Summary
Qui presentiamo un protocollo, progettato per utilizzare strumenti chemiogenetici per manipolare l'attività dei progenitori interneuroni corticali trapiantati nella corteccia dei primi topi postnatali.
Abstract
Lo sviluppo neuronale è regolato da una complessa combinazione di fattori ambientali e genetici. Valutare il contributo relativo di ogni componente è un compito complicato, che è particolarmente difficile per quanto riguarda lo sviluppo di interneuroni corticali (CI) di acido-aminobutico s.munitico (GABA). I CI sono i principali neuroni inibitori nella corteccia cerebrale, e svolgono ruoli chiave nelle reti neuronali, regolando sia l'attività dei singoli neuroni piramidali, sia il comportamento oscillatorio degli insiemi neuronali. Sono generati in strutture embrionali transitorie (eminenze ganglioniche mediali e caudali - MGE e CGE) che sono molto difficili da indirizzare in modo efficiente utilizzando approcci di elettroporazione in utero. I progenitori interneurone migrano per lunghe distanze durante il normale sviluppo embrionale, prima che si integrino nel circuito corticale. Questa notevole capacità di disperdere e integrare in una rete in via di sviluppo può essere dirottata trapiantando precursori di interneuroni embrionali nelle cortici host post-natali. Qui, presentiamo un protocollo che permette la modificazione genetica dei progenitori interneuronici embrionali utilizzando l'elettroporazione post-e-vivo. Questi precursori di interneuroni ingegnerizzati vengono poi trapiantati nelle prime cortice ospiti post-natali, dove matureranno in CI facilmente identificabili. Questo protocollo consente l'uso di molteplici strumenti geneticamente codificati, o la capacità di regolare l'espressione di geni specifici nei progenitori interneuroni, al fine di studiare l'impatto di variabili genetiche o ambientali sulla maturazione e l'integrazione di CI.
Introduction
La funzione delle reti neuronali si basa sull'esistenza di un complemento equilibrato di neuroni di proiezione eccitatori e interneuroni inibitori. Sebbene gli interneuroni corticali (CI) rappresentino solo il 20% di tutti i neuroni nelle cortici dei mammiferi, si pensa che i deficit nel loro numero o funzione svolgano un ruolo chiave nella patogenesi dei disturbi del neurosviluppo1,2. Lo studio dello sviluppo delle CI è impegnativo perché le CI sono generate in strutture embrionali transitorie difficili da accedere, e seguono una lunga migrazione tangenziale prima di raggiungere il pallio e sviluppare il loro maturo anatomico e fisiologico proprietà3. Sono noti sia i meccanismi genetici che quelli ambientali che regolano lo sviluppo CI4,ma si è dimostrato difficile studiare il contributo relativo di molteplici fattori.
Molte intuizioni nello sviluppo di CI sono state ottenute utilizzando sistemi di coltura in vitro dopo l'isolamento dei progenitori dalle eminenze ganglioche5,6. Uno dei grandi vantaggi di questi metodi è il potenziale per etichettare e modificare geneticamente i progenitori isolati e seguire la loro differenziazione in dettaglio, per rilevare i cambiamenti delle cellule-autonome. Tuttavia, questi metodi non sono in grado di offrire informazioni sulle interazioni tra lo sviluppo di interneuroni e una rete attiva. Abbiamo adattato questi protocolli, trapiantando i precursori modificati nella corteccia post-natale. I progenitori interneuroni isolati dalle eminenze ganglioniche embrionali sono in grado di sopravvivere, disperdersi e integrarsi nella rete ospite dopo il trapianto nella corteccia7,8. Questo metodo è stato utilizzato per ridurre la gravità delle crisi epilettiche nei modelli murini genetici ed è stato proposto come possibile nuova terapia per diversi disturbi del neurosviluppo9,10. Un protocollo precedente descrive una procedura per trasdurre questi precursori con vettori virali prima dei trapianti11. Il protocollo che qui descriviamo permette anche la modificazione genetica degli interneuroni, ma non richiede la creazione di un vettore virale, che richiede solo DNA plasmide, che aumenta notevolmente la sua flessibilità. Alcuni studi hanno riportato il successo nell'utilizzo dell'elettroporazione in utero per modificare geneticamente i progenitori interneuroni nelle eminenze ganglioniche caudali (CGE)12, ma questo metodo si è dimostrato molto difficile da riprodurre.
Nella sezione dei risultati rappresentativi, illustriamo l'uso di questo metodo per esprimere i recettori dei progettisti attivati esclusivamente da farmaci di design (DREADDs13)nei C trapiantati, un metodo che abbiamo usato in una recente pubblicazione14. Abbiamo espresso hM3D (Gq), un recettore ingegnerizzato basato sul recettore colinergico umano CHRM3, che non influisce sulla funzione neuronale a meno che non lega il suo specifico ligando-N-ossido (CNO). La somministrazione CNO attiva selettivamente l'attivazione delle celle che esprimono hM3D(Gq). Abbiamo usato questo metodo per dimostrare che la depolarizzazione cellulare autonoma e transitoria è sufficiente per prevenire l'apoptosi di CI durante lo sviluppo14. In combinazione con diversi strumenti codificati geneticamente, questo protocollo ha il potenziale per up- o down-regolare l'espressione genica, e visualizzare o manipolare l'attività cellulare durante diverse fasi di differenziazione degli interneuroni.
Protocol
Gli animali sono stati allevati e alloggiati in conformità con il United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986).
NOT: Per la generazione del costrutto pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, un frammento SalI-StuI, contenente la sequenza hM3D(Gq), è stato isolato dal plasmide 50463 (Addgene) e inserito nel vettore di espressione pCAGGs-RFP (regalo da F. Guillemot) condigere con digerito con digestione con glasmida 50463 (Addgene) e inserito nel vettore di espressione pCAGGs-RFP (regalo da F. Guillemot) digerito con digestione con XhoI-EcoRV.
1. Preparazione di fette corticali embrionali embrionali di topo
- Sterilizzare le apparecchiature di laboratorio (ad esempio, microscopi stereo) e le superfici (ad esempio, le panchine) con un solvente detergente appropriato e una soluzione di etanolo (EtOH) del 70% in acqua (H2O).
- Utilizzare strumenti di dissezione che sono stati autoclaved e tenerli per tutto il tempo in 100% EtOH.
- Preparare tre 20 mL di agaa a bassa temperatura del 4% in una soluzione cuscinetto da 1x fosfato (PBS), in tubi da 50 mL, e tenerli a 55 gradi centigradi.
- Sacrificare i topi in stato di gravidanza per lussazione cervicale a 13,5 o 14,5 giorni di gestazione (giorno embrionale E13.5-E14.5).
- Con un paio di forbici dissezione, aprire l'addome dei topi in gravidanza, rimuovere le corna uterine (con gli embrioni) e metterle in soluzione Krebs ghiacciata (Tabella 1), in un piatto Petri da 90 mm.
- Con un paio di pinze sottili per studenti dritti, aprire le sacche amniotiche, rimuovere gli embrioni e trasferirli in una soluzione Krebs fresca ghiacciata, in una nuova parabola Petri da 90 mm. Dissezionare il cervello dell'embrione di topo (prosencefalo, midbrain, cervello posteriore) dal resto del corpo dell'embrione.
- Tenendo i cervelli sezionati dal cervello posteriore, trasferirli in soluzione Krebs ghiacciata in una nuova parabola Petri da 90 mm e tenerli sul ghiaccio.
- Con una penna impermeabile, disegnare una linea retta sulla superficie esterna, nel mezzo della parte inferiore di sei piatti Petri da 35 mm.
- Mettere un 4% agarose a bassa gelatura/PBS 20 mL a 37 gradi per 5 min.
NOT: I bulbi olfattivi devono essere rivolti verso il basso (fondo del piatto Petri). Incorporare 3-4 cervelli per piatto Petri, allinearli nella linea retta precedentemente disegnata. Lasciare uno spazio di 3 x 5 mm tra ogni due cervelli. - Ripetere i passaggi 1.8 e 1.9 fino a quando tutti i cervelli sezionati sono stati incorporati.
- Posizionare i cervelli incorporati a 4 gradi centigradi, in modo che l'agarosa si solidifichi, e successivamente intagliare i tre cervelli in un unico blocco di dimensioni e orientamento appropriati.
NOT: Lasciare circa 3 mm intorno ai bordi dei campioni cerebrali. Cambiare l'orientamento del cervello, con i bulbi olfattivi sulla parte superiore. - Incollare il blocco sulla superficie di una base di microtomi e utilizzando una lama chirurgica tagliata fino al fondo del blocco, tra ogni due cervelli, al fine di creare 3 blocchi indipendenti (ogni mini blocco contenente un cervello).
- Sezionare i blocchi, in soluzione Krebs ghiacciata, in fette spesse 250 m, utilizzando un microtoma a lama vibrante.
- Con una micro-spatola piatta piegata raccogli solo le fette contenenti le eminenze ganglioiane mediali o caudali (MGE o CGE; Figura 1) e trasferirli individualmente sulle membrane filtranti (13 m di diametro, 8,0 m di dimensione dei pori), galleggiando su un mezzo essenziale minimo (MEM, Tabella1) in piatti di coltura organo di qualità in polistirolo (60 mm x 15 mm).
- Mettere i piatti in un'incubatrice a coltura di tessutoco2, a 37 gradi centigradi, per 1 h, e prepararsi per l'elettroporazione focale.
2. Elettroporazione acuta del cervello
- Prima di iniziare la procedura di elettroporazione, preparare 50 mL di 1% gel di agarose in una piastra Petri 100 mm. Lasciare che il gel di agarose si solidifici a temperatura ambiente (RT) per circa 30 min.
- Preparare piccole colonne di agarose (1 mm di diametro e 10 mm di lunghezza), perforate con una pipetta di vetro (lunghezza 225 mm; 2 mL di capacità) e trasferirle in soluzioni Krebs ghiacciate.
NOT: Una lampadina contagocce di gomma adatta a 2 mL pipette è attaccata alla pipetta, e premendola la colonna può essere rilasciata dalla pipetta di vetro alla soluzione Krebs. - Con una lama chirurgica, tagliare piccoli blocchi di agarose di due dimensioni: uno piccolo che si adatta sulla superficie dell'elettrodo (vedi sotto) e uno più grande, che verrà utilizzato come base per eseguire le iniezioni di DNA focale nelle fette cerebrali. Trasferire i blocchi di agarose in soluzione Krebs ghiacciata.
- Preparare l'impostazione per le iniezioni focali e l'elettroporazione acuta (Figura 2).
NOT: Per le iniezioni, è necessaria la seguente attrezzatura: 1) una dissezione del campo luminoso stereo-microscopio, 2) un iniettore pico-pompa pneumatico, 3) un micromanipolatore, 4) un supporto magnetico, e 5) una piastra di base in acciaio. Per l'elettroporazione acuta a fette, è necessaria la seguente attrezzatura: 1) un elettrodo piatto piatto Petri platino quadrato da 10 mm, 2) un elettrodo di copertura 10 mm platino quadrato, 3) un micromanipolatore e 4) un elettroporatore. -
Iniezioni di DNA focali
- Preparare una miscela di DNA di vettori di espressione: pCAGGs-IRES-GFP (vettore di controllo) - pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, con una concentrazione di 1 g/l per ogni vettore e aggiungere una soluzione verde veloce (stock 25 mg/mL) in una diluizione di 1/10.
