Summary
该协议演示了开放颅外脑损伤小鼠模型的方法,以及将培养的人类诱导多能干细胞衍生细胞移植到损伤部位的方法。对这些程序的结果的行为和组织学测试也进行了简要描述。
Abstract
创伤性脑损伤 (TBI) 是全世界发病率和死亡率的主要原因。TBI引起的疾病病理学从初级机械损伤进展到继发性损伤过程,包括凋亡和炎症。动物建模在探索解开损伤机制和评估潜在的神经保护疗法方面很有价值。该协议描述了焦、开头TBI的受控皮质冲击(CCI)模型。具体来说,描述了产生轻度单侧皮质损伤的参数。利用双边传感器电机集成的胶带去除试验,分析了CCI的行为后果。关于TBI病理学的实验治疗,该方案还说明了将培养细胞移植到大脑中的过程。从人类诱导多能干细胞(hiPSCs)中提取的神经细胞培养物被选择,因为他们有可能在人类TBI患者中表现出卓越的功能恢复。使用经过修饰的DAB免疫组织化学过程检测宿主小鼠脑组织中的hiPSC的慢性存活率。
Introduction
创伤性脑损伤 (TBI) 是因头部受到打击的间接机械力(旋转加速/减速或反向冲动)或物体或爆炸波的直接损坏而对大脑的习得损伤的一般术语。据估计,TBI是全世界约9%的死亡原因,每年约5000万例,每年1、2。美国疾病控制和预防中心2017年的一份报告估计,2013年,美国共有280万人次因TBI而住院和死亡。许多较温和的 TbIs 每年都会不报告。严重的TBI会导致终生的认知、运动功能和整体生活质量受损。轻度TBI的后果,特别是重复性运动相关的TBI,直到最近才被人们所认识,因为他们阴险的健康影响4,5。
临床前建模是开发TBI新的机械见解和潜在的恢复性治疗的重要组成部分。TBI受控皮质冲击(CCI)模型是机械挫伤皮层的开头模型。冲击参数可以修改,以产生CCI伤害,范围从轻度到严重6。CCI 伤害是焦点而不是扩散,如 TBI 的其他闭头模型所示。CCI 可以诱导单侧损伤,使反向皮层可以用作内部比较器。该协议演示了轻度 CCI 对皮层的一部分的特性,包括原发性躯体感觉和运动区域。这个皮质区域被选择是由于其参与感觉运动行为,其中许多行为测试可以检测损伤引起的缺陷7。TBI治疗干预引起的行为改善也可以被检测到。
TBI的一个标志是受伤地区普遍存在的神经功能障碍。受伤的神经元会经历细胞死亡,神经元网络连接中断8,9。TBI干扰了内源性干细胞的招募,导致下游行为进一步缺陷10,11。 神经干细胞和干细胞衍生细胞的移植已被探索为恢复受伤大脑功能的可能性。除了恢复受损神经回路的潜力外,移植细胞还发挥副体作用,促进TBI12的神经元生存和功能恢复。各种细胞类型已被移植临床前,以评估其恢复潜力在神经疾病模型13,14,15。最近普及的诱导多能干细胞技术16促进了许多人类干细胞系的实验应用的发展。使用hiPSC衍生细胞进行临床前测试是描述特定细胞系对人类疾病的潜在疗效的重要的第一步。该实验室已开发出将hiPSC区分为神经表型17的协议,以寻求可移植细胞,以帮助从创伤性脑损伤中恢复。
该协议的实验使用单侧CCI诱导成年小鼠的左躯体感觉和运动皮层TBI。轻度 CCI 损伤导致右前爪持续功能缺陷,用于跟踪 hiPSC 衍生神经细胞移植对功能恢复的影响。该协议中的前爪传感器运动测试是改编自布埃特及其18位同事制定的方法,之前由弗莱明和同事19演示。 该协议概述了执行实验性脑损伤、hiPS细胞治疗移植以及实验结果测量的行为和组织分析的完整工作流程。
