यहां, हम निम्न श्वसन पथ में पैदा होने के एक गैर-आक्रामक मार्ग प्रदान करके माध्यमिक जीवाणु निमोनिया अध्ययन में सुधार करने के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं जिसके बाद रोगज़नक़ वसूली और प्रतिलिपि विश्लेषण किया जाता है। इन प्रक्रियाओं reproduible हैं और इस तरह के cannulas, गाइड तारों, या फाइबर ऑप्टिक केबल के रूप में विशेष उपकरणों के बिना किया जा सकता है.
इन्फ्लूएंजा संक्रमण के बाद माध्यमिक बैक्टीरियल निमोनिया लगातार संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत के शीर्ष दस प्रमुख कारणों के भीतर रैंक. तारीख करने के लिए, सह संक्रमण के murine मॉडल प्राथमिक दोनों प्राथमिक और माध्यमिक संक्रमण के रोगों का पता लगाने के लिए विकसित उपकरण किया गया है. इस मॉडल की व्यापकता के बावजूद, पैदा करने की प्रक्रिया, खुराक की मात्रा, और दक्षताओं के बारे में काफी विसंगतियां अध्ययनके बीच प्रचलित हैं। इसके अलावा, इन प्रयासों को संबोधित करने में काफी हद तक अधूरा है कि कैसे रोगज़नक़ सीधे रोग प्रगति के बाद संक्रमण को प्रभावित किया जा सकता है. इसमें हम रोगज़नक़ डिलीवरी, वसूली, और विश्लेषण की एक सटीक विधि प्रदान करते हैं जिसका उपयोग माध्यमिक बैक्टीरियल निमोनिया के murine मॉडल में किया जा सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि इंट्राट्रेकल इन्स्टिवनेशन नियंत्रित मात्रा के कुशल और सटीक वितरण को सीधे और समान रूप से निचले श्वसन पथ में सक्षम बनाता है। फेफड़ों को ठीक करने और रोगज़नक़ बोझ की मात्रा निर्धारित करने के लिए excised किया जा सकता है। संक्रमित फेफड़ों के उच्छेदन के बाद, हम बाद में ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले रोगज़नक़ आरएनए निकालने की विधि का वर्णन करते हैं। यह प्रक्रिया विशेष प्रयोगशाला उपकरणों के उपयोग के बिना वितरण की एक गैर सर्जिकल विधि होने से लाभ करती है और माध्यमिक जीवाणु निमोनिया के लिए रोगजनक योगदान की जांच करने के लिए एक पुनरुत्पाद्य रणनीति प्रदान करती है।
इन्फ्लुएंजा संक्रमण के बाद माध्यमिक जीवाणु निमोनिया संयुक्त राज्य अमेरिका में मृत्यु का एक प्रमुख कारण है और अनुसंधान1,2का सक्रिय क्षेत्र है . द्वितीयक जीवाणु निमोनिया के मौरीन मॉडलों का उपयोग करने के बावजूद रोगजनक आसवन और पूछताछ के संबंध में विसंगतियां3,4,5बनी हुई हैं . इसके अलावा, जबकि कई पिछले प्रयासों इन्फ्लूएंजा के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है कि माध्यमिक जीवाणु संक्रमण के लिए एक वृद्धि हुई susceptibly करने के लिए नेतृत्व, और अधिक हाल के डेटा से पता चलता है जीवाणु रोगज़नक़ की उग्रता विनियमन एक समान है रोग की स्थापना में योगदान6,7,8,9. इन नए डेटा को सह संक्रमण के murine मॉडल में माध्यमिक जीवाणु निमोनिया का पता लगाने के लिए एक और अधिक सटीक विधि की आवश्यकता है कि रोगज़नक़ प्रतिक्रिया में जांच की सुविधा.
इन्फ्लूएंजा सह संक्रमण मॉडल के लिए अद्वितीय, मेजबान जीवों जानबूझकर माध्यमिक जीवाणु एजेंट के प्रशासन से पहले एक प्राथमिक इन्फ्लूएंजा संक्रमण द्वारा प्रतिरक्षा कर रहे हैं. मानव मेजबानों में पाए जाने वाले रोग रोगजनकको सर्वश्रेष्ठ प्रतिकृति करने के लिए, यह आवश्यक है कि प्राथमिक और माध्यमिक एजेंटों दोनों के रोगजनक भार को नियंत्रित किया जाए ताकि प्रत्येक संक्रामक एजेंट के व्यक्ति और संयोजनात्मक प्रभावों का निरीक्षण किया जा सके। सबसे अधिक , चूहों में श्वसन संक्रमण एक इंट्रानैसल प्रशासन3, 4,5,6,10 केमाध्यम से स्थापित किया गया है . इस मार्ग के रूप में inasmuch तकनीकी रूप से सरल होने के लिए उल्लेख किया है और कुछ एकल एजेंट संक्रमण अनुप्रयोगों में उपयुक्त हो सकता है, यह सह संक्रमण मॉडल के लिए अनुपयुक्त है, के रूप में पैदा करने की प्रक्रिया, खुराक मात्रा, और प्रभावकारिता के भीतर अत्यधिक चर रहे हैं प्रकाशित साहित्य3,4,5,6.
माध्यमिक जीवाणु निमोनिया रोगजनन की अधिक पूरी समझ हासिल करने के लिए, मेजबान और रोगजनक दोनों के योगदान पर विचार किया जाना चाहिए। इस दृष्टि से, हमने संक्रमित फेफड़ों से व्यवहार्य बैक्टीरिया और रोगज़नक़ आरएनए की वसूली के लिए एक सीधा और पुन: उत्पादनीय दृष्टिकोण विकसित किया है। इस विधि जीवाणु आरएनए के बाद अलगाव के बाद एक सरलीकृत, गैर इनवेसिव इंट्राट्रेकल पैदा करने की प्रक्रिया का उपयोग करता है। यहां वर्णित इंट्राट्रेकल इन्स्टिभलेशन प्रक्रिया पहले वर्णित विधियों के समान है और यह रोगजनक प्रसव11,12,13तक सीमित नहीं है . कम लागत होने से इस विशेष प्रक्रिया लाभ का उपयोग करें और इस तरह के cannulas, गाइड तारों, या फाइबर ऑप्टिक केबल के रूप में विशेष उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है; इसके अलावा, क्योंकि इस प्रक्रिया गैर इनवेसिव यह murine विषयों पर कम से कम तनाव का बीमा है, टीका यांत्रिकी से एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम करता है, और कई विषयों के संक्रमण के लिए एक कुशल वितरण मार्ग प्रदान करता है. संक्षेप में, isoflurane एनेस्थेटाइज्ड चूहों छेदक से निलंबित कर रहे हैं. फोर्सप्स का उपयोग जीभ को धीरे से समझने के लिए किया जाता है जिसके बाद पूर्व-लोडेड तुला, कुंद-टिप, 21 गेज सुई को श्वासनली में सम्मिलित किया जाता है और रोगज़नक़ लोड की डिलीवरी होती है। इस प्रक्रिया का सत्यापन फुफ्फुसीय डिब्बे में समान रूप से वितरित डाई की दृश्य पुष्टि और जीवाणु लोड की वसूली द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। फिर हम संक्रमित फेफड़ों से व्यवहार्य स्टैफिलोकोकस ऑरियस (एस ऑरियस) को ठीक करने और उच्च गुणवत्ता वाले रोगज़नक़ आरएनए को अलग करने के लिए एक पुनरुत्पाद्य विधि का वर्णन करने के तरीके का प्रदर्शन करते हैं।
इस मॉडल का उपयोग माध्यमिक जीवाणु संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक कुशल और पुन: उत्पादन योग्य विधि प्रदान करता है। रोगज़नक़ इनोकुलम के वितरण को कसकर नियंत्रित करने की क्षमता व्यक्ति के अधिक सटीक अवलोकन और प्रत्येक रोगजनक के संयोजनीय प्रभाव को सक्षम करती है। अधिक सामान्य इंट्रानैसल इंस्थाइन रूट में अक्षमताओं ने साहित्य में मौजूद खुराक मात्राओं और सांद्रता में विसंगतियों को कम करने में योगदान दिया है। यह उचित है कि माध्यमिक जीवाणु निमोनिया का अध्ययन करने के लिए एक सटीक murine प्रणाली की कमी जीवाणु विशिष्ट प्रतिक्रियाओं है कि फुफ्फुसीय सह संक्रमण की गंभीरता में योगदान की पहचान निष्कर्षों में देरी हुई है. द्वितीयक जीवाणु संक्रमण के दौरान उग्रअभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक पुनरुत्पादक मॉडल विकसित करने से इन संक्रमणों को सुधारने के लिए टीके या दवा लक्ष्यों की पहचान हो सकती है।
इंट्राट्रेकल इन्स्टिवनेशन चरण सफलतापूर्वक कम श्वसन पथ संक्रमण और रोगजनकों के किसी भी डाउन-स्ट्रीम विश्लेषण को स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। जब इस तकनीक सीखने, यह एक डाई का उपयोग कर अभ्यास करने के लिए उपयोगी हो सकता है (के रूप में तरीकों में वर्णित) संक्रामक सामग्री के प्रशासन से पहले. एक डाई का उपयोग श्वसन पथ में inoculum के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है. एक आम गलती जो हो सकती है वह है श्वासनली के बजाय घेघा में कुंद-नेल की प्रविष्टि। इसके परिणामस्वरूप फेफड़ों के बजाय पेट में इनोकुलम की डिलीवरी होगी। इस गलती को ठीक करने के लिए, सुई को शरीर से आगे दूर कोण दें और इसे श्वासनली में नीचे से गुजरती हैं। एक बार महारत हासिल है, इस प्रक्रिया को बहुत कुशल है और चूहों की बड़ी संख्या के साथ प्रयोगों का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चूहों को एनेस्थेटाइज करने के लिए बैचों में कार्य करना, इंट्राट्रेकल इन्स्टिवनेशन को प्रति माउस लगभग 30 सेकंड में पूरा किया जा सकता है। इसके अलावा, फेफड़ों के चीरा माउस प्रति 2 से 3 मिनट में पूरा किया जा सकता है.
