Her præsenterer vi metoder til at forbedre sekundær bakteriel lungebetændelse undersøgelser ved at give en ikke-invasiv rute af instillation i de nedre luftveje efterfulgt af patogen opsving og transkriptionen analyse. Disse procedurer er reproducerbare og kan udføres uden specialiseret udstyr som kanyle, guide ledninger eller fiberoptiske kabler.
Sekundære bakterielle pneumonier efter influenza infektioner konsekvent rang i top ti førende dødsårsager i USA. Til dato, murine modeller af co-infektion har været det primære værktøj udviklet til at udforske patologier af både primære og sekundære infektioner. På trods af forekomsten af denne model, er der betydelige forskelle med hensyn til instillation procedurer, dosismængder, og effektivitet er udbredt blandt undersøgelser. Desuden har disse bestræbelser været stort set ufuldstændige i håndteringen af, hvordan patogenet kan have direkte indflydelse på sygdomsprogression efter infektion. Heri giver vi en præcis metode til patogen levering, nyttiggørelse og analyse, der skal anvendes i murine modeller af sekundær bakteriel lungebetændelse. Vi viser, at intratrakeal instillation muliggør en effektiv og præcis levering af kontrollerede volumener direkte og jævnt ind i de nedre luftveje. Lungerne kan exciseres for at inddrive og kvantificere patogenet. Efter excision af de inficerede lunger, vi beskrive en metode til at udtrække høj kvalitet patogen RNA for efterfølgende transkriptional analyse. Denne procedure nyder godt af at være en ikke-kirurgisk metode til levering uden brug af specialiseret laboratorieudstyr og giver en reproducerbar strategi for at undersøge patogenet bidrag til sekundær bakteriel lungebetændelse.
Sekundær bakteriel lungebetændelse efter influenza infektion er en førende dødsårsag i USA og et aktivt område af forskning1,2. Trods talrige undersøgelser ved hjælp af murine modeller af sekundær bakteriel lungebetændelse, uoverensstemmelser vedrørende patogen instillation og forhør forbliver3,4,5. Desuden, mens mange tidligere bestræbelser har fokuseret på immunmodulerende virkninger af influenza, der fører til en øget modtagelighed for sekundær bakteriel infektion, nyere data tyder på virulens regulering af bakterielle patogen er en lige bidragyder til etablering af sygdom6,7,8,9. Disse nye data nødvendiggør en mere præcis metode til at udforske sekundær bakteriel lungebetændelse i murine modeller af co-infektion, der letter undersøgelsen af patogenet respons.
Værtsorganismer, der er unikke for influenza-Co-infektions modeller, er bevidst immunkompromitterede af en primær influenza infektion før administration af det sekundære bakterielle middel. For bedst at replikere sygdoms patogenesen observeret i menneskelige værter, er det bydende nødvendigt, at patogenets belastning af både primære og sekundære agenser kontrolleres for at observere de individuelle og kombinatoriske virkninger af hver infektiøs agens. Mest almindeligt, luftvejsinfektioner i mus er blevet etableret gennem en intranasal administration3,4,5,6,10. For så vidt som denne rute er kendt for at være teknisk enkel og kan være hensigtsmæssig i nogle enkelt-agent infektion applikationer, det er uegnet til co-infektion modeller, som instillation procedurer, dosismængder, og effekten er meget Varier inden for publiceret litteratur3,4,5,6.
For at få en mere komplet forståelse af sekundær bakteriel lungebetændelse patogenese, bidrag af både værten og patogenet skal overvejes. Til det formål har vi udviklet en enkel og reproducerbar tilgang til genopretning af levedygtige bakterier og patogen RNA fra inficerede lunger. Denne metode bruger en forenklet, ikke-invasiv intratrakeal instillation procedure efterfulgt af efterfølgende isolering af bakteriel RNA. Den intratrakeal instillation procedure beskrevet heri svarer til tidligere beskrevne metoder og er ikke begrænset til patogen levering11,12,13. Brug af denne særlige procedure fordele ved at være lavpris og kræver ikke brug af specialiseret udstyr såsom kanyle, guide ledninger, eller fiberoptiske kabel; Desuden, fordi denne procedure er ikke-invasiv det forsikrer minimal stress på murine emner, minimerer en inflammatorisk respons fra inokulering mekanik, og giver en effektiv levering rute for infektion af flere. Kort, isofluran bedøvet mus er suspenderet fra fortænderne. Pincet bruges til forsigtigt at gribe tungen efterfulgt af indsættelse af en pre-loaded bøjet, stump-tippet, 21-gauge nål i luftrør og levering af patogenet belastning. Validering af denne procedure påvises ved visuel bekræftelse af farvestof ligeligt fordelt i lunge rummet og nyttiggørelse af bakteriel belastning. Vi viser derefter, hvordan man kan genvinde levedygtige Staphylococcus aureus (S. aureus) fra inficerede lunger og beskrive en reproducerbar metode til at ISOLERE høj kvalitet patogen RNA.