- Riempire una micropipetta di vetro tirato (0,5 mm di diametro interno e 1 mm di diametro esterno) con 10 L della miscela di DNA e iniettare piccole quantità (sulla gamma 25-50 nL) nella regione selezionata (MGE/CGE) della fetta (Figura 1 e Figura 2).
-
Elettroporazione acuta
NOT: L'elettroporazione deve essere eseguita immediatamente dopo l'iniezione focale del DNA.- Posizionare il piccolo blocco di agarose sull'elettrodo della piastra Petri e attaccare la colonna di agarose all'elettrodo di copertura mobile con l'aiuto di una micro-spatola piatta.
- Trasferire la fetta con la sua membrana di supporto sul blocco di agarose e posizionare l'elettrodo superiore con la colonna di agarose sulla parte superiore della regione selezionata (MGE/CGE) della fetta.
NOTA: le tensioni di ricarica di 125 V (due impulsi di 5 ms ciascuno, l'intervallo 500 ms) produrranno un'elettroporazione riuscita (Figura 3).
- Dopo l'elettroporazione, mettere la fetta con la sua membrana di sostegno nel piatto e trasferire il piatto in un'incubatrice di coltura di tessuto CO 2, a 37 gradi centigradi.
- Dopo 1 h, scambiare il mezzo MEM per un mezzo di base appropriato per le colture neuronali primarie (mezzo di base del neurone; Tabella 1) e incubare le fette durante la notte, per circa 18-24 h.
3. Preparazione di innesti cellulari
- Controllare l'efficienza dell'elettroporazione in tutte le sezioni. Selezionare solo le sezioni in cui viene osservato un numero accettabile di celle fluorescenti (Figura 3).
NOT: Elettroporate circa 30 fette / per esperimento al fine di acquisire il numero appropriato di cellule per l'innesto (vedi sotto). - Dissezionare la regione selezionata (MGE/CGE) da ogni fetta e tagliare il tessuto in piccoli pezzi in soluzione Krebs ghiacciata, sotto una dissezione fluorescente stereo-microscopio.
- Nel frattempo, mettere un tubo da 1,5 mL con un mezzo di base di 900 - neurone in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
- Trasferire i pezzi di tessuto con un micropipettore P1000 su un tubo da 1,5 mL contenente 500 L di l15/DNase medio preparato aggiungendo 100 L di 1 mg/mL DNase stock in DMEM/F12 medio in 900 - L di L15 medio. Lavare i pezzi di tessuto toccando.
- Aggiungere 100 L di DNase (stock 1 mg/mL nel mezzo DMEM/F12) nel mezzo di base del neurone 900.L.
- Scartare il mezzo L15/DNase e risospendere i pezzi di tessuto in 200 - lneurone di base/Media DNase preparato nel passaggio 3.5.
- Impostare un micropipettor P200 a 180 - L e dissociare meccanicamente i pezzi di tessuto pipetting su e giù delicatamente, 20-30 volte, fino a ottenere una sospensione liscia e "cremosa".
- Aggiungere 200 l di neurone basic/DNase medium (volume totale finale 400 ) e risospendere.
- Prendere un'aliquota di 4 celle, diluire in modo appropriato e montare su un emocitometro.
- Sotto un microscopio a campo luminoso, controllare l'efficienza della dissociazione e contare il numero di cellule.
NOT: Se la dissociazione ha successo, verranno osservate singole cellule luminose (vive) e non aggregazioni cellulari. - Sospensione cellulare centrifuga dal passo 3.8, a 1.000 rpm, a RT, per 5 min, e successivamente, rimuovere il supernatante dal tubo e aggiungere il mezzo L15/DNase appropriato (di solito 5-7 L) in modo che la concentrazione finale delle cellule sarà 8 x 105-1,2 x 106 cellule/L.
NOT: Durante la sospensione, è estremamente importante evitare le bolle d'aria. - Posizionare l'aliquota della cella sul ghiaccio e avere un ulteriore supporto L15/DNase per le iniezioni.
4. Iniezioni intracraniche
NOT: Le seguenti procedure si svolgono in una sala procedure all'interno dello Animal House Facility. Poiché le cellule saranno iniettate direttamente al cervello dei cuccioli appena nati senza esporre il cervello, le condizioni asettiche vengono mantenute sterilizzando lo spazio di lavoro con la soluzione 70% EtOH e utilizzando aghi di vetro autoclati. Per le iniezioni intracraniche sono necessarie le seguenti apparecchiature: 1) uno stereoscopio di dissezione del campo luminoso, 2) un microiniettore e 3) un pad di riscaldamento per il recupero del mouse.
- Preparare un ago di vetro tirando gli aghi secondo le raccomandazioni del produttore. In questo protocollo vengono utilizzati aghi di vetro con un diametro esterno di 80 m, un diametro interno di 40 m e una smussatura di 30 metri.
NOT: Come accennato in precedenza, gli aghi devono essere autoclavi prima dell'uso. - Riempire manualmente l'ago con olio biologicamente inerte utilizzando un ago da 30 G, 2 pollici e una siringa.
- Assemblare e inserire l'ago nell'iniettore secondo le istruzioni del produttore.
- Determinare le impostazioni di iniezione al volume massimo (69 nL) e una velocità lenta relativa (23 nL/s).
- Svuotare l'ago fino a quando lo stantuffo è completamente esteso.
-
Riempire l'ago.
- Tagliare un piccolo pezzo da un nastro di innesto e posizionarlo sotto un campo luminoso dissezione stereo-microscopio. Con una micropipetta P10, trasferire 5 OL dal campione (aliquota cellulare) sul nastro, in modo da formare una goccia sferica.
- Posizionare la punta dell'ago nel campione e riempire l'ago (lo stantuffo si ritrae e disegna il campione con esso).
NOT: Poiché il campione dovrebbe essere abbastanza viscoso, riempire l'ago a piccoli passi in modo che il campione venga equilibrato e a una velocità lenta che impedisce la formazione di bolle. Il campione deve essere liscio e omogeneo all'interno dell'ago. Se il campione è troppo viscoso e non è possibile riempire l'ago, aggiungere tanto supporto L15/DNase quanto è necessario per ottenere la viscosità corretta. Tuttavia, questo cambierà la concentrazione del campione, e idealmente dovrebbe essere evitato.
- Anasthetize nuovi cuccioli (giorno postnatale 0-2 [P0-P2]) sul ghiaccio per 2-5 min.
NOT: Assicurarsi che il cucciolo non si muova. - Posizionare il cucciolo aestizzato sotto il campo luminoso dissezione stereo-microscopio.
- Eseguire 3-4 iniezioni di 69 nL ciascuna in ogni emisfero.
NOT: I siti di iniezione si trovano circa 1 mm laterale alla linea mediana, e tra 1 mm caudal a bregma e 1 mm rostral alla linea interaurale. La punta dell'ago deve essere posizionata a circa 1 mm di profondità sulla superficie del pial. Dopo ogni iniezione, l'ago viene lasciato in posizione per circa 30 s e ritirato in periodi. - Subito dopo le iniezioni, posizionare il cucciolo su una piastra di riscaldamento con il riscaldamento al suo minimo impostazione (37 gradi centigradi). Quando il cucciolo recupera trasferirlo alla gabbia con la madre.
NOT: Non lasciare mai la madre senza cuccioli nella gabbia. L'intera procedura (dalla rimozione del cucciolo dai suoi compagni di cuccioli, fino al suo ritorno) dovrebbe durare meno di 10 min.
5. Iniezioni di clozapina-n-ossido
- Preparare la soluzione di ligando DREADD, CNO diluindo 1 mg di CNO in 50 - L di solforosa dimetilo (DMSO) fino a quando la soluzione è traslucida. Top-up a 10 mL con salina in modo che la concentrazione finale di CNO è 0.1 mg/mL.
NOT: Il DMSO è tossico. Evitare di utilizzarlo per una concentrazione superiore allo 0,1%. Utilizzare come controllo una soluzione salina contenente la stessa concentrazione DMSO della soluzione contenitore CNO. - Dal giorno postnatale 14 e per 3 giorni di stitiro (P14-P16), in ogni topo eseguire due iniezioni intraperitoneali (I.P.) di CNO (concentrazione CNO: 1 mg/kg) o 0,05% DMSO in salina, al giorno, a distanza di 12 h.
- L'ultimo giorno (P17), eseguire una singola iniezione e sacrificare i topi per lussazione cervicale in un intervallo di tempo di 30 min-1 h.
Representative Results
Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo testato se la sopravvivenza degli interneuroni corticali durante le prime fasi postnatali è regolata dall'attività in modo autonomo alle cellule. Abbiamo eseguito 3 esperimenti di elettroporazione delle fette cerebrali (12-16 embrioni [E14,5 embrioni] per esperimento) con i vettori pCAGGs-IRES-GFP (controllo) e pCAG-hM3D(Gq)-IRES-RFP, con una concentrazione di 1 g/l per ogni costrutto. Nei nostri esperimenti di elettroporazione, solo una frazione (circa il 50%; Figura 3) dellaGFP - neuroni co-espressi hM3D(Gq) (RFP) e quindi la popolazione GFP-ha servito come controllo interno per l'effetto dei ligandi DREADD. Gli interneuroni embrionali corticali transfettati sono stati dissociati meccanicamente e la sospensione cellulare risultante (8 x 105 cellule/L) innestata nella corteccia dei topi di tipo selvatico P0-P1. Avevamo eseguito 6 iniezioni per cervello. In ogni esperimento, sono stati iniettati almeno 6 cuccioli appena nati. La somministrazione di CNO ha aumentato selettivamente l'attività dellecellule RFP trascate, come dimostrato dall'espressione della proteina dipendente dall'attività cFos (Figura 4). Il trattamento cNO secondo il protocollo descritto (somministrazione due volte al giorno P14-P17) ha portato ad un aumento della proporzione di GFP(RFP) rispetto alle cellule GFPeRFP, rispetto al veicolo (0,5% DMSO in salina) compagni di cucciolata somministrati (Figura 5).
Figura 1: fette teleencefaliche rappresentative utilizzate per esperimenti di elettroporazione acuta. (A-C) Fette telencefaliche ottenute a tre distinti livelli sequenziali rostro-caudali, macchiate con 4,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI). LGE: eminenza ganglionica laterale; MGE: eminenza ganglionica mediale; CGE: eminenza ganglionica caudale. Barre della scala: 200 m. Gli asterischi gialli indicano il sito di elettroporazione in ogni sezione. La linea bianca segna il bordo dell'eminenza ganglionica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale. (A) Le fette di cervello del topo sono elettroporate con costrutti appropriati e (B) dopo i precursori dell'interneurone corticale (CI) modificato da 12 h sono isolati e (C) trapiantati nel pallio dei cuccioli di topo neonato (P0-P2). Al fine di modificare l'attività dei CSI immaturi, i cuccioli P14 che avevano ricevuto trapianti cellulari sono stati iniettati con CNO o veicolo per quattro giorni di attività costituisci secondo il protocollo presentato. (A') Fotografia dell'impostazione dell'elettroporazione della fetta di topo acuta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esperimento di elettroporazione acuta acuta rappresentativo di successo. (A) Sezione coronale rappresentativa di un cervello embrionale E14.5 trascurato nel CGE con pCAGG-IRES-GFP (GFP) che pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) e coltivati a 12 h. La sezione è stata immunostaina per GFP (A, B, C) e RFP (A, B, D). L'area boxed nel pannello A viene ingrandita per mostrare l'espressione di entrambi i reporter fluorescenti (B), GFP (C) e RFP solo (D). La linea bianca segna il bordo dell'eminenza ganglionica. B-D: stessa foto, canali diversi o combinazione dei due canali diversi. Barre della scala: 200 m (A), 100 m (B-D). Questa cifra è stata modificata da Denaxa etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Aumento autonomo delle cellule dell'attività di CIS trapiantato espresso da M3D(Gq) al momento dell'amministrazione del CNO. (A-D) Rappresentativo immagini confocali di una sezione coronale di un topo P17 trapiantato a P1 con precursori CI trafettati sia con pCAGGs-IRES-GFP (GFP) che pCAGGs-hM3D (Gq)-IRES-RFP (RFP) plasmids e trattati con CNO. La sezione è stata immunostainsa per GFP (A), RFP (B) e cFos (C). (D) L'immagine combinata dell'immunofluorescenza A, B e C (combo). Si noti che solo i CI che co-esprimono entrambi i plasmidi (frecce bianche in A-D) sono anchecFos , rispetto ai CI che esprimono solo il plasmide control-GFP (frecce gialle in A-D). (E) Quantificazione dei cFos-RFP- cellule trovate nel pallio di topi P17 trapiantati a P1 (normalizzati al totale dellapopolazione RFP) e trattati con veicolo o CNO (N ) e trattati con veicolo o CNO (N . 2). A-D: stessa foto, canali diversi o combinazione dei tre canali diversi. Barre di scala - 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'aumento autonomo delle cellule nell'attività dei CI migliora la sopravvivenza . (A-D) Rappresentativo immagini confocali di fette coronale della corteccia somatosensoriale di topi P17 trapiantati a P0-P2 con precursori CI trastati sia con pCAGGs-IRES-GFP (GFP) che pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) plasmids e trattati con veicolo (A-B) o CNO (C-D). (E) Quantificazione della rft- cellule trovate nel prosencefalo dei topi P17 trapiantati a P0-P2 (normalizzati al totale della GFP- popolazione). RFP(veicolo) - 47% , 3%, CNO - 61% , 3%, p - 0,01, test t del campione accoppiato dello studente, n - 3 veicoli e 3 CNO, un minimo di 150 celle contate per cervello. A e B: stessa foto, canali diversi. C e D: stessa foto, canali diversi. Barre della scala: 50 m. Questa cifra è stata modificata da Denaxa etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Ulteriori informazioni sui supporti utilizzati in questo protocollo.
Discussion
Qui descriviamo una metodologia ampiamente accessibile per modificare geneticamente l'attività dei precursori CI per studiare l'impatto dell'attività intrinseca sulla maturazione CI e/o l'effetto dei CI modulati di attività sull'assemblaggio/funzione del corticale integrato Circuiti.
In passato, diversi laboratori, tra cui il nostro, avevano eseguito esperimenti di elettroporazione in utero al fine di modificare geneticamente i neuroni di proiezione6. Tuttavia, l'elettroporazione in utero in eminenze ganglioniche che includono progenitori CI è molto difficile, a causa di problemi di percorso di conduzione elettrica. Per risolvere questo problema, un piccolo numero di laboratori stanno eseguendo iniezioni guidate ad ultrasuoni seguite da elettroporazione, che è una tecnica impegnativa che richiede attrezzature costose. Questo protocollo offre un'alternativa a queste metodologie accessibili alla maggior parte della comunità scientifica.
Uno degli aspetti più impegnativi di questo protocollo è quello di massimizzare il numero di cellule che sopravvivono nella corteccia ospite a stadi maturi, quando l'analisi fenotipica viene di solito eseguita (molto dipendente dalla progettazione dell'esperimento, ma in genere più vecchia di P17). Ci sono tre passaggi chiave che lo sperimentatore dovrebbe prestare attenzione: (1) L'efficienza dell'elettroporazione. Questo può essere massimizzato garantendo la purezza dei plasmidi di DNA. Per questa procedura devono essere utilizzati solo plasmidi di DNA di alta qualità (un rapporto A260/A280 di 1,9-2,0). Otteniamo tali preparati di DNA di alta qualità impiegando la purificazione del DNA cloruro di clororone di cè. Un altro fattore cruciale è il promotore che guida l'espressione del gene di interesse. Abbiamo scoperto che il vettore pCAPG, che consiste nel promotore di b-actin di pollo, è estremamente potente e può aumentare notevolmente l'efficienza dell'elettroporazione. (2) Il numero di embrioni del donatore che inizia. È importante assicurarsi che un gran numero (12-16) di embrioni dello stesso stadio sia elettroporato. Questo numero può essere aumentato, se più sperimentatori eseguono dissezioni e sezionati tra loro, poiché è importante che le fette corticali embrionali siano ottenute, elettroporate e trasferite all'incubatrice il prima possibile. (3) È importante assicurarsi che un gran numero di cellule venga iniettato in ogni cucciolo per garantire un'alta probabilità di sopravvivenza delle cellule trapiantate fino agli stadi maturi. Inoltre, questo migliorerà notevolmente la probabilità di trapianti di successo poiché i preparati cellulari a bassa densità si tradurranno in una miscela irregolare delle cellule con il mezzo, che produrrà una significativa variabilità nel cervello trapiantato15 .
Il protocollo qui descritto è stato studiato per studiare il ruolo dell'attività nella regolazione della sopravvivenza delle CI in modo autonomo alle cellule. La finestra temporale P14-P17 per l'esecuzione delle iniezioni CNO è stata scelta specificamente in base ai dati pubblicati, che mostrano che il picco della morte cellulare dei progenitori CI trapiantati si verifica durante questo periodo16. Pertanto, questo lasso di tempo o la frequenza delle iniezioni di CNO potrebbe non valere per altri tipi di cellule o regioni cerebrali, e lo sperimentatore dovrebbe regolare questi parametri secondo gli scopi sperimentali specifici. Infine, la metodologia qui descritta per le iniezioni intracraniche di CI è fattibile solo per i cuccioli P0-P5 (a seconda anche dello sfondo della linea del mouse). In linea di principio, eventuali iniezioni su P5 richiederanno assottigliamento o rimozione del cranio15.
Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è la capacità di utilizzare nuovi strumenti codificati geneticamente per visualizzare o manipolare l'attività degli IC durante le diverse fasi di differenziazione che si integrano in una rete in via di sviluppo. Con il ritmo di scoperta di nuovi sensori di tensione e calcio geneticamente codificati, così come nuovi strumenti chemiogenetici e optogenetici, questo protocollo consente ai ricercatori di utilizzarli entro settimane dal rilascio in depositi plasmici, come Addgene.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un ERC Starter Grant (282047), un Wellcome Trust Investigator Award (095589 / s /11 / z), una sovvenzione DEL CE 7 E il Premio Lister Institute per JB. Il lavoro nel laboratorio di V.P. è supportato dal BBSRC (BB/L022974/1), dal UK Medical Research Council (MRC) e dal Francis Crick Institute (che riceve finanziamenti dall'MRC, dal Cancer Research UK e dal Wellcome Trust). La ricerca nel laboratorio M.D. è stata resa possibile attraverso la sovvenzione della Fondazione Stavros Niarchos al B.S.R.C. "Alexander Fleming", come parte dell'iniziativa della Fondazione a sostegno della ricerca greca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium/Supplements | |||
| B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
| DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
| DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
| FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
| 100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
| L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
| MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
| Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
| 100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
| Equipment | |||
| Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
| Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
| Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
| Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
| Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
| Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
| Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
| Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
| Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Other Material | |||
| Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
| Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
| Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
| Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |
References
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