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Protocol
本议定书中描述的所有实验都经过统一服务大学动物护理和使用委员会的审查和批准。
1. 颅内切除术和控制性皮质影响
- 准备受控皮质冲击装置和手术用品。
- 装载 1 mL 滑尖注射器,带 0.5 mL 无菌盐水,用于伤口灌溉。将 25 G 针头连接到注射器以控制灌溉。
- 在 DMSO 中制备一种加辛溶液,最终浓度为 1 mg/mL。加载第二个 1 mL 滑尖注射器,使用 0.5 mL 环孢菌素 A (CsA) 溶液进行免疫抑制。将 25 G 或更大的针头连接到 CsA 注射器。
- 将受控的皮质冲击活塞连接到立体框架上的手臂,并设置为 15° 的角度。将 3 mm 冲击器探头连接到活塞。
- 将撞击速度设置为 1.5 m/s,将撞击时间设置为 0.1 s,以产生轻度皮质损伤。
- 进行单侧颅切除术
- 将鼠标放入与带压缩氧源的异常鲁兰蒸发器相连的麻醉感应室中。在±0.7 L/min氧气下诱导麻醉,用±3%的异常鲁兰。检查麻醉的深度,因为对脚趾捏缺乏反应。
- 使用电动剪子刮头皮,擦去任何松散的毛皮。
- 将鼠标置于带有麻醉剂传送鼻锥的立体框架中。
- 将加热垫设置为 37°C 放在鼠标下方的立体框架上,以保持麻醉下的体温。用耳条和咬杆固定头部,并定向头部,使头骨正面骨水平。在手术期间,将麻醉保持在±1.5%-2%的异常。
- 要进行术前护理和无菌手术准备,使用无菌棉签对眼睛应用抗生素眼药膏。在刮过的头皮区域应用碘溶液。用70%乙醇去除。用带芬芳的手术窗帘盖住动物,这样头部的顶部是可见的,但眼睛是被覆盖的。
- 使用手术刀或剪刀在头皮上做一个中线切口(1.5-2厘米)。 使用无菌棉签清洁伤口,并清除中线在布雷格马的左侧筋膜。
- 使用冲击器探头识别颅骨切除部位。
- 将立体分类参考点(X = 0,Y = 0)设置为 bregma。 横向将探头调整到中线左侧 2 mm。使用细尖手术安全标记在探头周围勾勒出一个直径为 5 mm 的圆圈。将冲击器升高并旋转出位。
- 使用高速旋转微电机套件手动工具,以 ±70%-80% 的最大速度使用圆尖 0.6 mm 或 0.8 mm 毛刺钻头在头骨上打一个开孔。沿 5 mm 圆周轮廓钻孔时,对头骨施加轻压以薄此边框。
- 钻孔时不要施加过大的压力。这可能导致由于振动、压缩或意外穿透而导致的皮质损伤。允许钻头的速度完成工作。
- 请勿在任何给定位置钻得太久,以免颅骨摩擦加热过多。偶尔用无菌盐水灌溉颅骨切除术,以清除碎屑并减少旋转工具的加热。
- 在钻研日冕缝合线时,要密切注意,因为这些点容易出血。
- 当颅骨切除轮廓足够薄时,使用一对细钳去除头骨皮瓣。以温和方式抓住活门,用径向运动轻轻抬起并横向拉动。
- 提起活门时,请勿损坏杜拉母体;这可能导致严重的伤害和出血。
- 执行轻度受控皮质撞击损伤
- 使用无菌酒精准备垫清洁冲击器探头。将冲击器探头移回暴露皮层上的位置。降低探头,直到其接触杜拉母体表面。将此位置标记为 Z = 0。
- 取下活塞并移动到 Z = -1.0 mm.释放活塞以撞击皮层。
- 快速抬起活塞并将臂移出位置。在受伤后,涂抹大量盐水来灌溉皮层。根据需要用盐水冲洗手术部位,并使用 5.0 丝质缝合使用简单的中断的切口缝合头皮切口。
