。主要な皮質血管の破壊は皮質の過度の病変をもたらす可能性があり、実験から動物を除外する根拠である。残念ながら、悪化した怪我の兆候は、手術の翌日に微妙なことができます。水腫も小さな皮質血管破裂も必ずしも負の指標ではない。虚血による血腫および異常な着色は外科的合併症のより明確な指標である。術中イベントを文書化し、合併症を細胞病理学的結果と相関させることは、良好な頭蓋切除術技術を精製するために重要である。
動物におけるmTBIモデリングには、特定の注意事項が付属していることに留意する必要があります。ここで提示されるモデル以外のmTBIの多数の前臨床モデルがある。実験TBIは、機械的な力、空気を通して波を吹き飛さ、またはこれらの力26、27、28の組み合わせを介して誘導することができる。軽度から重度の傷害は、組織病理学的および行動的結果の組み合わせによって判断される(ペトラグリア29およびシーボルト30でレビュー)。げっ歯類の行動障害は数日から31週間以内に解決できるのに対し、ヒトmTBI患者の欠損は脳震盪後症候群32の形で数ヶ月間持続する可能性がある。臨床mTBIの完全なアナログである単一のモデルはないが、前臨床試験は人間の状態で評価できない生理学的メカニズムを明らかにする。
細胞移植手順で最も重要なステップは、細胞懸濁液の取り扱いと注射です。大まかな取り扱いは細胞リシスを引き起こし、粘着性ゲノムDNAの放出と生存する懸濁細胞の凝集につながる。針の先端の直径は懸濁液の滑らかな流出を可能にするのに十分な広さでなければならない;制限された流れは針の中の懸濁液として不連続な配達を引き起こす。このプロトコルに従い、ここで説明する落とし穴を避けると、7日間の生存時間の後に堅牢な移植片が見えました(図4)。前臨床モデルにおける長期移植片生存は、このアプローチの潜在的な治療有効性を決定する鍵となる。
粘着テープ除去試験を連結脳損傷モデリングに応用
接着剤除去テストは、接着剤刺激を除去するために遅延の増加の面で肯定的な神経学的欠損を明らかにします。このテストの主な潜在的な欠点は、傷害に関連しない要因によるパフォーマンスの阻害の可能性です。ストレスを処理すると、マウス探索的挙動を減少させることができるので、動物はベースラインデータ収集の前に広範な拘束順応を受けることが重要である。排尿関連の凍結イベントを軽減するためには、試験前に少なくとも30分は水の供給を取り除く必要があります。最後に、動物が不慣れな動物からの臭いの手がかりの調査スニッフィングに気を取られる可能性があるため、試験装置は頻繁に洗浄する必要があります。
ここで提示された結果は、傷害後28日まで軽度のCCIに対して反対に有意なフォアポー運動欠損を示す。対照的に、シリンダー試験34および加速ロタロッド3を用いる同時試験は、5〜10日以内に解決した傷害誘発機能障害を示した(データは示されていない)。粘着テープ除去は、感覚運動統合挙動における一方的な欠陥を評価する様々な実験で使用されてきた7,35. この試験は最近、頸部脊髄損傷36に対する回生介入後の運動機能回復を評価するためにも用いられた。このテストの性能の動的範囲は異なった強さの接着剤を選ぶことによって待ち時間か種の変化のために調整することができる。ここで、3M電気テープは、可酸性、耐久性、および軽度のCCIに続く刺激を除去する実質的に増加した待ち時間に基づいてマウスに最適な刺激であることを示唆している。ここに示す予備実験は細胞移植と行動試験を組み合わせたものではないが、当研究室で進行中の実験では、56歳の脳損傷による感覚運動行動回復に対する移植生存と同時作用を評価する。移植後の日数。
ヒト細胞移植片のDAB免疫検出に対する精製
DAB免疫組織化学は、その後の立体的定量のためにマウス組織中のヒト細胞の強く、持続的な標識を作り出すために選ばれた。過酸化水素による前処理は、赤血球の内因性ペルオキシダーゼによる脳組織の非特異的染色を減少させるために重要である。これらの実験における非特異的染色は、マウスIgG中和キットを用いてさらに低減した。このキットは、TBI37の後に脳組織に散在することができる内因性マウスIgGの抗原性を減らすために独自の化学物質を使用しています。初期の試みは、マウス抗hNA一次抗体、ビオチン結合二次抗体、およびベクター研究所ABCキットを用いたストレプトアビジン-HRPコンジュゲート三次標識の組み合わせを採用した。ABCコンジュゲートは、頭蓋骨切除術に対する皮質イプシラルにおいて広範な非特異的DAB染色を示した(データは示さない)。その後の染色試験では、HRPと直接結合した二次抗体を用いた。この改変プロトコルは、すべてのhiPS由来細胞型および手術条件に対してバックグラウンドを大幅に低減した高解像度核染色を生成する(図4)。この改変DAB染色技術を用いて、この実験室からの未発表の実験は、軽度のCCIの56日後にマウス脳のhNA陽性細胞を検出する。全体的に、バイナリ抗体標識手順は、従来の三次標識ABCキット手順と比較して時間を節約し、より明確な免疫染色を生み出した。このプロトコルは、マウス中枢神経系に移植されたヒト細胞の他の前臨床研究に有用である可能性がある。
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Disclosures
著者は、開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、神経科学再生医療センター(CNRM、助成番号G170244014)からの助成金によって支援されました。我々は、接着剤除去パイロット研究におけるマヒマ・デューワンとクララ・セルブレードの支援に感謝します。クライスレーヌ・ラドムスキーは予備的な脳損傷と細胞移植手術を行った。USU CNRM前臨床研究コアラボのアマンダ・フーとローラ・タッカーは、それぞれ動物の手術と行動検査に関する貴重なアドバイスを提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
- Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
- Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
- Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
- Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280 (2014).
- Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
- Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).
- Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
- Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
- Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
- Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
- Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
- Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
- Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
- Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
- Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
- Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S.
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
- Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
- Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
- Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).