Brug af denne model giver en yderst effektiv og reproducerbar metode til at studere sekundære bakterielle infektioner. Evnen til stramt at kontrollere leveringen af patogenet inokulum giver mere præcise observationer af de enkelte og kombinatoriske virkninger af hvert patogen. Ineffektivitet i den mere almindelige intranasale instillation rute har sandsynligvis bidraget til forskellene i dosismængder og koncentrationer til stede i litteraturen. Det er rimeligt, at manglen på en præcis murine system til at studere sekundær bakteriel lungebetændelse har forsinket fund identificere bakterielle specifikke reaktioner, der bidrager til sværhedsgraden af pulmonale co-infektioner. Udvikling af en reproducerbar model til at studere virulens udtryk under sekundære bakterielle infektioner kan føre til identifikation af vaccine eller Drug mål at forbedre disse infektioner.
Intratrakeal instillation trin er afgørende for med held at etablere en nedre luftvejsinfektion og enhver down-stream analyse af patogener. Når du lærer denne teknik, kan det være nyttigt at øve ved hjælp af et farvestof (som beskrevet i metoderne) før administration af infektiøs materiale. Ved hjælp af et farvestof giver mulighed for direkte visualisering af inokulum i luftvejene. En almindelig fejl, der kan opstå, er indsættelse af stump-nålen i spiserøret i stedet for luftrør. Dette vil resultere i leveringen af inokulum i maven i stedet for lungerne. For at korrigere denne fejl, skal du vinkle nålen længere væk fra kroppen og passere den ned i luftrøret. Når mestrer, denne procedure er meget effektiv og kan bruges til at udføre eksperimenter med et stort antal mus. Ved at arbejde i partier til bedøvelse af mus kan intratrakeal instillation afsluttes i ca. 30 sekunder pr. mus. Desuden kan excision af lungerne afsluttes i 2 til 3 minutter pr. mus.
Genvinding af levedygtige og ren bakteriel RNA fra inficerede væv er afgørende for transkriptionen analyse. RNases er allestedsnærværende og kan hurtigt ødelægge et eksperiment15. Nogle metoder omfatter anvendelse af Rnasehæmmere; Vi har imidlertid konstateret, at frysning af prøven ved-80 °C i RLT-ß-mercaptoethanol eller straks ved behandling af prøven til RNA-isolation ved hjælp af alle Rnasefri rør og reagenser er effektive til at reducere Rnasekontaminering. Derudover anbefaler vi, at højst seks prøver renses på én gang. Herunder mere end seks prøver kan resultere i langvarige ventetid mellem protokol trin, der kan kulere i RNA nedbrydning. Når renset, bør man også være forsigtig for at undgå unødvendige fryse-tø cyklusser. Således, hvis flere analyser vil blive udført på en prøve, at citere renset RNA til opbevaring ved-80 °C anbefales.
Ud over de teknikker, der gennemgås heri, kan denne metode suppleres ved at udføre bronkial alveolær skylning forud for excision og homogenation af lungerne16. Dette kan opnås ved skylning af hele nedre luftveje eller ved hjælp af sutur tråd til at begrænse en forgrenings arm af bronkial træet efterfulgt af skylning gennem den resterende gren. Dette fører ofte til en reduktion i genindvinding af patogenet, men giver en prøve, hvor oplysninger såsom lactat dehydrogenase-aktivitet, cellulær populations identitet og cytokinprofiler kan fås16. Tilsammen kan disse data danne en mere fuldstændig forståelse af det vært-patogen interaktioner, der opstår under sekundær bakteriel lungebetændelse.
Mens de diskuterede metoder har været inden for rammerne af sekundær bakteriel lungebetændelse, de er egnede til at blive udvidet til enhver murine model af nedre luftvejsinfektion; specifikt, dem, der ville drage fordel af stramt kontrolleret levering og nyttiggørelse af den installerede inoculum. Desuden, ligesom mange andre infektion ruter, intratrakeal instillation kan udnyttes i ikke-infektiøse applikationer, såsom administration af terapeutiske og miljømæssige forbindelser12.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Nicole Meissner, M.D./ph.d., Montana State University, for hendes hjælp til at etablere intratrakeal instillation metode. Dette arbejde blev støttet af U.S. National Institutes of Health (tilskud NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), samt midler fra Montana University system Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) og Montana State University Landbrug eksperiment Station.
Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911100 | Referred to in text as "0.1 mm silica beads" |
21-gauge blunt needle | SAI | B21-150 | 1.5" is recommended. |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | DNase used in the accompanying text. |
FastPrep-24 Classic Instrument | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater" |
TaqMan AIV-Matrix Reagents | Applied Biosystems | 4405543 | Influenza A M-segment qRT-PCR kit. |
Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MES-01 | Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house. |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA purification kit. |
Tissue Grinders | Thermo Fisher Scientific | 02-542-08 | |
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) | Calbiochem | UN2966 |