- 对鼠标执行术后护理
- 停止麻醉。以10mg/kg剂量,通过皮下注射将CsA注射成刮伤。将鼠标放在一个清洁的、预加热的术后笼子里。
- 在饮用水中以1.0mg/mL提供对乙酰氨基酚镇痛剂。
注:根据适当的IACUC标准操作程序,并考虑到实验结果变量(如镇颤、神经炎症)提供镇痛。 - 在温暖的恢复笼中提供润湿的食品,以帮助补液和恢复。
- 执行仅颅切除术(sham)控制时,从第 2 节转到上文第 4 节。
2. 细胞悬浮液的立体移植
- 颅内切除术后约24小时开始细胞移植手术。
- 准备细胞移植设备和手术用品
- 用无菌盐水填充1 mL滑尖注射器,用于伤口灌溉。将 25 G 针头连接到注射器以控制灌溉。
- 用 CsA 溶液填充 1 mL 滑尖注射器,以进行免疫抑制。将 25 G 或更大的针头连接到 CsA 注射器。在手术之间根据需要重新填充 CsA 注射器。
- 使用标准方法从 1.0 mm OD 硼硅酸盐玻璃毛细管移液器中制备玻璃针。
- 使用细钳将针尖断裂至直径约 200 μm。确保针的圆柱形轴不超过 2.5 厘米。
- 校准注射器泵,以便与 10 μL 注射器一起使用。 输入 0.2 μL/min 的流速,提供 2.0 μL 的总体积。
- 准备人类诱导多能干细胞(iPSC)悬浮液。
- 使用标准无菌处理技术在细胞培养BSL-2罩中执行所有细胞处理。
- 根据为细胞类型定义的标准条件提前准备细胞培养物。以Lischka等人17为例。
注:本演示中所示的实验使用了从 hiPSC 派生的各种神经表型细胞。 - 使用细胞分离溶液或其他首选酶或化学手段,轻轻地将细胞分离成单细胞悬浮液。
- 在1.7 mL翻转顶部试管中,在最小细胞培养基(例如DMEM)中将悬浮液稀释至5 x 104细胞/μL。
- 观察以下移植说明:
- 在手术期间,将悬浮细胞保持在37°C。
- 仅在进行耳塞注射前加载注射器(下文步骤 4.5)。
注:重力可能导致细胞悬浮液沉淀或粘附在注射器的侧面,如果放在注射器的侧面。这导致注射的细胞数量不规则。 - 如果在一天内进行多个细胞移植程序,每只小鼠的分值 =5 x 105细胞(10 μL 悬架)。
- 进行立体移植手术
- 将鼠标放入与带压缩氧源的异常鲁兰蒸发器相连的麻醉感应室中。在±0.7 L/min氧气下诱导麻醉,用±3%的异常鲁兰。
- 将鼠标置于带有麻醉鼻锥的立体框架中。
- 用耳条和咬杆固定头部,并定向头部,使头骨正面骨水平。在手术期间,将麻醉保持在±1.5%-2%的异常。
- 进行术前护理和无菌准备
- 使用棉签将含有抗生素的保湿眼药膏涂抹在眼睛上。
- 用无菌盐水将切口部位清洗,以清洁部位并松弛缝合线。用棉签轻轻涂上70%乙醇,对切口部位进行消毒。
- 使用细钳子和眼科剪刀去除缝合线。灌溉手术部位和颅骨切除术与丰富的无菌盐水。
- 如果皮层显示不合格的特征,包括过度的增血、变色、血管中断或出血,请考虑将动物排除在外。
- 加载细胞移植注射器
- 将细胞悬浮液从37°C培养箱移至细胞培养生物安全罩。轻轻旋转或敲击管,以确保均匀细胞悬浮液。
- 使用微型移液器通过柱塞端将 ±7.5 μL 细胞悬架加载到汉密尔顿注射器中。
- 保持注射器在 [120] 角与柱塞端朝下。插入柱塞,注意不要在悬架和柱塞尖端之间引入气泡。
- 将垫片组件连接到移液器针上,然后将针头连接到注射器。
- 推动柱塞将细胞悬架移入移液器针中。 如果存在防止悬架流出的阻力,请使用细钳子打断针尖以扩大直径。
- 将注射器连接到立体注射器泵。 前进柱塞,确保注射器泵组件工作正常。
- 将针头移到注射坐标中。
- 将针尖对齐到胸针。将 X 和 Y 坐标设置为 0。然后,将针尖移到颅骨切除术上,至 2.0 mm 横向和 -1.0 mm 后侧到胸膜。 将针尖触摸到 Dura 母体表面,并将立体坐标设置为 Z = 0。
- 在将针头引入大脑之前,按下柱塞以确保细胞悬架充分流动。
- 将针头引入大脑,深度为 Z = -1.4 mm。这些立体坐标将移植物置于深皮层20的灰质白色物质边界处。
- 启动注射器泵以注入细胞悬浮液。将实验室工作台计时器设置为 15 分钟并启动计时器。使用长工作距离显微镜监测细胞悬浮液流出。
- 注射期间用无菌盐水灌溉手术部位,以保持组织水化。
- 15分钟后,慢慢取出移植针。 用盐水灌溉手术部位,用缝合线关闭切口。
- 进行术后护理
- 停止麻醉。以10mg/kg剂量,通过皮下注射将CsA注射成刮伤。将鼠标放在一个清洁的、预加热的术后笼子里。
- 在饮用水中以1.0mg/mL提供对乙酰氨基酚镇痛剂。
注:根据适当的IACUC标准操作协议(SOP)提供麻醉剂,并考虑实验结果变量。 - 提供湿润的菜回收笼,以帮助补液和恢复。
- 在小鼠的整个生存期间,继续每天以10mg/kg的CsA注射。
3. 传感器电机集成的胶带去除试验
- 在执行行为测试之前,使用小剃刀将电胶带切成 3 mm x 5 mm 条。使用光滑的玻璃表面切割胶条。
注:使用黄色和红色胶带,因为老鼠很难区分这些颜色21。- 选择一个适合透明塑料盒内的小镜子。
- 用模拟粘土或胶带将镜子固定在大约 45° 角的位置,以便从下面查看动物行为。
- 将盒子和镜子组件放在安静的专用行为测试室的长凳上。 将气缸放在镜子上方的塑料盒上。
- 将处理布、钳子和胶条放在行为测试箱旁边的工作台上。
- 用 70% 乙醇和纸巾清洁包装盒和气缸。 让表面彻底干燥。
- 把老鼠带进行为测试室。在行为测试之前,让小鼠在测试室中适应至少 30 分钟。
- 从保持架中取出供水,以尽量减少测试期间的排尿事件,这可能会干扰高效的测试性能。
- 选择一个适合透明塑料盒内的小镜子。
- 执行胶粘剂去除测试
注:此行为测试最好由两到三个调查员执行:一个操作秒表,一个或两个处理鼠标和观察行为。- 使用每种颜色的钳子剥离一种颜色的粘合条。
- 选择哪种条状颜色对应于前爪,并在整个试验过程中保持一致。
- 使用处理布将鼠标固定在颈部和背部,使鼠标将前爪从身体和头部移开。
- 使用钳子在每个前爪的平面上放置一条胶条。使用细腻和一致的手指压力将条子固定到爪子上。
- 快速将鼠标放入塑料缸中。当鼠标在塑料盒上装有所有四个爪子时,启动两个秒表。
- 使用两个秒表记录以下四个事件的延迟:左爪通知,左爪去除,右爪通知,右爪去除。
- 记录动物通过摇动或退缩或咬带来明确识别胶条时的通知事件。
- 记录动物从前爪平面上有效移除条带时的移除事件。
注: 去除事件不会因带状重新粘附或条带粘附在前爪的横向表面而被取消资格。 - 如果未拆下相应的条带,则停止计时器 120 秒。
- 记录数据表上四个事件的运行时间。
- 对每只鼠标执行第二次试用
- 在单个小鼠的试验之间至少留出 5 分钟,以减轻压力,从而干扰测试的有效性能。
- 在测试小鼠之间用纸巾清洁仪器,以清除单个笼子中的多只小鼠时产生的废物。
- 在从多个笼子测试小鼠时,用 70% 乙醇和纸巾彻底清洁仪器。
- 反转会话第二次试验的色爪放置顺序,以随机化任何颜色效果。
- 计算每个动物每天两次试验之间的每个事件的平均延迟。
- 使用每种颜色的钳子剥离一种颜色的粘合条。
- 用清水彻底清洁仪器和搬运布,更换笼水供应,并将小鼠送回其存放设施。
- 在连续的实验时间点上重复步骤 3.1-3.2,以进行重复测量试验设计。
注意:在收集数据之前,每天重复步骤 3.2.1-3.2.5.3,以便让动物适应任务。建议在手术前采集基线数据。
4. 二甲苯丁(DAB)移植生存和损伤病理学的免疫组织化学分析
- 对动物实施安乐死,进行跨卡灌注。
- 在PBS中制备0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)和4%甲醛(PFA)溶液。平衡两种溶液的pH,达到7.4。
- 将两个溶液放在冰上,放在烟罩中。将蠕动泵放在烟罩中,然后运行泵以用 PBS 填充管道。将泵流量设置为 ±7 ml/min。 将 25 G 指针连接到泵的流出管。
- 将带软基板的排水盘放在发动机罩内。以轻微角度升起托盘的一端,使灌注液排到下端。
- 将鼠标放入麻醉感应室。使用压缩的 100% 氧气车辆气体向腔室中填充 4% 的半角胶。
- 将麻醉小鼠从腔室移到麻醉鼻锥。将共和拉尼降低至2%。
- 进行胸腔切除术,以暴露心脏。停止麻醉,因为胸腔切除术会导致安乐死。
- 小心地将灌注泵流出针沿着心脏的长轴放在左心室中。不要刺穿心脏隔膜,因为这将导致灌注不良。
- 使用小剪刀切割右心房,然后立即打开蠕动泵。
- 继续PBS流,直到离开右心房的液体流出血液。
- 关闭泵。将泵入气管移到 PFA 的容器中。重新启动泵。继续渗透PFA,直到动物足够僵硬,或直到20 mL体积被泵送通过。
- 关闭泵。从心脏中取出流出的针头。将入水管从 PFA 移到 PBS,然后从管中彻底冲洗 PFA。
- 通过仔细解剖,将大脑从头骨中取出。将大脑放入一个装有4%甲醛的小容器中,让大脑在4°C下过夜。
- 在固定后的第二天,用PBS和0.1%的阿齐德钠替换P。将大脑储存在此溶液中,直到准备进行动物学切片。
- 通过冷冻微孔或室温颤音收集40-50μm部分甲醛固定脑组织。
- 将水中0.3%过氧化氢中的组织预处理,使内源性过氧化物酶灭活,从而产生非特异性染色。
- 使用柠檬酸缓冲液(10 mM柠檬酸钠,0.05%聚山梨酸-20,pH 6.0)在60°C下进行抗原检索30分钟。
- 通过标准方法执行抗体标记。 请参阅伦德尔等人。22日,来自这个实验室的报告将了解更多的细节。
- 使用小鼠IgG中和试剂盒(见材料表)减少与内源抗体的交叉反应。按照制造商的指示,在室温 (RT) 下在 IgG 中和缓冲液中孵育组织至少 1 小时。
- 在移植人类iPSC衍生细胞时,使用小鼠抗人类核抗原原抗体(hNA;1:500稀释)来定位移植的细胞。使用温和的搅拌在4°C下用原抗体孵育组织48-72小时。
- 在稀释原发抗体溶液后,用HRP结合的抗小鼠二级抗体在RT1:250稀释2小时孵育组织。
- 通过标准方法执行 DAB 色原反应,以揭示免疫标记。允许 DAB 反应在 RT 上发展 5 到 10 分钟。
- 将染色组织连接到幻灯片并使用标准方法应用盖玻片。
- 量化标记细胞的数量使用无偏立体学如前所述23,24。使用 20 μm 光学截面和三节间隔之间执行分析。
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Representative Results
颅内切除手术有助于实验性脑损伤和治疗性细胞移植:脑损伤的受控皮质冲击模型和随后的细胞移植治疗需要仔细切除上盖颅骨。颅骨切除术可以在头骨的任何背表面进行,以便对感兴趣的大脑区域进行操作。图1中的图描述了一个直径为5毫米的颅骨切除示意图,以揭示主躯体感觉和运动皮质(图1A)。在颅骨切除术后的24小时,进行了第二次手术,将人类iPSC衍生的神经细胞悬浮液注入皮层深层(图1B)。颅内切除术后的第一天,特别是CCI之后,有些脑水肿是正常的。然而,在这个过程的所有阶段,脑血管的备用是皮层生存的关键。图2说明了小鼠的细胞移植过程,脑气增率最小,出血量最小,皮质血管化广泛。这些特征是成功手术的良好预后指标。
胶带去除测试揭示了单侧脑损伤后的感觉运动缺陷:上述脑损伤模型的参数被预测影响前肢感觉和运动功能。选择胶带去除测试来评估前肢功能缺陷的严重程度,以及细胞移植的潜在治疗益处。在测试程序上训练小鼠5天,然后在基线行为测试之前允许休息两天。在基线测试后的第二天进行手术。本研究中的行为测试在术后第1、3、5、7、10、14、21、28、35和42天进行。图3显示了一个试验实验的结果,其中仅颅切除术(sham)和CCI损伤的小鼠前肢功能与幼鼠前肢功能(n = 11天真,12假,11 CCI)进行比较。接受手术的小鼠在手术后1-3天内出现暂时性增加的延迟,以注意到胶粘剂刺激(图3A,B)。 小鼠在从益边前爪去除胶粘剂时也出现术后暂时缺陷(图3C)。然而,接受CCI的小鼠与前侧与损伤的运动性能明显缺乏,而手术后28日(图3D)则与幼鼠相比。这些数据还描述了没有CCI的颅骨化小鼠的意外严重性感觉运动损失,表明到这一区域的手术颅切除术也诱发与TBI相关的神经功能缺陷。
免疫检测人类诱导多能干细胞(iPSC)衍生细胞移植小鼠大脑部分:进行了实验,以确定人类iPSC衍生神经细胞能否在小鼠大脑的长期移植中存活下来。从iPSCs中提取的人类神经干细胞(NSCs)在体外被分化成未成熟的神经元或星形细胞。三种神经细胞表型的移植都在我们的创伤性脑损伤CCI模型中进行了测试,使用上述步骤,如图2所示。在移植后7天,小鼠被安乐死进行动物进行动物学分析。小鼠大脑部分被免疫染色为人类核抗原(hNA)。人类细胞移植物可以清楚地区分在假手术和CCI大脑的宿主组织(图4)。与NSCs(n = 12 sham,15 CCI)和神经元(n = 11个假,10个CCI)相比,星形细胞移植物(n = 3个假,2 CCI)的存活率较差,并且没有考虑用于未来的实验。
图 1:手术操作的坐标参数。感兴趣的小鼠大脑区域的卡通描述。红色圆圈表示直径为 ±5 mm 的颅切除术。红十字表示颅骨切除中心点 2 mm 横向到布雷格玛。(A)上图中脑皮层的带沙区受轻度CCI影响,如下图所示进行颅内切除术。(B)上图中的蓝色箭头表示细胞注射在距皮质表面1.4毫米深度的近似位置。下图中的蓝色十字表示细胞注射2毫米横向和1毫米后向布雷格马的位置。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:细胞悬浮液注射术中监测。在内特拉巴伦切细胞注射期间通过长距离显微镜拍摄的照片。为了清楚起见,对解剖特征进行说明。头皮部分遮蔽手术部位,以尽量减少在手术过程中的脱水。如图所示,在针头渗透期间可能会出现轻微出血,如果大型皮质血管完好无损,则不引起关注。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:脑损伤后感觉运动整合的行为评价。接受颅骨切除术和CCI的小鼠被比作天真的对照和只接受假手术的小鼠(n = 11天真,12个假,11 CCI)。数据以组平均延迟形式呈现,误差条指示 SEM. (A) Cci 的小鼠在术后第一天表现出更高的延迟,以识别应用于 ipsi侧前爪的粘合刺激。(B)接受颅切除术或CCI的小鼠在术后第1和第3天出现大量增加的延迟,以注意到应用于反向前爪的粘合剂刺激。(C)接受颅内切除术或CCI的小鼠在术后第1和第3天表现出大幅度增加的延迟,以去除从益边前爪的粘合刺激。(D)接受颅骨切除术或CCI的小鼠在术后1-5日表现出大幅度增加的延迟,以去除从反向前爪的粘合刺激。患有CCI的小鼠在受伤后28天持续严重缺损。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:用于小鼠大脑中人体细胞移植的DAB免疫组织化学。人类iPSCs被分化为神经干细胞(NSC)、神经元或星形细胞体。细胞培养物被移植到小鼠大脑中,无论是否有CCI。小鼠在细胞移植后七天被安乐死进行系统分析。微图描绘了人类核抗原染色的代表性结果。黑色插页描绘了细胞数(青色)和移植体积(红色)的立体量化标记。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
轻度CCI作为实验再生疗法测试的模型系统
CCI模型是研究皮层机械损伤后组织功能障碍机制的宝贵工具。损伤参数的可调性是该模型的一个吸引人的特征。改变Z冲击深度、速度或活动时间可以增加或减少调查人员10、25所期望的伤害严重程度。轻度CCI的损伤,如果执行正确,应导致适度的皮质细胞死亡和最小的气穴。颅骨切除术和颅瓣切除必须非常小心。在钻孔颅内切除沟槽时施加过大的向下力会导致加热和振动导致皮质损伤。在颅瓣切除过程中,Dura母体的机械中断几乎均匀地预测严重的皮质损伤。主要皮质血管的中断可能导致皮层过度病变,是将动物排除在实验之外的理由。不幸的是,在手术后的第二天,伤势加重的迹象是微妙的。水肿和小皮质血管破裂都不一定是负指标。缺血引起的血肿和异常着色是手术并发症的更明确指标。记录术中事件和将并发症与组织病理学结果相关是完善良好的颅内切除技术的关键。
必须注意的是,在动物的mTBI建模伴随着某些警告。除了这里介绍的模型之外,还有许多mTBI的临床前模型。实验TBI可以通过机械力、空气的爆炸波或这些力26、27、28的组合来诱导。轻度至重度损伤由组织病理学和行为结果相结合(在佩特利亚29和西博尔德30中回顾)。啮齿动物的行为缺陷可以在数天到第31周内解决,而人类mTBI患者的缺位可能以脑震荡后综合症32的形式持续数月。虽然没有单一模型是临床mTBI的完整模拟,临床前测试揭示了在人类条件下无法评估的生理机制。
细胞移植过程中最重要的步骤是细胞悬浮液的处理和注射。粗糙的处理导致细胞分解,导致粘性基因组DNA的释放和存活的悬浮细胞的聚集。针尖直径必须足够宽,以便使悬架平稳流出;由于针内的悬浮沉积物,受限流动会导致不连续的输送。当遵循此协议并避免此处讨论的陷阱时,在 7 天的存活时间后可以看到强健的移植物(图 4)。临床前模型中的长期移植存活是确定这种方法的潜在疗效的关键。
胶带去除试验在损伤建模中的应用
胶粘剂去除测试显示正神经缺陷,在增加延迟,以消除胶粘剂刺激。此测试的主要潜在缺点是,由于与伤害无关的因素,性能可能会受到抑制。处理压力可以减少小鼠的探索行为33,因此在基线数据收集之前,动物必须经历广泛的约束适应。请务必在测试前至少 30 分钟清除供水,以减少与排尿相关的冻结事件。最后,测试设备必须经常清洗,因为动物可能会分心,对不熟悉的动物的气味线索进行嗅探。
此处提供的结果显示,在受伤后 28 天内,前爪电机出现明显的逆向到轻度 CCI 缺陷。相比之下,使用气缸测试34和加速轮状 3的并发测试显示损伤引起的功能缺陷,在 5–10 天内解决(未显示数据)。胶带去除已用于各种实验,评估单侧缺陷的传感器电机整合行为7,35。 该测试最近也用于评估颈椎损伤36再生干预后的运动功能恢复。通过选择不同强度的粘合剂,可以调整此测试的动态性能范围,以调整延迟或物种变化。这里,建议3M电胶带是小鼠的最佳刺激,基于可用性,耐久性,并大大增加延迟,以消除轻度CCI后的刺激。虽然这里展示的初步实验没有将细胞移植和行为测试结合起来,但我们实验室正在进行的实验将评估移植存活率和对56岁时脑损伤的传感器运动行为恢复的并发影响。移植后数天。
人体细胞移植物的DAB免疫检测改进
民布免疫组织化学的选择是为了在小鼠组织中产生强的、持久的标记,以便随后进行立体定量。过氧化氢的预处理对于减少由于红细胞内源性过氧化物酶导致脑组织的非特异性染色至关重要。使用小鼠IgG中和试剂盒进一步减少了这些实验中的非特异性染色。该试剂盒使用专有化学品降低内源性小鼠IgGs的抗原性,在TBI37之后,它可以外溢到脑组织中。早期尝试使用载体实验室ABC试剂盒结合小鼠抗hNA原抗体、生物锡结合二级抗体和链球菌-HRP结合三级标记。ABC偶联体在皮层和颅切除术中表现出广泛的非特异性DAB染色(数据未显示)。随后的染色试验采用与HRP直接结合的二级抗体。这种经过修改的协议可产生高分辨率核染色,并大大减少所有HiPS衍生细胞类型和手术条件的背景(图4)。该实验室使用这种经过改良的DAB染色技术进行未发表的实验,在轻度CCI后56天检测小鼠大脑中的hNA阳性细胞。总体而言,与传统的三级标记ABC试剂盒相比,二元抗体标记程序节省了时间,并产生了更清晰的免疫染色。该协议可用于移植到小鼠中枢神经系统的人体细胞的其他临床前研究。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
这项工作得到了神经科学和再生医学中心(CNRM,赠款号G17024014)的资助。我们感谢马希马·德万和克拉拉·塞尔布雷德在胶粘剂去除试验研究方面给予的帮助。克里斯莱·拉多姆斯基进行了初步脑损伤和细胞移植手术。USU CNRM临床前研究核心实验室的阿曼达·傅和劳拉·塔克分别就动物手术和行为测试提供了宝贵的建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
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