Summary
यहां, हम निम्न श्वसन पथ में पैदा होने के एक गैर-आक्रामक मार्ग प्रदान करके माध्यमिक जीवाणु निमोनिया अध्ययन में सुधार करने के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं जिसके बाद रोगज़नक़ वसूली और प्रतिलिपि विश्लेषण किया जाता है। इन प्रक्रियाओं reproduible हैं और इस तरह के cannulas, गाइड तारों, या फाइबर ऑप्टिक केबल के रूप में विशेष उपकरणों के बिना किया जा सकता है.
Abstract
इन्फ्लूएंजा संक्रमण के बाद माध्यमिक बैक्टीरियल निमोनिया लगातार संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत के शीर्ष दस प्रमुख कारणों के भीतर रैंक. तारीख करने के लिए, सह संक्रमण के murine मॉडल प्राथमिक दोनों प्राथमिक और माध्यमिक संक्रमण के रोगों का पता लगाने के लिए विकसित उपकरण किया गया है. इस मॉडल की व्यापकता के बावजूद, पैदा करने की प्रक्रिया, खुराक की मात्रा, और दक्षताओं के बारे में काफी विसंगतियां अध्ययनके बीच प्रचलित हैं। इसके अलावा, इन प्रयासों को संबोधित करने में काफी हद तक अधूरा है कि कैसे रोगज़नक़ सीधे रोग प्रगति के बाद संक्रमण को प्रभावित किया जा सकता है. इसमें हम रोगज़नक़ डिलीवरी, वसूली, और विश्लेषण की एक सटीक विधि प्रदान करते हैं जिसका उपयोग माध्यमिक बैक्टीरियल निमोनिया के murine मॉडल में किया जा सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि इंट्राट्रेकल इन्स्टिवनेशन नियंत्रित मात्रा के कुशल और सटीक वितरण को सीधे और समान रूप से निचले श्वसन पथ में सक्षम बनाता है। फेफड़ों को ठीक करने और रोगज़नक़ बोझ की मात्रा निर्धारित करने के लिए excised किया जा सकता है। संक्रमित फेफड़ों के उच्छेदन के बाद, हम बाद में ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले रोगज़नक़ आरएनए निकालने की विधि का वर्णन करते हैं। यह प्रक्रिया विशेष प्रयोगशाला उपकरणों के उपयोग के बिना वितरण की एक गैर सर्जिकल विधि होने से लाभ करती है और माध्यमिक जीवाणु निमोनिया के लिए रोगजनक योगदान की जांच करने के लिए एक पुनरुत्पाद्य रणनीति प्रदान करती है।
Introduction
इन्फ्लुएंजा संक्रमण के बाद माध्यमिक जीवाणु निमोनिया संयुक्त राज्य अमेरिका में मृत्यु का एक प्रमुख कारण है और अनुसंधान1,2का सक्रिय क्षेत्र है . द्वितीयक जीवाणु निमोनिया के मौरीन मॉडलों का उपयोग करने के बावजूद रोगजनक आसवन और पूछताछ के संबंध में विसंगतियां3,4,5बनी हुई हैं . इसके अलावा, जबकि कई पिछले प्रयासों इन्फ्लूएंजा के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है कि माध्यमिक जीवाणु संक्रमण के लिए एक वृद्धि हुई susceptibly करने के लिए नेतृत्व, और अधिक हाल के डेटा से पता चलता है जीवाणु रोगज़नक़ की उग्रता विनियमन एक समान है रोग की स्थापना में योगदान6,7,8,9. इन नए डेटा को सह संक्रमण के murine मॉडल में माध्यमिक जीवाणु निमोनिया का पता लगाने के लिए एक और अधिक सटीक विधि की आवश्यकता है कि रोगज़नक़ प्रतिक्रिया में जांच की सुविधा.
इन्फ्लूएंजा सह संक्रमण मॉडल के लिए अद्वितीय, मेजबान जीवों जानबूझकर माध्यमिक जीवाणु एजेंट के प्रशासन से पहले एक प्राथमिक इन्फ्लूएंजा संक्रमण द्वारा प्रतिरक्षा कर रहे हैं. मानव मेजबानों में पाए जाने वाले रोग रोगजनकको सर्वश्रेष्ठ प्रतिकृति करने के लिए, यह आवश्यक है कि प्राथमिक और माध्यमिक एजेंटों दोनों के रोगजनक भार को नियंत्रित किया जाए ताकि प्रत्येक संक्रामक एजेंट के व्यक्ति और संयोजनात्मक प्रभावों का निरीक्षण किया जा सके। सबसे अधिक , चूहों में श्वसन संक्रमण एक इंट्रानैसल प्रशासन3, 4,5,6,10 केमाध्यम से स्थापित किया गया है . इस मार्ग के रूप में inasmuch तकनीकी रूप से सरल होने के लिए उल्लेख किया है और कुछ एकल एजेंट संक्रमण अनुप्रयोगों में उपयुक्त हो सकता है, यह सह संक्रमण मॉडल के लिए अनुपयुक्त है, के रूप में पैदा करने की प्रक्रिया, खुराक मात्रा, और प्रभावकारिता के भीतर अत्यधिक चर रहे हैं प्रकाशित साहित्य3,4,5,6.
