Her presenterer vi en protokoll, designet for å bruke chemogenetic verktøy for å manipulere aktiviteten til kortikale interneuron forfedre transplantert inn i cortex av tidlige postnatal mus.
Neuronal utvikling er regulert av en kompleks kombinasjon av miljømessige og genetiske faktorer. Vurdering av relative bidrag av hver komponent er en komplisert oppgave, som er spesielt vanskelig i forhold til utviklingen av γ-aminobutyric acid (GABA) ergic kortikale interneurons (CIs). CIs er de viktigste hemmende neurons i hjernebarken, og de spiller nøkkelroller i neuronal nettverk, ved å regulere både aktiviteten til individuelle pyramideformet neurons, samt oscillasjon atferden til neuronal ensembler. De er generert i forbigående embryonale strukturer (midtre og caudal ganglionic forrang-MGE og CGE) som er svært vanskelig å effektivt målrette bruke i Utero electroporation tilnærminger. Interneuron forfedre migrere lange avstander under normale embryoutvikling, før de integreres i kortikale kretsen. Denne bemerkelsesverdige evnen til å spre seg og integreres i et utviklende nettverk kan bli kapret av transplantere embryonale interneuron forløpere til tidlig post-Natal vert barken. Her presenterer vi en protokoll som tillater genetisk modifisering av embryonale interneuron forfedre ved hjelp av fokal ex vivo electroporation. Disse konstruerte interneuron forløpere blir deretter transplantert inn i tidlig post-Natal vert barken, hvor de vil modnes i lett identifiserbare CIs. Denne protokollen tillater bruk av flere genetisk kodede verktøy, eller evnen til å regulere uttrykk for spesifikke gener i interneuron forfedre, for å undersøke virkningen av enten genetiske eller miljømessige variabler på modning og integrering av CIs.
Funksjonen til neuronal nettverk er avhengig av eksistensen av en balansert komplement av eksitatoriske projeksjon neurons og hemmende interneurons. Selv om kortikale interneurons (CIs) bare representerer 20% av alle neurons i pattedyr barken, er underskudd i antall eller funksjon antatt å spille en sentral rolle i patogenesen av neurodevelopmental lidelser1,2. Studiet av CI utvikling er utfordrende fordi CIs er generert i forbigående embryonale strukturer som er vanskelig å få tilgang til, og de følger en lang tangential migrasjon før de når pallium og utvikle sine modne anatomiske og fysiologiske egenskaper3. Både genetiske og miljømessige mekanismer er kjent som regulerer CI utvikling4, men det har vist seg vanskelig å studere den relative bidrag av flere faktorer.
Mange innsikter i CI utvikling ble innhentet ved hjelp in vitro kultur systemer etter isolering av forfedre fraganglionic forrang. En av de store fordelene med disse metodene er potensialet for å merke og genetisk modifisere de isolerte forfedre og følge deres differensiering i detalj, for å oppdage celle-autonome endringer. Disse metodene kan imidlertid ikke tilby informasjon om samspillet mellom utvikling av interneurons og et aktivt nettverk. Vi har tilpasset disse protokollene, ved transplantasjon av de modifiserte forløpere til tidlig post-Natal cortex. Interneuron forfedre isolert fra embryonale ganglionic forrang er i stand til å overleve, spre og integreres i verts nettverket ved transplantasjon i cortex7,8. Denne metoden har blitt brukt til å redusere alvorlighetsgraden av epileptiske anfall i genetiske Mouse modeller, og har blitt foreslått som en mulig ny terapi for ulike neurodevelopmental lidelser9,10. En tidligere protokoll beskriver en prosedyre for å overfører disse forløpere med viral vektorer før Sygehus11. Protokollen vi beskriver her også tillater genetisk modifisering av interneurons, men krever ikke etableringen av en viral vektor, som krever bare plasmider DNA, som i stor grad øker sin fleksibilitet. Noen studier rapporterte suksess i å bruke i Utero electroporation å genetisk modifisere interneuron forfedre i caudal ganglionic forrang (CGE)12, men denne metoden har vist seg svært vanskelig å reprodusere.
I representative resultater delen illustrerer vi bruken av denne metoden til å uttrykke designer reseptorer utelukkende aktiveres av designer narkotika (DREADDs13) i den transplanterte CIs, en metode vi brukte i en nylig publikasjon14. Vi uttrykte hM3D (GQ), en konstruert reseptor basert på den menneskelige kolinerge reseptoren CHRM3, som ikke påvirker neuronal funksjon med mindre den binder sin spesifikke ligand Clozapine-N-oksid (CNO). CNO administrasjon selektivt utløser aktivering av hM3D (GQ) uttrykker celler. Vi brukte denne metoden for å vise at celle autonome og forbigående depolarization er tilstrekkelig for å hindre apoptose av CIs under utvikling14. Kombinert med ulike genetisk kodede verktøy, denne protokollen har potensial til opp-eller ned-regulere genuttrykk, og visualisere eller manipulere celle aktivitet under ulike stadier av interneuron differensiering.
Her beskriver vi en allment tilgjengelig metodikk for å genetisk modifisere aktiviteten til CI-forløpere for å studere virkningen av egen aktivitet på CI-modning, og/eller effekten av aktivitets modulert CIs på montering/funksjon av den integrerte kortikale Kretser.
I det siste, flere laboratorier, inkludert vår, hadde utført i Utero electroporation eksperimenter for å genetisk endre projeksjon neurons6. Imidlertid, inne Utero electroporation i ganglionic forrang det inkludere CI forfedre er meget vanskelig, på grunn av elektrisk ledning sti problemer. For å løse dette problemet, er et lite antall laboratorier utfører ultralyd guidet injeksjoner etterfulgt av electroporation, som er en krevende teknikk som krever dyrt utstyr. Denne protokollen gir et alternativ til disse metodene som er tilgjengelig for flertallet av det vitenskapelige samfunnet.
En av de mest utfordrende aspektet av denne protokollen er å maksimere antall celler som overlever i verten cortex til modne stadier, når fenotypiske analyse er vanligvis utføres (svært avhengig av eksperimentet design, men vanligvis eldre enn P17). Det er tre viktige trinn som etterforsker bør ta hensyn: (1) effektiviteten av electroporation. Dette kan maksimeres ved å sikre renheten av DNA-plasmider. Bare DNA-plasmider av høy kvalitet (en A260/a280 ratio på 1,9-2.0) bør brukes for denne prosedyren. Vi får slike DNA-preparater av høy kvalitet ved å bruke cesium klorid DNA-rensing. En annen viktig faktor er arrangøren som driver uttrykk for det genet av interesse. Vi fant at pCAGGs vektor, som består av kylling b-utgangen promoter, er ekstremt kraftig og kan dramatisk øke electroporation effektivitet. (2) antall starter donor embryo. Det er viktig å sørge for at et stort antall (12-16) av embryo på samme scene er electroporated. Dette tallet kan økes, hvis flere forskere utfører embryo dissections og snitting sammen, da det er viktig at embryonale kortikale skiver er innhentet, electroporated og overført til inkubator så snart som mulig. (3) det er viktig å sørge for at et stort antall celler injiseres i hver valp for å sikre en høy sjanse for transplantert celle overlevelse til modne etapper. I tillegg vil dette dramatisk øke sannsynligheten for vellykkede transplantasjon siden lav tetthet celle preparater vil resultere i ujevn blanding av cellene med mediet, noe som vil gi betydelig variasjon i den transplanterte hjernen15 .
Protokollen beskrevet her var skreddersydd for å undersøke rollen til aktivitet i å regulere CI overlevelse i en celle-autonom måte. P14-P17 tid vindu for å utføre CNO injeksjoner ble spesielt valgt i henhold til publiserte data, som viser at toppen av transplantert CI forfedre ‘ celle død oppstår i denne perioden16. Derfor denne tidsrammen eller hyppigheten av CNO injeksjoner kan ikke holde sant for andre celletyper eller hjernen regioner, og etterforsker bør justere disse parametrene i henhold til spesifikke eksperimentelle formål. Til slutt, metodikken beskrevet her over for intrakraniell injeksjoner av CIs er bare gjennomførbart for p0-P5 pups (avhenger likeledes på musen line miljøet). I prinsippet vil eventuelle injeksjoner over P5 kreve tynning eller fjerning av skallen15.
En av de viktigste fordelene med denne protokollen er muligheten til å bruke nye genetisk kodede verktøy for å visualisere eller manipulere aktiviteten til CIs under ulike stadier av differensiering som de integreres i et utviklingsland nettverk. Med tempoet av oppdagelsen av ny genetisk kodet Voltage og kalsium sensor, likeledes idet ny chemogenetic og optogenetic verktøy, denne protokollen innrømmer forskning å bruk seg innen ukens av løslate i plasmider repositories, som Addgene.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en ERC starter Grant (282047), en Wellcome Trust etterforsker Award (095589/Z/11/Z), en FP7 EC DESIRE Grant, og en lister Institute prisen til JB. Arbeidet i V.P. laboratorium er støttet av BBSRC (BB/L022974/1), The UK Medical Research Council (MRC), og Francis Crick Institute (som mottar midler fra MRC, Cancer Research UK, og Wellcome Trust). Forskningen i MD Lab ble gjort mulig gjennom stipend fra Stavros Niarchos Foundation til B.S.R.C. “Alexander Fleming”, som en del av stiftelsen initiativ for å støtte den greske forskningen.
Medium/Supplements | |||
B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
Equipment | |||
Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Other Material | |||
Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |