Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En exakt patogen leverans och återvinnings system för murina modeller av sekundär bakteriell pneumoni

doi: 10.3791/59566 Published: September 21, 2019

Summary

Här presenterar vi metoder för att förbättra sekundär bakteriell pneumoni studier genom att tillhandahålla en icke-invasiv väg av instillation i de nedre luftvägarna följt av patogen återhämtning och avskrift analys. Dessa procedurer är reproducerbara och kan utföras utan specialiserad utrustning såsom kanyl, ledare, eller fiberoptiska kablar.

Abstract

Sekundära bakteriella lunginflammationer efter influensainfektioner rankas konsekvent inom de tio främsta dödsorsakerna i USA. Hittills har murin modeller av co-infektion varit det primära verktyget utvecklats för att utforska patologier både primära och sekundära infektioner. Trots prevalensen av denna modell, betydande avvikelser när det gäller instillation förfaranden, dos volymer, och effektivitet är vanliga bland studierna. Dessutom har dessa ansträngningar varit i stort sett ofullständiga i att ta itu med hur patogenen kan vara direkt påverkar sjukdomsprogression efter infektion. Häri tillhandahåller vi en exakt metod för patogen leverans, återvinning och analys som ska användas i murina modeller av sekundär bakteriell lunginflammation. Vi visar att intratrakeal instillation möjliggör en effektiv och noggrann leverans av kontrollerade volymer direkt och jämnt in i de nedre luftvägarna. Lungorna kan vara censurerade att återhämta sig och kvantifiera den sjukdomsalstrande bördan. Efter excision av de infekterade lungorna, beskriver vi en metod för att extrahera hög kvalitet patogen RNA för efterföljande transkriptionella analys. Detta förfarande gynnas av att vara en icke-kirurgisk metod för leverans utan användning av specialiserade laboratorieutrustning och ger en reproducerbar strategi för att undersöka patogen bidrag till sekundär bakteriell lunginflammation.

Introduction

Sekundär bakteriell lunginflammation efter influensainfektion är en ledande dödsorsak i USA och ett aktivt forskningsområde1,2. Trots många studier med murin modeller av sekundär bakteriell lunginflammation, inkonsekvenser om patogenen instillation och förhör förblir3,4,5. Dessutom, medan många tidigare ansträngningar har fokuserat på immunmodulerande effekter av influensa som leder till en ökad mottaglig för sekundär bakteriell infektion, nyare data antyder virulens reglering av bakteriell patogenen är en lika bidragande orsak till inrättandet av sjukdomar6,7,8,9. Dessa nya data nödvändiggör en mer exakt metod för att utforska sekundär bakteriell lunginflammation i murina modeller av samtidig infektion som underlättar utredning av patogenen svar.

Värd organismer är unika för modeller för samtidig infektion med influensa och är avsiktligt immunokomprometterade av en primär influensainfektion före administrering av det sekundära bakterie medlet. För att bäst replikera sjukdomen patogenes observeras i mänskliga värdar, det är viktigt att patogenen belastningen av både primära och sekundära agenter kontrolleras så att Observera de enskilda och kombinatoriska effekterna av varje smittämne. Vanligast, luftvägsinfektioner hos möss har fastställts genom en intranasal administrering3,4,5,6,10. Eftersom denna väg noteras för att vara tekniskt enkel och kan vara lämpligt i vissa Single-agent infektions applikationer, det är olämpligt för co-infektion modeller, som instillation förfaranden, dos volymer, och effekt är mycket varierande inom publicerad litteratur3,4,5,6.