माध्यमिक जीवाणु निमोनिया रोगजनन की अधिक पूरी समझ हासिल करने के लिए, मेजबान और रोगजनक दोनों के योगदान पर विचार किया जाना चाहिए। इस दृष्टि से, हमने संक्रमित फेफड़ों से व्यवहार्य बैक्टीरिया और रोगज़नक़ आरएनए की वसूली के लिए एक सीधा और पुन: उत्पादनीय दृष्टिकोण विकसित किया है। इस विधि जीवाणु आरएनए के बाद अलगाव के बाद एक सरलीकृत, गैर इनवेसिव इंट्राट्रेकल पैदा करने की प्रक्रिया का उपयोग करता है। यहां वर्णित इंट्राट्रेकल इन्स्टिभलेशन प्रक्रिया पहले वर्णित विधियों के समान है और यह रोगजनक प्रसव11,12,13तक सीमित नहीं है . कम लागत होने से इस विशेष प्रक्रिया लाभ का उपयोग करें और इस तरह के cannulas, गाइड तारों, या फाइबर ऑप्टिक केबल के रूप में विशेष उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है; इसके अलावा, क्योंकि इस प्रक्रिया गैर इनवेसिव यह murine विषयों पर कम से कम तनाव का बीमा है, टीका यांत्रिकी से एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम करता है, और कई विषयों के संक्रमण के लिए एक कुशल वितरण मार्ग प्रदान करता है. संक्षेप में, isoflurane एनेस्थेटाइज्ड चूहों छेदक से निलंबित कर रहे हैं. फोर्सप्स का उपयोग जीभ को धीरे से समझने के लिए किया जाता है जिसके बाद पूर्व-लोडेड तुला, कुंद-टिप, 21 गेज सुई को श्वासनली में सम्मिलित किया जाता है और रोगज़नक़ लोड की डिलीवरी होती है। इस प्रक्रिया का सत्यापन फुफ्फुसीय डिब्बे में समान रूप से वितरित डाई की दृश्य पुष्टि और जीवाणु लोड की वसूली द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। फिर हम संक्रमित फेफड़ों से व्यवहार्य स्टैफिलोकोकस ऑरियस (एस ऑरियस) को ठीक करने और उच्च गुणवत्ता वाले रोगज़नक़ आरएनए को अलग करने के लिए एक पुनरुत्पाद्य विधि का वर्णन करने के तरीके का प्रदर्शन करते हैं।
Protocol
सभी तरीकों स्वास्थ्य दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुरूप है और मॉनटाना राज्य विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. इंट्राट्रेकल इन्स्टिटेशन
- निम्नलिखित आपूर्ति युक्त एक कार्यक्षेत्र तैयार करें: एक intubation मंच, एक बाँझ 1 एमएल सिरिंज, बाँझ कुंद-टिप्ड बलप्स, बाँझ 21 गेज कुंद-टिप सुई, और दो शंकु ट्यूब सिरिंज और बल्स स्टोर करने के लिए।
नोट: Intubation प्लेटफार्मों वाणिज्यिक रूप से खरीदा जा सकता है या घर में निर्माण. यहां इस्तेमाल किए गए इंटूबेशन प्लेटफॉर्म का निर्माण 0.25 इंच plexiglass का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप में, गर्मी plexiglass के लिए लागू किया गया था और बोर्ड एक अनुमानित करने के लिए तुला है 65 "आंतरिक कोण. intubation मंच के बाहरी पक्ष पर, दो मशीन शिकंजा 3 इंच के अलावा बीज थे और एक रबर बैंड दो शिकंजा के बीच निलंबित कर दिया गया था. - नमूने को क्रमिक रूप से कम करके रोगजनक इनोकुलम तैयार करें ताकि वांछित अंतिम सांद्रता 50 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा में प्राप्त हो सके। बर्फ पर इनोकुलम को स्टोर करें।
- बाँझ दस्ताने पहने हुए, लगभग 35 डिग्री करने के लिए एक 21 जी कुंद फट सुई मोड़।
नोट: प्रत्येक माउस के लिए एक अलग सुई की आवश्यकता है। - तुला 21 जी कुंद-टिप सुई को 1 एमएल सिरिंज को ठीक करें। संक्रामक एजेंट के 50 डिग्री एल के बाद सिरिंज में एक 100 डिग्री सेल्सियस हवा तकिया ड्रा। प्रमुख हाथ से आसानी से सुलभ स्थान में भरी हुई सुई और सिरिंज रखें।
- 4% आइसोफ्लुरेन/ऑक्सीजन मिश्रण या इसी तरह के IACUC अनुमोदित संज्ञाहरण की विधि का उपयोग करके माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज करें। उचित संज्ञाहरण गहराई आम तौर पर प्राप्त की है जब श्वसन दर प्रति लगभग 1 साँस लेना करने के लिए धीमी गति से 5-8 s और एक परिशिष्ट pinching और माउस से कोई प्रतिक्रिया देख द्वारा पुष्टि की जा सकती है.
