Här presenterar vi metoder för att förbättra sekundär bakteriell pneumoni studier genom att tillhandahålla en icke-invasiv väg av instillation i de nedre luftvägarna följt av patogen återhämtning och avskrift analys. Dessa procedurer är reproducerbara och kan utföras utan specialiserad utrustning såsom kanyl, ledare, eller fiberoptiska kablar.
Sekundära bakteriella lunginflammationer efter influensainfektioner rankas konsekvent inom de tio främsta dödsorsakerna i USA. Hittills har murin modeller av co-infektion varit det primära verktyget utvecklats för att utforska patologier både primära och sekundära infektioner. Trots prevalensen av denna modell, betydande avvikelser när det gäller instillation förfaranden, dos volymer, och effektivitet är vanliga bland studierna. Dessutom har dessa ansträngningar varit i stort sett ofullständiga i att ta itu med hur patogenen kan vara direkt påverkar sjukdomsprogression efter infektion. Häri tillhandahåller vi en exakt metod för patogen leverans, återvinning och analys som ska användas i murina modeller av sekundär bakteriell lunginflammation. Vi visar att intratrakeal instillation möjliggör en effektiv och noggrann leverans av kontrollerade volymer direkt och jämnt in i de nedre luftvägarna. Lungorna kan vara censurerade att återhämta sig och kvantifiera den sjukdomsalstrande bördan. Efter excision av de infekterade lungorna, beskriver vi en metod för att extrahera hög kvalitet patogen RNA för efterföljande transkriptionella analys. Detta förfarande gynnas av att vara en icke-kirurgisk metod för leverans utan användning av specialiserade laboratorieutrustning och ger en reproducerbar strategi för att undersöka patogen bidrag till sekundär bakteriell lunginflammation.
Sekundär bakteriell lunginflammation efter influensainfektion är en ledande dödsorsak i USA och ett aktivt forskningsområde1,2. Trots många studier med murin modeller av sekundär bakteriell lunginflammation, inkonsekvenser om patogenen instillation och förhör förblir3,4,5. Dessutom, medan många tidigare ansträngningar har fokuserat på immunmodulerande effekter av influensa som leder till en ökad mottaglig för sekundär bakteriell infektion, nyare data antyder virulens reglering av bakteriell patogenen är en lika bidragande orsak till inrättandet av sjukdomar6,7,8,9. Dessa nya data nödvändiggör en mer exakt metod för att utforska sekundär bakteriell lunginflammation i murina modeller av samtidig infektion som underlättar utredning av patogenen svar.
Värd organismer är unika för modeller för samtidig infektion med influensa och är avsiktligt immunokomprometterade av en primär influensainfektion före administrering av det sekundära bakterie medlet. För att bäst replikera sjukdomen patogenes observeras i mänskliga värdar, det är viktigt att patogenen belastningen av både primära och sekundära agenter kontrolleras så att Observera de enskilda och kombinatoriska effekterna av varje smittämne. Vanligast, luftvägsinfektioner hos möss har fastställts genom en intranasal administrering3,4,5,6,10. Eftersom denna väg noteras för att vara tekniskt enkel och kan vara lämpligt i vissa Single-agent infektions applikationer, det är olämpligt för co-infektion modeller, som instillation förfaranden, dos volymer, och effekt är mycket varierande inom publicerad litteratur3,4,5,6.
För att få en mer fullständig förståelse av sekundär bakteriell pneumoni patogenes, bidrag av både värd och patogenen måste övervägas. För detta ändamål har vi utvecklat en enkel och reproducerbar metod för återvinning av livskraftiga bakterier och patogen RNA från infekterade lungor. Denna metod använder en förenklad, icke-invasiv intratrakeal instillation förfarande följt av efterföljande isolering av bakteriell RNA. Intratrakeal instillation förfarande som beskrivs häri liknar tidigare beskrivna metoder och är inte begränsat till patogen leverans11,12,13. Användning av detta särskilda förfarande gynnas av att vara låg kostnad och kräver inte användning av specialiserad utrustning såsom kanyl, ledare, eller fiberoptisk kabel; Dessutom, eftersom detta förfarande är icke-invasiv det försäkrar minimal stress på murina ämnen, minimerar ett inflammatoriskt svar från inympning mekanik, och ger en effektiv leveransväg för infektion av flera försökspersoner. Kortfattat, isofluran sövda möss är upphängda från incisors. Tång används för att försiktigt ta tag i tungan följt av införandet av en förladdad böjd, Blunt-tippas, 21-gauge nål i luftstrupen och leverans av patogen belastning. Validering av detta förfarande påvisas genom visuell bekräftelse av färgämne jämnt fördelat i lung facket och återhämtning av bakteriell belastning. Vi visar sedan hur man kan återvinna livskraftiga Staphylococcus aureus (S. aureus) från infekterade lungor och beskriva en reproducerbar metod för att isolera hög kvalitet patogen RNA.