संक्रमित ऊतकों से व्यवहार्य और शुद्ध जीवाणु आरएनए की वसूली प्रतिलिपि विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। RNases सर्वव्यापी हैं और जल्दी से एक प्रयोग15बर्बाद कर सकते हैं . कुछ तरीकों में RNase अवरोधकों का उपयोग करना शामिल है; तथापि, हमने पाया है कि आरएलटी-मेरकैप्टोथेनोल में -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना को ठंडा करना या सभी आरएनसे मुक्त ट्यूबों और अभिकर्मकों का उपयोग करके आरएनए अलगाव के नमूने को तुरंत संसाधित करना RNase संदूषण को कम करने में प्रभावी है। साथ ही, हम अनुशंसा करते हैं कि अधिकतम छह नमूने एक समय में शुद्ध किया जा। छह से अधिक नमूनों को शामिल करने से प्रोटोकॉल चरणों के बीच लंबे समय तक विलंब हो सकता है जो आरएनए अवक्रमण में समाप्त हो सकता है। एक बार शुद्ध, देखभाल भी किसी भी अनावश्यक फ्रीज-थॉ व चक्र से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. इस प्रकार, यदि एक नमूने पर अनेक विश्लेषण किए जाएंगे, तो -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए एलिकोटिंग शुद्ध आरएनए की सिफारिश की जाती है।
यहाँ की समीक्षा की तकनीक के अलावा, इस विधि फेफड़ों16के चीरा और समरूपता से पहले ब्रोन्कियल एवियोलर lavage प्रदर्शन करके पूरक किया जा सकता है. यह पूरे निचले श्वसन पथ के lavage द्वारा या सीवन धागा का उपयोग करके ब्रोन्कियल पेड़ की एक शाखा हाथ शेष शाखा के माध्यम से lavage के बाद प्रतिबंधित करने के लिए पूरा किया जा सकता है। अक्सर यह रोगजनक लोड की वसूली में कमी की ओर जाता है लेकिन एक नमूना प्रदान करता है जहां लैक्टेट डिहाइड्रोजेनेज गतिविधि, सेलुलर जनसंख्या पहचान, और साइटोकीन प्रोफाइल के रूप में जानकारी प्राप्त की जा सकती है16. एक साथ इन आंकड़ों को माध्यमिक जीवाणु निमोनिया के दौरान होने वाली मेजबान-रोगजनक बातचीत की एक अधिक पूरी समझ बना सकते हैं।
जबकि चर्चा की तरीकों माध्यमिक बैक्टीरियल निमोनिया के संदर्भ में किया गया है, वे कम श्वसन संक्रमण के किसी भी murine मॉडल के लिए बढ़ाया जा करने के लिए उपयुक्त हैं; विशेष रूप से, उन है कि कसकर नियंत्रित वितरण और स्थापित inoculum की वसूली से लाभ होगा. इसके अलावा, कई अन्य संक्रमण मार्गों की तरह, इंट्राट्रेकल इन्स्टिभल का उपयोग गैर संक्रामक अनुप्रयोगों में किया जा सकता है, जैसे कि चिकित्सकीय और पर्यावरण यौगिकों का प्रशासन12।
The authors have nothing to disclose.
लेखकनिकोल माइसनर, एमडी/पीएच.डी., मोंटाना राज्य विश्वविद्यालय, इंट्राट्रेकल इन्स्टिकेशन विधि स्थापित करने में उसकी मदद के लिए धन्यवाद देना होगा। यह काम अमेरिका के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), साथ ही मॉनटाना विश्वविद्यालय प्रणाली अनुसंधान पहल (51040-MUSRI2015-013) और Montana विश्वविद्यालय से धन कृषि प्रयोग स्टेशन.
Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911100 | Referred to in text as "0.1 mm silica beads" |
21-gauge blunt needle | SAI | B21-150 | 1.5" is recommended. |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | DNase used in the accompanying text. |
FastPrep-24 Classic Instrument | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater" |
TaqMan AIV-Matrix Reagents | Applied Biosystems | 4405543 | Influenza A M-segment qRT-PCR kit. |
Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MES-01 | Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house. |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA purification kit. |
Tissue Grinders | Thermo Fisher Scientific | 02-542-08 | |
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) | Calbiochem | UN2966 |