नोट: संज्ञाहरण की इस विधि लगभग 1.5 मिनट की एक पर्याप्त एनेस्थेटाइजेशन अवधि प्रदान की. यह जानने के लिए और इस instillation प्रक्रिया प्रदर्शन करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में सदस्यों के लिए पर्याप्त था; तथापि, अन्य संस्थागत रूप से अनुमोदित संज्ञाहरण विधियों को11,12,13नियोजित किया जा सकता है . - संज्ञाहरण कक्ष से एनेस्थेटाइज्ड माउस निकालें और जंभिका छेदक से इंटूबेशन प्लेटफॉर्म पर माउस को निलंबित करें।
- श्वासनली में एक स्पष्ट मार्ग खोलने के लिए, मुंह के बाहर जीभ को धीरे से पकड़ने और विस्तार करने के लिए कुंद-टिप्ड बलप्स का उपयोग करें। जीभ को बल से अंगूठे और गैर-प्रमुख हाथ की तर्जनी में स्थानांतरित करें।
- गैर-प्रमुख हाथ में जीभ पकड़े रहें और पूर्व-लोडेड सिरिंज उठाएं। सुई के मुड़े हुए सिरे को शरीर से दूर रखिए और सुई को मौखिक गुहा में जीभ के आधार पर सम्मिलित करें।
- जीभ के आधार पर सुई के साथ, धीरे कोण कलाई शरीर से दूर सुई की एक मामूली धक्का पैदा करने के लिए। यह चरण सुई को श्वासनली में डाला जाएगा न कि एसोफैगस में।
- धीरे-धीरे सुई को श्वासनली में नीचे निर्देशित करें; अक्सर एक मामूली टिक के रूप में सुई मुखर गुना के माध्यम से गुजरता महसूस किया है. जब तक सुई करीना का सामना करती है तब तक थोड़ी सी प्रतिरोध महसूस न हो जाए।
- करीना के ऊपर सुई को निलंबित करने के लिए निकट दिशा में सुई को थोड़ा उठाएं। यह दो प्राथमिक ब्रोंची में प्रसव सक्षम बनाता है. संक्रामक लोड देने के लिए सिरिंज के प्लंजर को पूरी तरह से कम करें। ऊपर की ओर उठाने और छोड़ने के द्वारा श्वासनली से सुई निकालें.
- रबर बैंड को निराशाजनक करके इंटूबेशन प्लेटफॉर्म से माउस निकालें, लेकिन माउस को एक ईमानदार स्थिति में पकड़े हुए बनाए रखें। नाक के वायुमार्ग को सीधे नारस के ऊपर रखकर अवरोधित करें। लगभग 1 मिनट के लिए इस स्थिति को पकड़ो या जब तक कई गहरी साँस मनाया जाता है.
नोट: यह अंतिम चरण सुनिश्चित करता है कि कुल इनोकुलम मात्रा निचले श्वसन पथ में वितरित की जाती है। - अपने पिंजरे के लिए माउस वापस और संज्ञाहरण से एक पूरी वसूली का निरीक्षण.
2. संक्रमित फेफड़ों का चीरा
- बाँझपन बनाए रखने के लिए एक laminar प्रवाह हुड के भीतर कार्य करना, निम्नलिखित मदों के साथ एक कार्यक्षेत्र तैयार: एक पैमाने और बाँझ वजन नाव, एक विच्छेदन मंच, कैंची और forceps युक्त एक विच्छेदन किट, बाँझ RNAse मुक्त पीबीएस, और बाँझ धुंध.
- सीओ2 या इसी तरह IACUC इच्छामृत्यु की विधि को मंजूरी दे दी के साथ एक संक्रमित माउस Euthanize.
- एक विच्छेदन मंच पर एक संक्रमित माउस प्लेस और प्रत्येक उपांग के अंत में पिन का उपयोग कर माउस को सुरक्षित. काम कर सतहों की बाँझपन बनाए रखने में मदद करने के लिए इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे।
- नाभि से शुरू, त्वचा को उठाने और श्वासनली के आधार तक एक चीरा बनाने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। प्रारंभिक चीरा के दोनों ओर त्वचा grasping, शरीर से दूर त्वचा खींच और ऊतक कनेक्शन के माध्यम से कटौती.
नोट: यह त्वचा भर में कई पार्श्व कटौती करने के लिए वक्ष क्षेत्र के अधिक प्रकट करने के लिए उपयोगी हो सकता है. - xiphoid प्रक्रिया के आधार पर शुरू, डायाफ्राम puncturing के इरादे से एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. इसके परिणामस्वरूप वक्ष गुहा में दबाव बढ़ जाता है जो फेफड़ों को वापस लेने का कारण बनता है। फेफड़ों के वापस लेने के साथ डायाफ्राम मुक्त करने के लिए चीरा जारी है.
- रिब पिंजरे के दोनों किनारों पर एक चीरा बनाकर पसलियों को निकालें। यह पूरी तरह से वक्ष गुहा और फेफड़ों का पर्दाफाश होगा.
- फेफड़ों को उत्पादित करने के लिए, बल के साथ दिल के आधार को समझें और ऊपर की ओर उठाएं। फेफड़ों के पीछे कैंची प्लेस और ऊतक कनेक्शन के माध्यम से छोटे चीरों बनाने के लिए शुरू करते हुए लिफ्ट दिल ऊपर की ओर जारी है.
- एक बार फेफड़ों को निकाल दिया गया है, उन्हें बाँझ धुंध पर जगह है और दिल को हटा दें। दिल आसानी से यह forceps के साथ फेफड़ों से दूर उठाने और शेष ऊतक कनेक्शन काटने से हटाया जा सकता है.
- फेफड़ों को पूर्व-टार्द वजन वाली नाव में स्थानांतरित करें और वजन रिकॉर्ड करें।
- फेफड़ों के वजन के बाद, उन्हें बाँझ फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) में स्थानांतरित और अस्थायी रूप से उन्हें बर्फ पर स्टोर जब तक रोगज़नक़ वसूली और विश्लेषण कदम के लिए आगे बढ़ रहा है.
3. रोगजनक वसूली और विश्लेषण
- एक laminar प्रवाह हुड के भीतर काम करने के लिए जारी रखने, निम्नलिखित आपूर्ति के साथ एक कार्यक्षेत्र तैयार: एक ऊतक चक्की, बाँझ RNAse मुक्त पीबीएस, बफर RLT के साथ पूरक $-mercaptoethanol (1:100), और 1.5 एमएल RNAse मुक्त microcentrifuge ट्यूब.
चेतावनी: त्वचा संपर्क, घूस, आंख से संपर्क, या साँस लेना के मामले में $-mercaptoethanol खतरनाक हो सकता है। बफर RLT में $-mercaptoethanol के फैलाव एक धूआं हुड में किया जाना चाहिए. - पहले ऊतक चक्की के लिए बाँझ RNAse मुक्त पीबीएस के 1 एमएल जोड़ने से शुरू करो. एक बार भरा, बर्फ पर ऊतक चक्की की दुकान.
- बाँझ RNAse मुक्त धारावाहिक कमजोर पड़ने ट्यूब ों कि संक्रमित फेफड़ों से बरामद जीवाणु भार की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की एक श्रृंखला तैयार करें. यह प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बाँझ पानी के 900 डिग्री सेल्सियस के अलीकोटिंग द्वारा सबसे आसानी से पूरा किया जाता है जिसके बाद रोगज़नक़ इनोकुलम के सीरियल कमजोर पड़ने के बाद।
नोट: सटीक रोगज़नक़ गणना के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने वाले ट्यूबों की संख्या प्रारंभिक रोगजनक इनपुट और संक्रमण की अवधि पर अलग-अलग होगी। यह अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए. - बाँझ forceps का उपयोग करना, तैयार ऊतक चक्की में फेफड़ों हस्तांतरण और अच्छी तरह से आसन पर नीचे दबाने से ऊतक homogenize जबकि घूर्णन.
- तैयार सीरियल कमजोर पड़ने ट्यूबों के पहले में homogenized नमूने के ऊतक चक्की और alicot 100 डिग्री सेल्सियस खोलें। नमूनों को क्रमिक रूप से पतला करें और पोषक तत्व आगर पर चढ़ाना द्वारा CFUs की गणना करें। CFUs को फेफड़ों के ऊतकों के CFUs/mL या CFUs/mL/mg के रूप में दर्ज किया जा सकता है।
नोट: इस चरण में homogenized नमूने के एक अतिरिक्त 200 $L वायरल आरएनए की शुद्धि के लिए हटाया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें ) या भविष्य के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. - के बाद alicots CFU दृढ़ संकल्प और / या वायरल आरएनए अलगाव के लिए हटा दिया गया है, पीस आसन की जगह और 4,000 आरपीएम (3724 x g) पर centrifugation द्वारा homogenized ऊतक गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए.
- एक पिपेट का उपयोग करना, गोलीमार नमूना से supernatant निकालें और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में जगह है.
नोट: supernatant बैक्टीरिया से मुक्त है और घुलनशील मेजबान और स्रावित रोगज़नक़ कारकों के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - बफर RLT-जेड-mercaptoethanol के 700 डिग्री एल में पाइपिंग या भंवर द्वारा homogenized ऊतक गोली को फिर से निलंबित करें और एक बाँझ RNAse मुक्त 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण।
नोट: इस बिंदु पर नमूने कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - एक शुद्धि किट के निर्माता के प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध करें (सामग्री की तालिकादेखें ); देखें Voyich एट अल 200814|
- एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में homogenized फेफड़ों के घोल स्थानांतरण 0.1 मिमी सिलिका मोती युक्त और 6 m/s पर 20 s के लिए एक मनका beater के माध्यम से संसाधित.
- 3 मिनट के लिए 1,500 आरपीएम पर नमूना सेंट्रीफ्यूज। अपकेंद्रण के बाद, नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सुपरनेट को पिपेट करें।
- नमूने के लिए 96%-100% इथेनॉल के 350 $L जोड़ें और अच्छी तरह से pipeting या व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण.
- एक 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखा एक शुद्धि स्तंभ के लिए नमूना के 700 $L स्थानांतरण. 15 s के लिए $ 8,000 x ग्राम पर नमूना सेंट्रीफ्यूज और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। ऊपर वर्णित के रूप में एक ही स्तंभ के माध्यम से किसी भी अतिरिक्त नमूना चलाएँ.
- 15 s के लिए $ 8,000 x ग्राम पर बफर RW1 और अपकेंद्रित्र नमूने के 700 $L के साथ कॉलम को धोएं। प्रवाह-थ्रू छोड़ें और सिलिका झिल्ली कॉलम को एक नया 2 एमएल संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- स्तंभ के लिए बफ़र RPE के 500 $L लागू करें। 15 s के लिए $ 8,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा कॉलम को धो लें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें।
- RNeasy कॉलम और अपकेंद्रित्र पर 8,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए बफर RPE के एक अतिरिक्त 500 $L लागू करें. प्रवाह के माध्यम से छोड़ें और 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर स्तंभ centrifuge.
- शुद्ध आरएनए को पूरा करने के लिए, कॉलम को एक नए 1.5 एमएल आरएनएस-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करके शुरू करें। Pipette 50 $L RNase मुक्त पानी के सीधे स्तंभ के सिलिका-जेल झिल्ली पर और 1 मिनट के लिए $ 8000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
नोट: एलिट RNA एक ही स्तंभ पर फिर से आरएनए उपज बढ़ाने के लिए चलाया जा सकता है. - कुल मात्रा को 100 डिग्री सेल्सियस तक लाने के लिए शुद्ध आरएनए में 50 डिग्री सेल्सियल आरएनसे-मुक्त जल जोड़ें। अलीकोट 350 डिग्री एल आरएलटी-मेरकैप्टोथेनोल के बाद एथेनोल के नमूने के लिए 96%-100% का 250 $L और पाइपटिंग या व्युत्क्रम द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
- एक संग्रह ट्यूब में रखा शुद्धि स्तंभ के लिए नमूना लागू करें और 15 s के लिए $ 8000 x ग्राम पर centrifuge. प्रवाह के माध्यम से छोड़ें और संग्रह ट्यूब की जगह.
- 15 s के लिए $ 8000 x g पर सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद बफर RW1 के 350 $L जोड़कर कॉलम को धोलें।
- बफर आरडीडी के 70 $L के लिए DNase स्टॉक (750 Kunitz इकाइयों/एमएल) के 10 $L जोड़कर लगभग 27 कुनिट्ज इकाइयों युक्त एक DNase समाधान तैयार करें। सिलिका-जेल झिल्ली पर सीधे DNase समाधान के 80 डिग्री एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेट करें।
- 15 s के लिए $ 8000 x ग्राम पर बफर RW1 और अपकेंद्रित्र के 350 $L के साथ कॉलम धो लें और प्रवाह के माध्यम से छोड़ दें।
- आरएनए को शुद्ध करने के लिए 3.9.6-3.9.8 चरणों को दोहराएँ.
नोट: यह 3.9.9.9.10 और 3.9.6-3.9.8 (छोड़ DNase कदम 3.9.11-3.9.13) का पालन करके आरएनए क्लीन-अप प्रक्रिया को दोहराने के लिए सिफारिश की है। इस अतिरिक्त सफाई यह बहुत उच्च गुणवत्ता आरएनए में परिणाम.
- आरएनए उपज एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए 260 एनएम पर रीडिंग के साथ एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर और शुद्धता के लिए 260:280 एनएम का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। आरएनए उपज प्राप्त होने के बाद, प्रत्येक आरएनए नमूने की सांद्रता को 50 ग्राम/एल तक मानकीकृत करें।
नोट: यह 50 एनजी की एकाग्रता पर कई aliquots बनाने के लिए सिफारिश की है / - -80 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध आरएनए स्टोर या प्रतिलिपि विश्लेषण के लिए तुरंत उपयोग करें।
नोट: पिछले प्रकाशनों में आरएनए से 3-5 चूहों प्रतिलिपि विश्लेषण के लिए जमा किया गया था. उपरोक्त तकनीक के अनुकूलन के माध्यम से, 1 माउस से आरएनए को प्रतिलिपि विश्लेषण (80-120 एनजी/जेडएल) के लिए पर्याप्त के रूप में अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया है।
Representative Results
चित्र ााा्वित १, 0.1% वजन/मात्रा कोमासी शानदार नीला घोल का उपयोग करता है ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि एक इंट्राट्रेकल इन्स्टिटेशन कम श्वसन पथ के भीतर सीधे और समान रूप से इनोकुलम को बचाता है। चित्र 2 से पता चलता है कि बैक्टीरिया (एस ऑरियस) CFUs homogenized फेफड़ों के ऊतकों से सीधे बरामद. चित्रा 3 व्यक्तिगत चूहों से इनपुट और वसूली CFUs की साजिश रचने के द्वारा कम श्वसन पथ में inoculum की सटीक वितरण और वसूली के लिए इस प्रणाली के उपयोग को दर्शाता है। चित्रा 4 जीवाणु गृह व्यवस्था जीन gyrB के क्यूआरटी-पीसीआर प्रवर्धन वक्र से पता चलता है कि जीवाणु आरएनए कम से कम डीएनए संदूषण के साथ संक्रमित फेफड़ों के ऊतकों से सीधे निकाला जा सकता है. चित्रा 5 वायरल आरएनए प्रदर्शित करने के लिए इन्फ्लूएंजा ए वायरस एम खंड के क्यूआरटी-पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग कर एक मानक वक्र के निर्माण से पता चलता है संक्रमित फेफड़ों के ऊतकों से सीधे निकाला जा सकता है।
चित्र 1: इंट्राट्रेकल इन्स्टिचर भी निचले श्वसन पथ में वितरण में सक्षम बनाता है। (ए, बी) असंक्रमित फेफड़ों को एक स्वस्थ माउस से बाँझ पीबीएस के इंट्राट्रेकल डालने के बाद निकाला गया और (ए) पृष्ठीय और (बी) अधर दृष्टिकोण से फोटो खिंचवाने के बाद। (सी, डी) 0.1% Coomasie शानदार नीले समाधान के 50 डिग्री एल इंट्राट्रेकल प्रशासन के माध्यम से एक एनेस्थेटाइज्ड माउस के लिए प्रशासित किया गया. (सी) डोर्सल। (डी) वेंट्रल. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: संक्रमित फेफड़ों homogenate से जीवाणु CFUs के प्रतिनिधि वसूली. फेफड़ों एस aureus के साथ एक दिन के बाद चुनौती excised थे. समस्थिति के बाद, फेफड़ों के घोल के 100 डिग्री सेल्सियस को क्रमिक रूप से 10-6के माध्यम से पतला किया गया था। CFUs बरामद की गणना करने के लिए, 10 डिग्री सेल्सियस बूँदें 10-5 और 10-6 tryptic सोया agar (टीएसए) पर कमजोर पड़ने से चढ़ाया गया और 5% सी 02 रात के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: इंट्राट्रेकल प्रशासन के बाद रोगजनक इनोकुलम की सटीक डिलीवरी और वसूली। चूहे को दो समूहों में विभाजित किया गया जिसमें प्रति समूह तीन चूहे थे। चूहे 1 x 108 (कम) और 2 x 108 (उच्च) CFU/ संक्रमण के एक घंटे बाद, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और फेफड़ों को पैदा करने और वसूली की शुद्धता को प्रदर्शित करने के लिए एक्साइज किया गया। फेफड़ों के होमोजेनेट से बरामद बैक्टीरियल इनोकुलम और बैक्टीरिया को टीएसए (ट्रिपेटिक सोया आगर) पर चढ़ाया गया था। जीवाणु इनपुट और वसूली के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर की सूचना नहीं मिली. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: प्रतिनिधि जीवाणु आरएनए वसूली और शुद्धता. छह घंटे के बाद इंट्राट्रेकल डालने के साथ 1 x 108 CFU/50 $L एस ऑरियस, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई. फेफड़ों को excised और homogenized बफर RLT-mercaptoethanol में फेफड़ों के घोल के resuspension के बाद किया गया. आरएनए को 3.914में वर्णित के रूप में शुद्ध किया गया था . क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग बैक्टीरियल हाउसकीपिंग जीन gyrB की प्रतिलिपि का पता लगाने के लिए किया गया था। बरामद आरएनए की शुद्धता प्रदर्शित करने के लिए कोई रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (एनआरटी) युक्त नियंत्रण शामिल किया गया था। 0.1 की एक सीमा पर, gyrB प्रतिलिपि 21.1, 20.3, और 20.5 के एक औसत चक्र पर पाया गया. nRT नियंत्रण चक्र औसत 35.9, 35.5, और 35.0 तक नहीं पाए गए थे। द 3 जैविक प्रतिकृतियां, जिसमें 3 तकनीकी प्रतिकृतियां/जैविक प्रतिकृति होती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: प्रतिनिधि वायरल आरएनए वसूली. इन्फ्लुएंजा ए/पीआर/8/1934(H1N1) के 100 PFU/50 L के साथ इंट्राट्रेकल डालने के छह दिनों के बाद चूहों को इच्छामृत्यु दी गई। फेफड़ों को एक्साइज और homogenized किया गया था, और homogenized घोल के 200 डिग्री सेल्सियस एकत्र किया गया था और वायरल आरएनए शोधन से पहले एक 70 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से पारित कर दिया। शुद्ध आरएनए क्रमिक रूप से पतला किया गया था (10-1-10-4) इन्फ्लूएंजा ए एम खंड के प्रवर्धन के बाद. (क) इन्फ्लुएंजा ए आर एन ए का प्रवर्धन भूखंड संक्रमित फेफड़ों से बरामद किया गया और 10-1 -10-4पतला हो गया . (बी)इन्फ्लूएंजा ए एम-खंड का मानक वक्र। थ्रेसहोल्ड $ 0ण्2, त्2 - 0ण्994, ढाल -3.46. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
इस मॉडल का उपयोग माध्यमिक जीवाणु संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक कुशल और पुन: उत्पादन योग्य विधि प्रदान करता है। रोगज़नक़ इनोकुलम के वितरण को कसकर नियंत्रित करने की क्षमता व्यक्ति के अधिक सटीक अवलोकन और प्रत्येक रोगजनक के संयोजनीय प्रभाव को सक्षम करती है। अधिक सामान्य इंट्रानैसल इंस्थाइन रूट में अक्षमताओं ने साहित्य में मौजूद खुराक मात्राओं और सांद्रता में विसंगतियों को कम करने में योगदान दिया है। यह उचित है कि माध्यमिक जीवाणु निमोनिया का अध्ययन करने के लिए एक सटीक murine प्रणाली की कमी जीवाणु विशिष्ट प्रतिक्रियाओं है कि फुफ्फुसीय सह संक्रमण की गंभीरता में योगदान की पहचान निष्कर्षों में देरी हुई है. द्वितीयक जीवाणु संक्रमण के दौरान उग्रअभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक पुनरुत्पादक मॉडल विकसित करने से इन संक्रमणों को सुधारने के लिए टीके या दवा लक्ष्यों की पहचान हो सकती है।
इंट्राट्रेकल इन्स्टिवनेशन चरण सफलतापूर्वक कम श्वसन पथ संक्रमण और रोगजनकों के किसी भी डाउन-स्ट्रीम विश्लेषण को स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। जब इस तकनीक सीखने, यह एक डाई का उपयोग कर अभ्यास करने के लिए उपयोगी हो सकता है (के रूप में तरीकों में वर्णित) संक्रामक सामग्री के प्रशासन से पहले. एक डाई का उपयोग श्वसन पथ में inoculum के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है. एक आम गलती जो हो सकती है वह है श्वासनली के बजाय घेघा में कुंद-नेल की प्रविष्टि। इसके परिणामस्वरूप फेफड़ों के बजाय पेट में इनोकुलम की डिलीवरी होगी। इस गलती को ठीक करने के लिए, सुई को शरीर से आगे दूर कोण दें और इसे श्वासनली में नीचे से गुजरती हैं। एक बार महारत हासिल है, इस प्रक्रिया को बहुत कुशल है और चूहों की बड़ी संख्या के साथ प्रयोगों का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चूहों को एनेस्थेटाइज करने के लिए बैचों में कार्य करना, इंट्राट्रेकल इन्स्टिवनेशन को प्रति माउस लगभग 30 सेकंड में पूरा किया जा सकता है। इसके अलावा, फेफड़ों के चीरा माउस प्रति 2 से 3 मिनट में पूरा किया जा सकता है.
संक्रमित ऊतकों से व्यवहार्य और शुद्ध जीवाणु आरएनए की वसूली प्रतिलिपि विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। RNases सर्वव्यापी हैं और जल्दी से एक प्रयोग15बर्बाद कर सकते हैं . कुछ तरीकों में RNase अवरोधकों का उपयोग करना शामिल है; तथापि, हमने पाया है कि आरएलटी-मेरकैप्टोथेनोल में -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना को ठंडा करना या सभी आरएनसे मुक्त ट्यूबों और अभिकर्मकों का उपयोग करके आरएनए अलगाव के नमूने को तुरंत संसाधित करना RNase संदूषण को कम करने में प्रभावी है। साथ ही, हम अनुशंसा करते हैं कि अधिकतम छह नमूने एक समय में शुद्ध किया जा। छह से अधिक नमूनों को शामिल करने से प्रोटोकॉल चरणों के बीच लंबे समय तक विलंब हो सकता है जो आरएनए अवक्रमण में समाप्त हो सकता है। एक बार शुद्ध, देखभाल भी किसी भी अनावश्यक फ्रीज-थॉ व चक्र से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. इस प्रकार, यदि एक नमूने पर अनेक विश्लेषण किए जाएंगे, तो -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए एलिकोटिंग शुद्ध आरएनए की सिफारिश की जाती है।
यहाँ की समीक्षा की तकनीक के अलावा, इस विधि फेफड़ों16के चीरा और समरूपता से पहले ब्रोन्कियल एवियोलर lavage प्रदर्शन करके पूरक किया जा सकता है. यह पूरे निचले श्वसन पथ के lavage द्वारा या सीवन धागा का उपयोग करके ब्रोन्कियल पेड़ की एक शाखा हाथ शेष शाखा के माध्यम से lavage के बाद प्रतिबंधित करने के लिए पूरा किया जा सकता है। अक्सर यह रोगजनक लोड की वसूली में कमी की ओर जाता है लेकिन एक नमूना प्रदान करता है जहां लैक्टेट डिहाइड्रोजेनेज गतिविधि, सेलुलर जनसंख्या पहचान, और साइटोकीन प्रोफाइल के रूप में जानकारी प्राप्त की जा सकती है16. एक साथ इन आंकड़ों को माध्यमिक जीवाणु निमोनिया के दौरान होने वाली मेजबान-रोगजनक बातचीत की एक अधिक पूरी समझ बना सकते हैं।
जबकि चर्चा की तरीकों माध्यमिक बैक्टीरियल निमोनिया के संदर्भ में किया गया है, वे कम श्वसन संक्रमण के किसी भी murine मॉडल के लिए बढ़ाया जा करने के लिए उपयुक्त हैं; विशेष रूप से, उन है कि कसकर नियंत्रित वितरण और स्थापित inoculum की वसूली से लाभ होगा. इसके अलावा, कई अन्य संक्रमण मार्गों की तरह, इंट्राट्रेकल इन्स्टिभल का उपयोग गैर संक्रामक अनुप्रयोगों में किया जा सकता है, जैसे कि चिकित्सकीय और पर्यावरण यौगिकों का प्रशासन12।
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकनिकोल माइसनर, एमडी/पीएच.डी., मोंटाना राज्य विश्वविद्यालय, इंट्राट्रेकल इन्स्टिकेशन विधि स्थापित करने में उसकी मदद के लिए धन्यवाद देना होगा। यह काम अमेरिका के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), साथ ही मॉनटाना विश्वविद्यालय प्रणाली अनुसंधान पहल (51040-MUSRI2015-013) और Montana विश्वविद्यालय से धन कृषि प्रयोग स्टेशन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911100 | Referred to in text as "0.1 mm silica beads" |
| 21-gauge blunt needle | SAI | B21-150 | 1.5" is recommended. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | DNase used in the accompanying text. |
| FastPrep-24 Classic Instrument | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater" |
| TaqMan AIV-Matrix Reagents | Applied Biosystems | 4405543 | Influenza A M-segment qRT-PCR kit. |
| Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MES-01 | Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house. |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA purification kit. |
| Tissue Grinders | Thermo Fisher Scientific | 02-542-08 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) | Calbiochem | UN2966 |
References
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