För att få en mer fullständig förståelse av sekundär bakteriell pneumoni patogenes, bidrag av både värd och patogenen måste övervägas. För detta ändamål har vi utvecklat en enkel och reproducerbar metod för återvinning av livskraftiga bakterier och patogen RNA från infekterade lungor. Denna metod använder en förenklad, icke-invasiv intratrakeal instillation förfarande följt av efterföljande isolering av bakteriell RNA. Intratrakeal instillation förfarande som beskrivs häri liknar tidigare beskrivna metoder och är inte begränsat till patogen leverans11,12,13. Användning av detta särskilda förfarande gynnas av att vara låg kostnad och kräver inte användning av specialiserad utrustning såsom kanyl, ledare, eller fiberoptisk kabel; Dessutom, eftersom detta förfarande är icke-invasiv det försäkrar minimal stress på murina ämnen, minimerar ett inflammatoriskt svar från inympning mekanik, och ger en effektiv leveransväg för infektion av flera försökspersoner. Kortfattat, isofluran sövda möss är upphängda från incisors. Tång används för att försiktigt ta tag i tungan följt av införandet av en förladdad böjd, Blunt-tippas, 21-gauge nål i luftstrupen och leverans av patogen belastning. Validering av detta förfarande påvisas genom visuell bekräftelse av färgämne jämnt fördelat i lung facket och återhämtning av bakteriell belastning. Vi visar sedan hur man kan återvinna livskraftiga Staphylococcus aureus (S. aureus) från infekterade lungor och beskriva en reproducerbar metod för att isolera hög kvalitet patogen RNA.

Protocol

Alla metoder överensstämmer med National Institutes of Health riktlinjer och godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid Montana State University.

1. intratracheal instillation

  1. Förbered en arbetsyta som innehåller följande förbrukningsmaterial: en intubationsplattform, en steril 1 mL spruta, sterila trubbiga tippar, steril 21-gauge trubbig nål och två koniska rör för att förvara sprutan och tången.
    Obs: intubation plattformar kan köpas kommersiellt eller konstrueras i egen. Den intubation plattform som används här konstruerades med 0,25 tum plexiglas. Kort, värme applicerades på plexiglaset och brädan är böjd till en ungefärlig 65 ° invändig vinkel. På utsidan sidan av intubation plattform, två maskinskruvar var seedade 3 inches isär och en gummi-band avbröts mellan de två skruvarna.
  2. Bered patogenet inokulum genom att seriellt späda provet så att den önskade slutkoncentrationen erhålls i en total volym av 50 μl. Förvara inokulum på is.
  3. Bär sterila handskar, böj en 21 G Blunt-tippad nål till cirka 35 °.
    Obs: en separat nål behövs för varje mus.
  4. Fixera den böjda 21 G-nålen med trubbig nål till en 1 mL spruta. Dra en 100 μL luftkudde i sprutan följt av 50 μL av smittämnet. Placera den laddade nålen och sprutan på en plats som är lättillgänglig för den dominerande handen.
  5. Djupt söva en mus med en 4% isofluran/syre blandning eller liknande iacuc godkänd metod för anestesi. Ordentlig anestesidjup erhålls vanligtvis när andningen priser långsam till cirka 1 inandning per 5-8 s och kan bekräftas genom att nypa en bihang och Observera ingen reaktion från musen.
    Anmärkning: denna metod för anestesi förutsatt en tillräcklig anestetization varaktighet på cirka 1,5 min. Detta var tillräckligt för medlemmar i vårt labb att lära sig och utföra detta instillation förfarande; men andra institutionellt godkända anestesi metoder kan användas11,12,13.
  6. Ta bort den sövda musen från anestesi kammaren och stoppa musen på intubation plattformen från maxillary incisors.
  7. För att öppna en tydlig passage in i luftstrupen, Använd den trubbiga tippade tången för att försiktigt greppa och förlänga tungan utanför munnen. Överför tungan från tångips i tummen och pekfingret på den icke-dominerande handen.
  8. Hålla tungan i den icke-dominerande handen och plocka upp den förladdade sprutan. Rikta den böjda änden av nålen bort från kroppen och sätt in nålen i munhålan till basen av tungan.
  9. Med nålen vid basen av tungan, försiktigt vinkel handleden för att orsaka en liten knuff av nålen bort från kroppen. Detta steg försäkrar nålen kommer att införas i luftstrupen och inte matstrupen.
  10. Sakta styra nålen ner i luftstrupen; ofta en liten fästing känns som nålen passerar genom vokala luckan. Passera nålen genom luftstrupen tills lätt motstånd känns som nålen stöter på Carina.
  11. Lyft nålen något i den proximala riktningen för att suspendera nålen ovanför Carina. Detta möjliggör leverans till de två primära bronkerna. Tryck ned sprutans kolv helt för att ge den smittsamma belastningen. Ta bort nålen från luftstrupen genom att lyfta uppåt och kassera.
  12. Ta bort musen från intubation plattformen genom att deprimerande gummibandet men bibehålla hålla musen i upprätt läge. Blockera näs luftvägarna genom att placera ett finger direkt över Nares. Håll denna position i ca 1 min eller tills flera djupa andetag observeras.
    Anmärkning: detta sista steg säkerställer att den totala inokulum volymen levereras i de nedre luftvägarna.
  13. Tillbaka musen till sin bur och observera en fullständig återhämtning från anestesi.