Användning av denna modell ger en mycket effektiv och reproducerbar metod för att studera sekundära bakteriella infektioner. Förmågan att tätt kontrollera leveransen av patogenen inokulum möjliggör mer precisa observationer av individen och kombinatoriska effekter av varje patogen. Ineffektivitet i den vanligare intranasala instillation rutten har sannolikt bidragit till avvikelser i dos volymer och koncentrationer som finns i litteraturen. Det är rimligt att avsaknaden av en exakt murin system för att studera sekundär bakteriell lunginflammation har fördröjt fynd identifiera bakteriella specifika svar som bidrar till svårighetsgraden av pulmonell Co-infektioner. Utveckla en reproducerbar modell för att studera virulensuttryck under sekundära bakteriella infektioner kan leda till identifiering av vaccin eller läkemedel mål att lindra dessa infektioner.
Den intratrakeal instillation steg är avgörande för att framgångsrikt upprätta en lägre luftvägsinfektion och eventuella ner-Stream analys av patogener. När man lär sig denna teknik, kan det vara bra att öva med hjälp av ett färgämne (som beskrivs i metoderna) före administrering av smittsamt material. Med hjälp av ett färgämne möjliggör direkt visualisering av inokulum i andningsorganen. Ett vanligt misstag som kan inträffa är införandet av den trubbiga-nål i matstrupen snarare än luftstrupen. Detta kommer att resultera i leverans av inokulum i magen snarare än lungorna. För att rätta till detta misstag, vinkel nålen längre bort från kroppen och passera ner i luftstrupen. När behärskar, är denna procedur mycket effektiv och kan användas för att genomföra experiment med ett stort antal möss. Att arbeta i omgångar för att bedra möss, intratrakeal instillation kan slutföras i cirka 30 sekunder per mus. Dessutom kan excision av lungorna slutföras i 2 till 3 minuter per mus.
Återvinning av livskraftiga och rena bakteriella RNA från infekterade vävnader är avgörande för avskrift analys. Rnases är allestädes närvarande och kan snabbt förstöra ett experiment15. Vissa metoder inkluderar att använda RNase hämmare; Vi har dock funnit att frysning av provet vid-80 ° c i RLT-ß-merkaptoetanol eller omedelbart bearbetning av provet för RNA-isolering med alla RNase fria rör och reagenser är effektiva på att minska RNase kontaminering. Dessutom rekommenderar vi att högst sex prover renas på en gång. Inklusive mer än sex prover kan resultera i långvariga fördröjningar mellan protokoll steg som kan kulminera i RNA-nedbrytning. När renas, försiktighet bör också vidtas för att undvika onödiga frysa-Tina cykler. Om flera analyser görs på ett prov, rekommenderas därför att alicitering renat RNA för förvaring vid-80 ° c.
Förutom de tekniker som granskas häri, denna metod kan kompletteras genom att utföra bronkial alveolär sköljning före excision och homogenifiering av lungorna16. Detta kan åstadkommas genom sköljning av hela nedre luftvägarna eller genom att använda suturen tråd för att begränsa en förgrening armen av luftrör trädet följt av sköljning genom den återstående grenen. Ofta detta leder till en minskning av återhämtningen av patogenen belastningen men ger ett prov varefter information såsom laktatdehydrogenas aktivitet, cellulär populations identitet, och cytokin profiler kan erhållas16. Tillsammans dessa data kan bilda en mer fullständig förståelse av värd-patogenen interaktioner som inträffar under sekundär bakteriell lunginflammation.
Medan de metoder som diskuteras har varit inom ramen för sekundär bakteriell lunginflammation, de är lämpliga att utvidgas till någon murin modell av lägre luftvägsinfektion; specifikt, de som skulle gynnas av väl kontrollerad leverans och återvinning av det installerade inoculum. Dessutom, liksom många andra infektions vägar, den intratrakeal instillation kan utnyttjas i icke-infektiösa tillämpningar, såsom administrering av Therapeutics och miljö föreningar12.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle tacka Nicole Meissner, MD/pH.d., Montana State University, för hennes hjälp med att etablera intratrakeal instillation metod. Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health (bidrag NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), samt medel från Montana University system Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) och Montana State University Jordbruket experiment Station.
Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911100 | Referred to in text as "0.1 mm silica beads" |
21-gauge blunt needle | SAI | B21-150 | 1.5" is recommended. |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | DNase used in the accompanying text. |
FastPrep-24 Classic Instrument | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater" |
TaqMan AIV-Matrix Reagents | Applied Biosystems | 4405543 | Influenza A M-segment qRT-PCR kit. |
Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MES-01 | Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house. |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA purification kit. |
Tissue Grinders | Thermo Fisher Scientific | 02-542-08 | |
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) | Calbiochem | UN2966 |