2. excision av infekterade lungor

  1. Arbeta inom en laminär Flow Hood för att bibehålla sterilitet, Förbered en arbetsyta med följande: en skala och steril väg båt, en dissektion plattform, en dissektion kit som innehåller sax och pinps, steril RNAse-fri PBS, och steril gasväv.
  2. Euthanize en infekterad mus med CO2 eller liknande IACUC godkänd metod för dödshjälp.
  3. Placera en infekterad mus på en dissekera plattform och säkra musen med hjälp av stift i slutet av varje bihang. Spraya musen med etanol för att upprätthålla sterilitet av arbetsytorna.
  4. Med början vid umbilicus, Använd ett par tång för att lyfta huden och göra ett snitt upp till basen av luftstrupen. Greppa huden på vardera sidan av det initiala snittet, dra bort huden från kroppen och skär genom vävnads anslutningarna.
    Obs: det kan vara bra att göra flera laterala nedskärningar över huden för att avslöja mer av bröstkorg regionen.
  5. Börjar vid basen av xiphoid processen, göra ett litet snitt med avsikt att punktera membranet. Detta resulterar i en ökning av trycket i brösthålan som gör att lungorna att dra tillbaka. Med lungorna indragna fortsätta snittet för att frigöra membranet.
  6. Ta bort revbenen genom att göra ett snitt längs båda sidor av bröstkorgen. Detta kommer att fullt exponera brösthålan och lungorna.
  7. Att punktskatter på lungorna, ta tag i basen av hjärtat med tång och lyft uppåt. Placera saxen bakom lungorna och börja göra små snitt genom vävnads anslutningarna samtidigt fortsätta att lyfta hjärtat uppåt.
  8. När lungorna har varit excised, placera dem på den sterila gasväv och ta bort hjärtat. Hjärtat kan lätt avlägsnas genom att lyfta bort det från lungorna med tången och skära de återstående vävnads anslutningarna.
  9. Överför lungorna till en pre-tared väga båten och registrera vikten.
  10. Efter att lungorna har vägts, överföra dem till steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillfälligt lagra dem på is tills de går vidare till patogen återhämtning och analys steg.

3. patogen återhämtning och analys

  1. Fortsätt att arbeta inom en laminär Flow Hood, Förbered en arbetsyta med följande material: en vävnadslipmaskin, steril RNAse-fri PBS, buffert RLT kompletteras med ß-merkaptoetanol (1:100), och 1,5 mL RNAse-fria microcentrifug rör.
    Varning: ß-merkaptoetanol kan vara farligt vid hudkontakt, förtäring, kontakt med ögonen eller inandning. Spädning av ß-merkaptoetanol till buffertrlt ska göras i ett draghuv.
  2. Börja med att först tillsätta 1 mL steril RNAse-fri PBS till vävnadslipmaskinen. När den är fylld, förvara vävnadslipmaskinen på is.
  3. Förbered en serie av sterila RNAse-fria seriella utspädnings rör som kommer att användas för att kvantifiera den bakterie belastning som återvinns från de infekterade lungorna. Detta åstadkoms enklast genom att man aliciterar 900 μL sterilt vatten i varje mikrocentrifug rör följt av seriell utspädning av patogenen inoculum.
    Anmärkning: antalet spädnings rör som är nödvändiga för noggrann uppräkning av patogenen varierar beroende på initial patogen inmatning och infektionsduration. Detta måste bestämmas empiriskt.
  4. Med hjälp av sterila tång, överföra lungorna till den beredda vävnadslipmaskinen och grundligt homogenisera vävnaden genom att trycka ner på piedestal medan roterande.
  5. Öppna vävnadslipmaskinen och alikvot 100 μL av det homogeniserade provet i den första av de beredda seriella utspädnings rören. Seriellt späda proverna och räkna upp CFUs genom plätering på näringsagar. CFUs kan registreras som CFUs/mL eller CFUs/mL/mg av lungvävnad.
    Anmärkning: i detta steg kan ytterligare 200 μL av det homogeniserade provet avlägsnas för rening av virus-RNA (se tabell över material) eller lagras vid-80 ° c för framtida analys.
  6. Efter att alikvoter har avlägsnats för CFU-bestämning och/eller viral RNA-isolering, Byt ut slippiedestalen och pelleten den homogeniserade vävnaden genom centrifugering vid 4 000 rpm (3724 x g) under 10 min vid 4 ° c.
  7. Ta bort supernatanten från pelleterat prov med hjälp av en pipett och placera den i ett 1,5 mL microcentrifugerör.
    Anmärkning: supernatanten är fri från bakterier och kan förvaras vid-80 ° c för analys av lösliga värden och utsöndras patogena faktorer.
  8. Omsuspendera den homogeniserade vävnads pelleten genom pipettering eller vortexa i 700 μl buffert RLT-ß-merkaptoetanol och överför provet till ett sterilt RNase-fritt 1,5 ml microcentrifugerör.
    Obs: på denna punkt proverna kan lagras vid-80 ° c i flera månader.
  9. Rena RNA med smärre modifieringar av tillverkarens protokoll för en renings sats (se tabell över material); Se Voyich et al. 200814.
    1. Överför homogeniserad lung flytgödsel till ett 2 ml microcentrifugerör som innehåller 0,1 mm kiseldioxid pärlor och bearbetas via en pärlvisp för 20 s vid 6 m/s.
    2. Centrifugera provet med 1 500 rpm i 3 minuter. Efter centrifugering, Pipettera supernatanten till ett nytt 1,5 mL microcentrifugerör.
    3. Tillsätt 350 μL 96% – 100% etanol till provet och blanda noggrant med pipettering eller inversion.
    4. Överför 700 μL av provet till en renings kolumn placerad i ett 2 mL uppsamlings rör. Centrifugera provet vid ≥ 8 000 x g för 15 s och kassera genomflödet. Kör ett överflödigt prov genom samma kolumn som beskrivits ovan.
    5. Tvätta kolonnen med 700 μL buffert RW1 och centrifugera prov vid ≥ 8 000 x g för 15 s. Kassera genomflödet och överför kisel membran kolonnen till ett nytt 2 ml samlingsrör.
    6. Applicera 500 μL buffert RPE i kolumnen. Tvätta kolonnen genom centrifugering vid ≥ 8 000 x g under 15 s. Kassera genomflödet.
    7. Applicera ytterligare 500 μL buffert RPE i RNeasy-kolonnen och centrifugera vid 8 000 x g i 2 min. Kassera genomflöde och centrifugera kolonnen vid ≥ 10 000 x g i 1 min.
    8. För att eluera renat RNA, börja med att överföra kolonnen till ett nytt 1,5 mL RNAse-fritt microcentrifugerör. Pipettera över 50 μL av RNase-fritt vatten direkt på kiselgel membranet i kolonnen och centrifugera vid ≥ 8000 x g i 1 min.
      Anmärkning: det eluerade RNA kan köras över samma kolumn igen för att öka RNA-avkastningen.
    9. Tillsätt 50 μL av RNase-fritt vatten till det renade RNA för att få den totala volymen till 100 μL. alikvot 350 μL RLT-ß-merkaptoetanol följt av 250 μL 96% – 100% etanol till provet och blanda grundligt genom pipettering eller inversion.
    10. Applicera provet på en renings kolonn placerad i ett samlingsrör och centrifugera vid ≥ 8000 x g för 15 s. Kassera genomflödet och Byt ut Samlingsröret.
    11. Tvätta kolonnen genom att tillsätta 350 μL buffert RW1 följt av centrifugering vid ≥ 8000 x g i 15 s.
    12. Bered en DNase-lösning som innehåller cirka 27 Kunitz-enheter genom att tillsätta 10 μL DNase-lager (750 Kunitz enheter/mL) till 70 μL buffertrdd. Tillsätt 80 μL DNase-lösning direkt på kiselgel membranet och inkubera provet i 15 minuter vid rumstemperatur.
    13. Tvätta kolonnen med 350 μL buffert RW1 och centrifugera vid ≥ 8000 x g i 15 s och kassera genomflödet.
    14. Upprepa steg 3.9.6 – 3.9.8 att rena RNA.
      Anmärkning: det rekommenderas att upprepa RNA Clean-up förfarande genom att följa steg 3.9.9 – 3.9.10 och 3.9.6 – 3.9.8 (Skip DNase steg 3.9.11 – 3.9.13). Denna ytterligare sanering det resulterar i mycket hög kvalitet RNA.
  10. RNA-kapacitet kan kvantifieras med hjälp av en spektrofotometer med avläsningar vid 260 nM för bestämning av koncentration och 260:280 nM för renhet. Efter RNA-avkastning erhålls, standardisera koncentrationen av varje RNA-prov till 50 ng/μL.
    Anmärkning: det rekommenderas att göra flera alikvoter vid en koncentration av 50 ng/μL för att undvika frysning/Tina cykler som kan leda till RNA-nedbrytning.
  11. Förvara det renade RNA vid-80 ° c eller Använd omedelbart för avskrift analys.
    Obs: i tidigare publikationer var RNA från 3 – 5 möss poolade för avskrift analys. Genom optimering av ovanstående teknik, RNA från 1 mus har empiriskt fastställts som tillräcklig för avskrift analys (80-120 ng/μL).

Representative Results

Figur 1 använder en 0,1% vikt/volym Coomassie lysande blå lösning för att visa att en intratrakeal instillation levererar inokulum direkt och jämnt inom de nedre luftvägarna. Figur 2 visar att bakterierna (S. aureus) cfus återvinns direkt från homogeniserad lungvävnad. Figur 3 visar användningen av detta system för exakt leverans och återvinning av inokulum i de nedre luftvägarna genom plottning av input och återhämtning cfus från enskilda möss. Figur 4 visar QRT-PCR-amplifieringskurvan hos bakterien Housekeeping Gene gyrb för att påvisa att bakteriernas RNA kan extraheras direkt från infekterad LUNGvävnad med minimal DNA-kontamination. Figur 5 visar konstruktionen av en standardkurva med hjälp av QRT-PCR-amplifiering av influensa a-virus M-segmentet för att demonstrera viral RNA kan extraheras direkt från infekterad lungvävnad.

Figure 1
Figur 1: Intratracheal instillation möjliggör jämn fördelning i de nedre luftvägarna. (a, B) Oinfekterade lungor var censurerade från en frisk mus efter intratrakeal instillation av steril PBS och fotograferade från (a) dorsala och (B) ventrala perspektiv. (C, D) 50 μl av en 0,1% Coomassie briljant blå lösning administrerades till en sövda mus via intratrakeal administrering. C) dorsala. D) ventrala. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativ återhämtning av bakteriell CFUs från infekterade lung homogenate. Lungor var censurerade en dag efter utmaningen med S. aureus. Efter homogenifiering späddes 100 μL av lung uppslamningen genom 10-6. Att räkna upp CFUs återvinnas, 10 μL droppar var pläterade från 10-5 och 10-6 spädningar på tryptic soja agar (TSA) och inkuberas vid 37 ° c med 5% C02 över natten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: exakt leverans och återvinning av patogenen inokulum efter intratrakeal administrering. Möss delades in i två grupper som innehöll tre möss per grupp. Möss utsattes för intratrakeal instillation av S. aureus vid 1 x 108 (låg) och 2 x 108 (hög) CFU/ml. En timme efter infektion, var möss euthanized och lungorna var censurerade att demonstrera precisionen i instillation och återhämtning. Bakteriell inokulum och bakterier återvinns från lungan homogena var pläterade på TSA (tryptic soja agar). Inga signifikanta skillnader rapporterades mellan bakteriell tillförsel och återhämtning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: representativ bakteriell RNA-återhämtning och renhet. Sex timmar efter intratrakeal instillation med 1 x 108 CFU/50 μl av S. aureus, var möss euthanized. Lungorna var censurerade och homogeniserade följt av resuspension av lungan flytgödsel i buffert RLT-ß-merkaptoetanol. RNA renades enligt beskrivningen i steg 3,914. qRT-PCR användes för att detektera utskrifter av bakteriens städ Gene Gyrb. En kontroll som inte innehåller någon omvänd transkriptas (nRT) inkluderades för att påvisa renheten hos det RNA som återfanns. Vid ett tröskelvärde på 0,1 upptäcktes Gyrb -transkriptioner med en genomsnittlig cykel på 21,1, 20,3 och 20,5. nRT-kontroller upptäcktes inte förrän cykel medelvärden 35,9, 35,5 och 35,0. n = 3 biologiska replikat, innehållande 3 tekniska replikat/biologisk replikat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: representativ viral RNA-återhämtning. Sex dagar efter intratrakeal instillation med 100 PFU/50 μl influensa A/PR/8/1934 (H1N1), var möss euthanized. Lungorna var censurerade och homogeniserade, och 200 μl av den homogeniserade slam samlades och passerade genom en 70 μm cell SIL före viral RNA rening. Renat RNA var seriellt utspädd (10-1-10-4) följt av amplifiering av influensa A M-segmentet. Aamplifiering av influensa a-RNA som återhämtat sig från en infekterad lunga och späddes 10-1– 10-4. B) standard kurva för influensa A M-segmentet. Tröskelvärde = 0,2, R2 = 0,994, lutning =-3,46. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Användning av denna modell ger en mycket effektiv och reproducerbar metod för att studera sekundära bakteriella infektioner. Förmågan att tätt kontrollera leveransen av patogenen inokulum möjliggör mer precisa observationer av individen och kombinatoriska effekter av varje patogen. Ineffektivitet i den vanligare intranasala instillation rutten har sannolikt bidragit till avvikelser i dos volymer och koncentrationer som finns i litteraturen. Det är rimligt att avsaknaden av en exakt murin system för att studera sekundär bakteriell lunginflammation har fördröjt fynd identifiera bakteriella specifika svar som bidrar till svårighetsgraden av pulmonell Co-infektioner. Utveckla en reproducerbar modell för att studera virulensuttryck under sekundära bakteriella infektioner kan leda till identifiering av vaccin eller läkemedel mål att lindra dessa infektioner.

Den intratrakeal instillation steg är avgörande för att framgångsrikt upprätta en lägre luftvägsinfektion och eventuella ner-Stream analys av patogener. När man lär sig denna teknik, kan det vara bra att öva med hjälp av ett färgämne (som beskrivs i metoderna) före administrering av smittsamt material. Med hjälp av ett färgämne möjliggör direkt visualisering av inokulum i andningsorganen. Ett vanligt misstag som kan inträffa är införandet av den trubbiga-nål i matstrupen snarare än luftstrupen. Detta kommer att resultera i leverans av inokulum i magen snarare än lungorna. För att rätta till detta misstag, vinkel nålen längre bort från kroppen och passera ner i luftstrupen. När behärskar, är denna procedur mycket effektiv och kan användas för att genomföra experiment med ett stort antal möss. Att arbeta i omgångar för att bedra möss, intratrakeal instillation kan slutföras i cirka 30 sekunder per mus. Dessutom kan excision av lungorna slutföras i 2 till 3 minuter per mus.

Återvinning av livskraftiga och rena bakteriella RNA från infekterade vävnader är avgörande för avskrift analys. Rnases är allestädes närvarande och kan snabbt förstöra ett experiment15. Vissa metoder inkluderar att använda RNase hämmare; Vi har dock funnit att frysning av provet vid-80 ° c i RLT-ß-merkaptoetanol eller omedelbart bearbetning av provet för RNA-isolering med alla RNase fria rör och reagenser är effektiva på att minska RNase kontaminering. Dessutom rekommenderar vi att högst sex prover renas på en gång. Inklusive mer än sex prover kan resultera i långvariga fördröjningar mellan protokoll steg som kan kulminera i RNA-nedbrytning. När renas, försiktighet bör också vidtas för att undvika onödiga frysa-Tina cykler. Om flera analyser görs på ett prov, rekommenderas därför att alicitering renat RNA för förvaring vid-80 ° c.

Förutom de tekniker som granskas häri, denna metod kan kompletteras genom att utföra bronkial alveolär sköljning före excision och homogenifiering av lungorna16. Detta kan åstadkommas genom sköljning av hela nedre luftvägarna eller genom att använda suturen tråd för att begränsa en förgrening armen av luftrör trädet följt av sköljning genom den återstående grenen. Ofta detta leder till en minskning av återhämtningen av patogenen belastningen men ger ett prov varefter information såsom laktatdehydrogenas aktivitet, cellulär populations identitet, och cytokin profiler kan erhållas16. Tillsammans dessa data kan bilda en mer fullständig förståelse av värd-patogenen interaktioner som inträffar under sekundär bakteriell lunginflammation.

Medan de metoder som diskuteras har varit inom ramen för sekundär bakteriell lunginflammation, de är lämpliga att utvidgas till någon murin modell av lägre luftvägsinfektion; specifikt, de som skulle gynnas av väl kontrollerad leverans och återvinning av det installerade inoculum. Dessutom, liksom många andra infektions vägar, den intratrakeal instillation kan utnyttjas i icke-infektiösa tillämpningar, såsom administrering av Therapeutics och miljö föreningar12.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna skulle tacka Nicole Meissner, MD/pH.d., Montana State University, för hennes hjälp med att etablera intratrakeal instillation metod. Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health (bidrag NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), samt medel från Montana University system Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) och Montana State University Jordbruket experiment Station.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911100 Referred to in text as "0.1 mm silica beads"
21-gauge blunt needle SAI B21-150 1.5" is recommended.
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 DNase used in the accompanying text.
FastPrep-24 Classic Instrument MP Biomedicals 116004500 FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater"
TaqMan AIV-Matrix Reagents Applied Biosystems 4405543 Influenza A M-segment qRT-PCR kit.
Intubation Stand Kent Scientific ETI-MES-01 Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house.
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904 Viral RNA purification kit.
Tissue Grinders Thermo Fisher Scientific 02-542-08
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) Calbiochem UN2966

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013. National Center for Health Statistics. 64, (2), at http://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr64/nvsr64_02.pdf 1 (2013).
  2. Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics. Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).
  3. Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia. The Journal of Infectious Diseases. 201, (4), 508-515 (2010).
  4. Shepardson, K. M., et al. Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection. mBio. (2016).
  5. Miller, M. A., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLOS ONE. 7, (2), 31359 (2012).
  6. Robinson, K. M., et al. Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production. Journal of Infectious Diseases. 209, (6), 865-875 (2014).
  7. Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease. mBio. 7, (4), (2016).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. 218, (5), 809-813 (2018).
  9. Shahangian, A., et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice. Journal of Clinical Investigation. 119, (7), 1910-1920 (2009).
  10. McAuley, J. L., et al. Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia. Cell Host and Microbe. 2, (4), 240-249 (2007).
  11. Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, (2), 222-230 (2008).
  12. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  13. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  14. Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis. Methods in molecular biology. 431, Clifton, N.J. 109-122 (2008).
  15. Dyer, K., Rosenberg, H. The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense. Molecular Diversity. 10, (4), 585-597 (2006).
  16. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
En exakt patogen leverans och återvinnings system för murina modeller av sekundär bakteriell pneumoni
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).More

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter