Summary
Ici nous présentons un protocole, conçu pour employer des outils chimiogénétiques pour manipuler l'activité des progéniteurs interneurons corticaux transplantés dans le cortex des souris postnatales tôt.
Abstract
Le développement neuronal est régulé par une combinaison complexe de facteurs environnementaux et génétiques. L'évaluation de la contribution relative de chaque composant est une tâche compliquée, qui est particulièrement difficile en ce qui concerne le développement de l'acide aminobutyrique (GABA)ergic interneurons corticaux (IC). Les CI sont les principaux neurones inhibiteurs du cortex cérébral, et ils jouent un rôle clé dans les réseaux neuronaux, en régulant à la fois l'activité des neurones pyramidaux individuels, ainsi que le comportement oscillatoire des ensembles neuronaux. Ils sont générés dans des structures embryonnaires transitoires (éminences ganglioniques médiales et caudiales - MGE et CGE) qui sont très difficiles à cibler efficacement en utilisant des approches d'électroporation in utero. Les progéniteurs interneuron migrent sur de longues distances pendant le développement embryonnaire normal, avant de s'intégrer dans le circuit cortical. Cette remarquable capacité de se disperser et de s'intégrer dans un réseau en développement peut être détournée en transplantant des précurseurs interneuron embryonnaires dans les cortices de l'hôte postnatal précoce. Ici, nous présentons un protocole qui permet la modification génétique des progéniteurs interneuron embryonnaires utilisant l'électroporation ex vivo focale. Ces précurseurs interneuron s'ingénieront sont ensuite transplantés dans des cortices d'hôtes postnatals précoces, où ils mûriront en IC facilement identifiables. Ce protocole permet l'utilisation de plusieurs outils génétiquement codés, ou la capacité de réguler l'expression de gènes spécifiques chez les progéniteurs interneuron, afin d'étudier l'impact des variables génétiques ou environnementales sur la maturation et l'intégration des CI.
Introduction
La fonction des réseaux neuronaux repose sur l'existence d'un complément équilibré de neurones de projection excitatrice et d'interneurons inhibiteurs. Bien que les interneurones corticaux (IC) ne représentent que 20% de tous les neurones dans les cortices mammifères, les déficits de leur nombre ou de leur fonction sont pensés pour jouer un rôle clé dans la pathogénie des troubles neurodéveloppementaux1,2. L'étude du développement de l'IC est difficile parce que les IC sont générées dans des structures embryonnaires transitoires qui sont difficiles d'accès, et ils suivent une longue migration tangentielle avant d'atteindre le pallium et de développer leur maturité anatomique et physiologique propriétés3. Les mécanismes génétiques et environnementaux sont connus qui régulent le développement de l'IC4, mais il s'est avéré difficile d'étudier la contribution relative de plusieurs facteurs.
Beaucoup d'idées dans le développement de CI ont été obtenues utilisant des systèmes de culture in vitro après isolement des progéniteurs des éminences ganglioniques5,6. L'un des grands avantages de ces méthodes est la possibilité d'étiqueter et de modifier génétiquement les progéniteurs isolés et de suivre leur différenciation en détail, pour détecter les changements cellulaires autonomes. Cependant, ces méthodes sont incapables d'offrir des informations sur les interactions entre les interneurones en développement et un réseau actif. Nous avons adapté ces protocoles, par la transplantation des précurseurs modifiés dans le cortex postnatal précoce. Les progéniteurs interneuron isolés des éminences ganglioniques embryonnaires sont capables de survivre, de se disperser et de s'intégrer dans le réseau hôte lors de la transplantation dans le cortex7,8. Cette méthode a été utilisée pour réduire la gravité des crises d'épilepsie dans les modèles de souris génétiques, et a été proposée comme une nouvelle thérapie possible pour différents troubles neurodéveloppementaux9,10. Un protocole précédent décrit une procédure pour transduire ces précurseurs avec des vecteurs viraux avant les transplantations11. Le protocole que nous décrivons ici permet également la modification génétique des interneurones, mais ne nécessite pas la création d'un vecteur viral, ne nécessitant que de l'ADN plasmide, ce qui augmente considérablement sa flexibilité. Certaines études ont rapporté le succès en utilisant l'électroporation in utero pour modifier génétiquement les progéniteurs interneuron dans les éminences ganglioniques caudales (CGE)12,mais cette méthode s'est avérée très difficile à reproduire.
Dans la section des résultats représentatifs, nous illustrons l'utilisation de cette méthode pour exprimer les récepteurs de concepteur exclusivement activés par les médicaments de concepteur (DREADDs13) dans les CI transplantés, une méthode que nous avons utilisée dans une publication récente14. Nous avons exprimé hM3D(Gq), un récepteur conçu basé sur le récepteur cholinergique humain CHRM3, qui n'affecte pas la fonction neuronale à moins qu'il lie son ligzapine-N-oxyde spécifique (CNO). L'administration de CNO déclenche sélectivement l'activation des cellules exprimanth3D(Gq) hM3D(Gq). Nous avons utilisé cette méthode pour montrer que la dépolarisation cellulaire autonome et transitoire est suffisante pour prévenir l'apoptose des CI pendant le développement14. Combiné à différents outils génétiquement codés, ce protocole a le potentiel de réguler l'expression des gènes vers le haut ou vers le bas, et de visualiser ou de manipuler l'activité cellulaire à différentes étapes de la différenciation interneuron.
Protocol
Les animaux ont été élevés et logés conformément à la United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986).
REMARQUE: Pour la génération de la construction pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, un fragment de SalI-StuI, contenant la séquence hM3D(Gq), a été isolé du plasmide 50463 (Addgene), et inséré dans l'expression vector eCAGGs-RFP (cadeau de F. Guillemot) XhoI-EcoRV.
1. Préparation des tranches corticales d'embryon de souris
- Stériliser l'équipement de laboratoire (p. ex. les microscopes stéréo) et les surfaces (p. ex., bancs) avec un solvant détergent approprié et une solution d'éthanol à 70 % (EtOH) dans l'eau (H2O).
- Utilisez des outils de dissection qui ont été autoclaved et les garder tout le temps dans 100% EtOH.
- Préparer trois aliquots de 20 ml d'agarose à basse température de 4 % dans une solution tampon de 1 x phosphate (PBS), dans des tubes de 50 ml, et les maintenir à 55 oC.
- Sacrifier les souris enceintes par luxation cervicale à 13,5 ou 14,5 jours de gestation (jour embryonnaire E13.5-E14.5).
- Avec une paire de ciseaux de dissection, ouvrez l'abdomen des souris enceintes, retirez les cornes utérines (avec les embryons) et placez-les dans la solution Krebs glacée (tableau1), dans un plat Petri de 90 mm.
- Avec une paire de forceps fins d'étudiant droit, ouvrez les sacs amniotiques, enlevez les embryons et transférez-les dans la solution Krebs glacée fraîche, dans un nouveau plat Petri de 90 mm. Disséquer le cerveau de l'embryon de souris (avant-cerveau, cerveau du milieu, cerveau postérieur) du reste du corps embryonnaire.
- Tenir les cerveaux disséqués de l'arrière-cerveau, les transférer dans la solution Krebs glacée dans un nouveau plat Petri de 90 mm, et les garder sur la glace.
- À l'impétude, tracez une ligne droite à la surface extérieure, au milieu de la partie inférieure de six plats Petri de 35 mm.
- Placez un agarose/PBS de 4 % à faible gelde 20 mL à 37 oC pendant 5 min. Immédiatement après, pauvre 10 ml dans deux plats Petri de 35 mm et intégrez les cerveaux disséqués.
REMARQUE: Les ampoules olfactives doivent faire face vers le bas (en bas du plat Petri). Intégrer 3-4 cerveaux par plat Petri, les aligner dans la ligne droite précédemment dessiné. Laissez de l'espace de 3 à 5 mm entre les deux cerveaux. - Répétez les étapes 1.8 et 1.9 jusqu'à ce que tous les cerveaux disséqués aient été incorporés.
- Placez les cerveaux intégrés à 4 oC, afin que l'agarose se solidifie, et sculptez ensuite les trois cerveaux en un seul bloc de taille et d'orientation appropriées.
REMARQUE: Laisser environ 3 mm autour des bords des échantillons de cerveau. Changer l'orientation des cerveaux, avec les ampoules olfactives sur le dessus. - Coller le bloc sur la surface d'une base de microtome et à l'aide d'une lame chirurgicale coupé tout le chemin à travers le fond du bloc, entre chacun des deux cerveaux, afin de créer 3 blocs indépendants (chaque mini bloc contenant un cerveau).
- Sectionnez les blocs, dans la solution Krebs glacée, en tranches de 250 m d'épaisseur, à l'aide d'un microtome de lame vibrante.
- À l'insu d'une micro-spatule pliée à l'aile plate, ne recueillir que les tranches contenant les éminences ganglioniques médiales ou caudales (MGE ou CGE; Figure 1) et les transférer individuellement sur des membranes filtrantes (13 m de diamètre, 8,0 millions de pore), flottant sur un support essentiel minimal (MEM, tableau 1) dans des plats de culture d'organes en polystyrène (60 mm x 15 mm).
- Placer les plats dans un incubateur de culture tissulaire CO 2, à 37 oC, pendant 1 h, et préparer l'électroporation focale.
2. Électroporation aigu de tranche de cerveau
- Avant de commencer la procédure d'électroporation, préparer 50 ml de gel agarose de 1 % dans un plat Petri de 100 mm. Laisser le gel d'agarose se solidifier à température ambiante (RT) pendant environ 30 min.
- Préparer de minuscules colonnes d'agarose (1 mm de diamètre et 10 mm de longueur), poinçonnées à l'eau-d'œuvre en verre (225 mm de longueur; 2 ml de capacité) et les transférer dans des solutions Krebs glacées.
REMARQUE: Une ampoule de goutte-à-goutte en caoutchouc appropriée pour des pipettes de 2 ml est attachée à la pipette, et en la pressant la colonne peut être libérée de la pipette en verre à la solution de Krebs. - À l'aide d'une lame chirurgicale, coupez de petits blocs d'agarose de deux tailles : un petit qui s'adaptera à la surface de l'électrode (voir ci-dessous) et un plus grand, qui servira de base pour effectuer les injections d'ADN focal dans les tranches de cerveau. Transférer les blocs d'agarose dans la solution Krebs glacée ainsi.
- Préparer la mise en place des injections focales et de l'électroporation aigue (figure 2).
REMARQUE: Pour les injections, l'équipement suivant est nécessaire : 1) un stéréomicroscope de dissection de champ lumineux, 2) un injecteur pneumatique de pico-pompe, 3) un micromanipulateur, 4) un support magnétique, et 5) une plaque de base en acier. Pour l'électroporation de tranche aigue, l'équipement suivant est nécessaire : 1) un platine carré 10 mm électrode de boîte Petri, 2) un platine carré 10 mm électrode de couverture, 3) un micromanipulateur, et 4) un électroporateur. -
Injections d'ADN focal
- Préparer un mélange d'ADN de vecteurs d'expression : pCAGGs-IRES-GFP (vector de contrôle) - pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, à une concentration de 1 g/L pour chaque vecteur et ajouter une solution verte rapide (stock 25 mg/mL) dans une dilution de 1/10.
- Remplir une micropipette en verre tiré (0,5 mm de diamètre intérieur et 1 mm de diamètre externe) avec 10 l du mélange d'ADN et injecter de petites quantités (sur la plage de 25-50 nL) dans la région sélectionnée (MGE/CGE) de la tranche (figure1 et figure 2).
-
Électroporation aigue
REMARQUE: L'électroporation doit être effectuée immédiatement après l'injection d'ADN focal.- Placez le petit bloc d'agarose sur l'électrode de boîte De Petri et attachez la colonne d'agarose à l'électrode de couverture mobile à l'aide d'une micro-spatule à plat.
- Transférer la tranche avec sa membrane de soutien sur le bloc d'agarose et placer l'électrode supérieure avec la colonne d'agarose au-dessus de la région sélectionnée (MGE/CGE) de la tranche.
REMARQUE : Les tensions de charge de 125 V (deux impulsions de 5 ms chacune, intervalle 500 ms) donneront une électroporation réussie (figure 3).
- Après l'électroporation, placer la tranche avec sa membrane de soutien dans le plat et transférer le plat dans un incubateur de culture tissulaire CO 2, à 37 oC.
- Après 1 h, échangez le milieu MEM contre un milieu de base approprié aux cultures neuronales primaires (milieu de base neuronal ; Tableau 1) et incuber les tranches pendant la nuit, pendant environ 18-24 h.
3. Préparation des greffes de cellules
- Vérifiez l'efficacité de l'électroporation dans toutes les tranches. Sélectionnez uniquement les tranches où un nombre acceptable de cellules fluorescentes est observée (Figure 3).
REMARQUE: Électropoler environ 30 tranches/par expérience afin d'acquérir le nombre approprié de cellules pour la greffe (voir ci-dessous). - Disséquer la région sélectionnée (MGE/CGE) de chaque tranche et couper le tissu en petits morceaux dans la solution froide de Krebs, sous un stéréo-microscope fluorescent de dissection.
- Pendant ce temps, placez un tube de 1,5 ml avec un milieu de base neuronal de 900 l dans un bain d'eau à 37 oC.
- Transférer les morceaux de tissu avec un micropipettor P1000 dans un tube de 1,5 ml contenant 500 l de milieu L15/DNase préparé en ajoutant 100 'L de 1 mg/mL de stock de DNase dans le milieu DMEM/F12 en 900 'L de milieu L15. Laver les morceaux de tissu en tapant.
- Ajouter 100 l de DNase (stock de 1 mg/mL dans le milieu DMEM/F12) dans le milieu de base du neurone de 900 l.
- Jetez le milieu L15/DNase et suspendez les morceaux de tissu dans le milieu de base/DNase de neurone de 200 L préparé à l'étape 3.5.
- Placez un micropipettor P200 à 180 l et dissociez mécaniquement les morceaux de tissu en faisant monter et descendre doucement, 20-30 fois, jusqu'à ce qu'une suspension lisse et « crémeuse » soit obtenue.
- Ajouter 200 l de milieu de base/DNase neuronal (volume total final de 400 l) et resuspendre.
- Prenez un aliquot de 4 L de cellules, diluez-vous convenablement et montez sur un hémocytomètre.
- Sous un microscope de champ lumineux, vérifiez l'efficacité de la dissociation et comptez le nombre de cellules.
REMARQUE: Si la dissociation est réussie, des cellules simples brillantes (vivantes) et non des agrégats cellulaires seront observés. - Suspension de cellules centrifugeuses de l'étape 3.8, à 1.000 tr/min, à RT, pendant 5 min, et par la suite, retirez le supernatant du tube et ajoutez le milieu l15/DNase approprié (habituellement 5-7 -L) de sorte que la concentration finale des cellules sera 8 x 105-1.2 x 106 cellules/L.
REMARQUE: Pendant la suspension, il est extrêmement important d'éviter les bulles d'air. - Placez l'aliquot cellulaire sur la glace et ayez un milieu L15/DNase supplémentaire pour les injections.
4. Injections intracrâniennes
REMARQUE: Les procédures suivantes ont lieu dans une salle de procédure au sein de l'établissement Animal House. Puisque les cellules seront injectées directement au cerveau des chiots nouveau-nés sans exposer le cerveau, les conditions aseptiques sont maintenues en stérilisant l'espace de travail avec la solution EtOH de 70% et en utilisant des aiguilles en verre autoclaved. L'équipement suivant est nécessaire pour les injections intracrâniennes : 1) un stéréo-microscope de dissection de champ lumineux, 2) un micro-injecteur, et 3) un coussin chauffant pour la récupération de souris.
- Préparer une aiguille en verre en tirant les aiguilles selon les recommandations du fabricant. Des aiguilles en verre d'un diamètre extérieur de 80 m, d'un diamètre intérieur de 40 m et d'un bevel de 30 degrés sont utilisées dans ce protocole.
REMARQUE: Comme mentionné ci-dessus, les aiguilles doivent être autoclaved avant utilisation. - Remblayez manuellement l'aiguille à l'aide d'huile biologiquement inerte à l'aide d'une aiguille de 30 G, 2 pouces et d'une seringue.
- Assembler et insérer l'aiguille à l'unité d'injection selon les instructions du fabricant.
- Déterminer les paramètres d'injection à un volume maximal (69 nL) et un taux relativement lent (23 nL/s).
- Vider l'aiguille jusqu'à ce que le piston soit complètement étendu.
-
Remplissez l'aiguille.
- Couper un petit morceau d'un ruban greffé et le placer sous un champ lumineux dissection stéréo-microscope. À l'arme p. 10, transférer 5 ll de l'échantillon (aliquot cellulaire) sur la bande, de sorte qu'une goutte sphérique se forme.
- Placez la pointe de l'aiguille dans l'échantillon et remplissez l'aiguille (le piston se rétracte et dessine l'échantillon avec lui).
REMARQUE: Puisque l'échantillon doit être assez visqueux, remplissez l'aiguille en petits pas de sorte que l'échantillon sera équilibrant, et à un rythme lent qui empêche les bulles de se former. L'échantillon doit être lisse et homogène à l'intérieur de l'aiguille. Si l'échantillon est trop visqueux et qu'il n'est pas possible de remplir l'aiguille, ajoutez autant de milieu L15/DNase qu'il est nécessaire pour obtenir la viscosité correcte. Néanmoins, cela va changer la concentration de l'échantillon, et idéalement devrait être évitée.
- Anesthésier les nouveaux-nés (jour postnatal 0-2 [P0-P2]) sur la glace pendant 2-5 min.
REMARQUE: Assurez-vous que le chiot ne bouge pas. - Placez le chiot anesthésié sous le microscope stéréo-microscope de dissection de champ lumineux.
- Effectuez 3-4 injections de 69 nL chacune dans chaque hémisphère.
REMARQUE: Les sites d'injection sont situés à environ 1 mm latéralement à la ligne médiane, et entre 1 mm caudal à bregma et 1 mm rostral à la ligne interaurale. L'extrémité de l'aiguille doit être placée à environ 1 mm de profondeur à la surface du pial. Après chaque injection, l'aiguille est laissée en place pendant environ 30 s et retirée par périodes. - Immédiatement après les injections, placer le chiot sur un coussin chauffant avec le chauffage à son réglage le plus bas (37 oC). Lorsque le chiot récupère, transférez-le dans la cage avec sa mère.
REMARQUE: Ne laissez jamais la mère sans chiots dans la cage. L'ensemble de la procédure (de retirer le chiot de ses compagnons de litière, jusqu'à ce qu'il soit retourné) devrait durer moins de 10 min.
5. Injections de clozapine-N-oxyde
- Préparer la solution de stock DREADD ligand, CNO en diluant 1 mg de CNO dans 50 L de sulfoxide de diméthyle (DMSO) jusqu'à ce que la solution soit translucide. Recharger jusqu'à 10 ml avec de la solution saline de sorte que la concentration finale de CNO soit de 0,1 mg/mL.
REMARQUE: DMSO est toxique. Évitez de l'utiliser à une concentration supérieure à 0,1%. Utilisez comme contrôle une solution saline contenant la même concentration DMSO que la solution contenant CNO. - À partir du jour postnatal 14 et pendant 3 jours constitutifs (P14-P16), dans chaque souris exécutent deux injections intrapéritonéales (I.P.) de CNO (concentration de CNO : 1 mg/kg) ou 0,05% DMSO dans saline, par jour, 12 h de distance.
- Le dernier jour (P17), effectuer une seule injection et sacrifier les souris par luxation cervicale dans une fenêtre de temps de 30 min-1 h.
Representative Results
Utilisant la procédure présentée ici, nous avons examiné si la survie des interneurons corticaux pendant les étapes postnatales tôt est réglée par l'activité d'une manière autonome de cellules. Nous avons effectué 3 expériences d'électroporation de tranches de cerveau (12-16 embryons [E14.5 embryons] par expérience) avec les vecteurs d'expression pCAGGs-IRES-GFP (contrôle) et pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, à une concentration de 1 g/L pour chaque construction. Dans nos expériences d'électroporation, seulement une fraction (environ 50 %; Figure 3) de la GFP- neurones co-exprimé hM3D(Gq) (RFP)et donc le GFP-DP- population a servi de contrôle interne pour l'effet des ligands DREADD. Les interneurones embryonnaires corticaux transfectés ont été mécaniquement dissociés et la suspension cellulaire résultante (8 x 105 cellules/L) greffée dans le cortex des souris sauvages de type P0-P1. Nous avions effectué 6 injections par cerveau. Dans chaque expérience, un minimum de 6 chiots nouveau-nés ont été injectés. L'administration de CNO a augmenté sélectivement l'activité des cellules transfected DePde DP, comme démontré par l'expression de la protéine dépendante de l'activité cFos (figure 4). Le traitement CNO selon le protocole décrit (administrer deux fois par jour P14-P17) a entraîné une augmentation de la proportion de GFP-DFP- par rapport à GFP-DFP- cellules, par rapport au véhicule (0,5% DMSO en salin) déportées administrées (figure 5).
Figure 1 : Tranches téditiques représentatives utilisées pour les expériences d'électroporation aigues. (A-C) Tranches télencéphaliques obtenues à trois niveaux séquentielles rostro-caudal, souilléavec 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). LGE : éminence ganglionique latérale ; MGE: éminence ganglionnaire médiale; CGE: éminence ganglionique caudale. Barres d'échelle de 200 m. Les astérisques jaunes indiquent le site d'électroporation dans chaque tranche. La ligne blanche marque le bord de l'éminence ganglionique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Représentation schématique du flux de travail expérimental. (A) Les tranches de cerveau de souris sont électroporated avec les constructions appropriées, et (B) après 12 h les précurseurs d'interneuron cortical modifiés de 12 h (CI) sont isolés et (C) transplantés dans le pallium des chiots de souris nouveau-nés (P0-P2). Afin de modifier l'activité des CI immatures, les chiots P14 qui avaient reçu des transplantations cellulaires ont été injectés avec CNO ou véhicule pendant quatre jours constitutifs selon le protocole présenté. (A') Photographie de la tranche de cerveau aigu de la souris set-up. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Expérience réussie réussie d'électroporation de tranche aigue. (A) Section coronale représentative d'un cerveau embryonnaire E14.5 transfecté dans le CGE avec les deux plasmides pCAGGs-IRES-GFP (GFP) et pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) plasmides et cultivés pendant 12 h. La section a été immunostained pour GFP (A, B, C) et RFP (A, B, D). La zone en boîte dans le panneau A est agrandie pour montrer l'expression des deux journalistes fluorescents (B), GFP (C) et La DP seulement (D). La ligne blanche marque le bord de l'éminence ganglionique. B-D : même photo, canaux différents ou combinaison des deux canaux différents. Barres d'échelle de 200 m (A), 100 m (B-D). Ce chiffre a été modifié à partir de Denaxa et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Augmentation autonome cellulaire de l'activité des CI transplantés transplantés par M3D(Gq) lors de l'administration de LNO. (A-D) Images confocales représentatives d'une section coronale d'une souris P17 transplantée à P1 avec des précurseurs CI transfectés avec des plasmides pCAGGs-IRES-GFP (GFP) et pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) plasmides et traités avec CNO. La section a été immunostained pour GFP (A), DFP (B), et cFos (C). (D) L'image combinée de l'immunofluorescence A, B et C (combo). Notez que seuls les IC co-exprimant les deux plasmides (flèches blanches en A-D) sont également cFos- par rapport aux IC exprimant seulement le plasmide contrôle-GFP (flèches jaunes en A-D). (E) Quantification descFos etDes cellules de trouvées dans le pallium des souris P17 transplantées à P1 (normalisées à la population totale de DP) et traitées avec le véhicule ou le CNO (N - 2). A-D: même photo, différents canaux, ou la combinaison des trois canaux différents. Barres d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : L'augmentation autonome cellulaire de l'activité des CI améliore la survie . (A-D) Images confocales représentatives de tranches coronales du cortex somatosensoriel des souris P17 transplantées à P0-P2 avec des précurseurs CI transfectés avec des pLGGS-IRES-GFP (GFP) et des pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) plasmides et traités avec des plasmides de véhicule (A-B)ou CNO (C-D). (E) Quantification descellules de La DP trouvées dans le cerveau des souris P17 transplantées à P0-P2 (normalisées à la population totale de GFP). LaDP (véhicule) est de 47 %, soit 3 %, CNO, 61 %, 3 %, p, 0,01, l'échantillon apparié de l'étudiant, le véhicule n 3 et le 3 CNO, un minimum de 150 cellules comptées par cerveau. A et B : même photo, différents canaux. C et D: même photo, différents canaux. Barres d'échelle de 50 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Denaxa et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1 : Informations supplémentaires concernant les médias utilisés dans ce protocole.
Discussion
Nous décrivons ici une méthodologie largement accessible pour modifier génétiquement l'activité des précurseurs ci-dessus afin d'étudier l'impact de l'activité intrinsèque sur la maturation ci-dessus, et/ou l'effet de l'activité moduléE CI sur l'assemblage/fonction de la corticale intégrée Circuits.
Dans le passé, plusieurs laboratoires, dont le nôtre, avaient effectué des expériences d'électroporation utérine afin de modifier génétiquement les neurones de projection6. Cependant, l'électroporation in utero dans les éminences ganglioniques qui incluent des progéniteurs de CI est très difficile, due aux problèmes électriques de chemin de conduction. Afin de résoudre ce problème, un petit nombre de laboratoires effectuent des injections guidées par ultrasons suivies d'électroporation, une technique exigeante qui nécessite un équipement coûteux. Ce protocole offre une alternative à ces méthodologies qui est accessible à la majorité de la communauté scientifique.
L'un des aspects les plus difficiles de ce protocole est de maximiser le nombre de cellules qui survivent dans le cortex hôte aux stades matures, lorsque l'analyse phénotypique est généralement effectuée (très dépendante de la conception de l'expérience, mais généralement plus ancienne que P17). Il y a trois étapes clés auxquelles l'enquêteur doit prêter attention : (1) L'efficacité de l'électroporation. Cela peut être maximisé en assurant la pureté des plasmides de l'ADN. Seuls les plasmides d'ADN de haute qualité (un rapport A260/A280 de 1,9-2.0) devraient être utilisés pour cette procédure. Nous obtenons de telles préparations d'ADN de haute qualité en employant la purification d'ADN de chlorure de césium. Un autre facteur crucial est le promoteur qui conduit à l'expression du gène d'intérêt. Nous avons constaté que le vecteur pCAGGs, qui se compose du promoteur de poulet b-actin, est extrêmement puissant et peut augmenter considérablement l'efficacité d'électroporation. (2) Nombre d'embryons donneurs partants. Il est important de s'assurer qu'un grand nombre (12-16) d'embryons d'un même stade sont électroporated. Ce nombre peut être augmenté, si plus d'expérimentateurs effectuent des dissections d'embryons et se coupent ensemble, car il est important que des tranches corticales embryonnaires soient obtenues, électroporated et transférées à l'incubateur dès que possible. (3) Il est important de s'assurer qu'un grand nombre de cellules sont injectées dans chaque chiot pour assurer une chance élevée de survie des cellules transplantées jusqu'à ce que les stades de maturité. En outre, cela améliorera considérablement la probabilité de transplantations réussies puisque les préparations cellulaires de faible densité entraîneront un mélange inégal des cellules avec le milieu, ce qui produira une variabilité significative dans les cerveaux transplantés15 .
Le protocole décrit ici a été conçu pour étudier le rôle de l'activité dans la régulation de la survie de l'IC d'une manière autonome en cellule. La fenêtre de temps P14-P17 pour l'exécution des injections de CNO a été spécifiquement choisie selon les données publiées, qui montrent que le pic de la mort cellulaire des progéniteurs CI transplantés se produit au cours de cette période16. Par conséquent, ce laps de temps ou la fréquence des injections de CNO pourrait ne pas être vrai pour d'autres types de cellules ou régions du cerveau, et l'investigateur devrait ajuster ces paramètres en fonction des fins expérimentales spécifiques. Enfin, la méthodologie décrite ici pour les injections intracrâniennes de CI n'est réalisable que pour les chiots P0-P5 (en fonction également de l'arrière-plan de la ligne de souris). En principe, toute injection au-dessus de P5 nécessitera l'amincissement ou l'enlèvement du crâne15.
L'un des principaux avantages de ce protocole est la capacité d'utiliser de nouveaux outils génétiquement codés pour visualiser ou manipuler l'activité des IC à différentes étapes de différenciation au fur et à mesure qu'ils s'intègrent dans un réseau en développement. Avec le rythme de la découverte de nouveaux capteurs de tension et de calcium génétiquement codés, ainsi que de nouveaux outils chimiogénétiques et optogénétiques, ce protocole permet aux chercheurs de les utiliser dans les semaines suivant leur libération dans des dépôts de plasmides, comme Addgene.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de démarrage du CER (282047), un prix Wellcome Trust Investigator Award (095589/Z/11/Z), une subvention DU 7e PC EC DESIRE et un prix de l'Institut Lister à JB. Les travaux dans le laboratoire de V.P. sont soutenus par le BBSRC (BB/L022974/1), le UK Medical Research Council (MRC) et le Francis Crick Institute (qui reçoit des fonds de la MRC, de Cancer Research UK et du Wellcome Trust). La recherche dans le laboratoire de M.D. a été rendue possible grâce à la subvention de la Fondation Stavros Niarchos à la B.S.R.C. "Alexander Fleming", dans le cadre de l'initiative de la Fondation pour soutenir la recherche grecque.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium/Supplements | |||
| B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
| DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
| DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
| FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
| 100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
| L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
| MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
| Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
| 100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
| Equipment | |||
| Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
| Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
| Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
| Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
| Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
| Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
| Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
| Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
| Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Other Material | |||
| Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
| Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
| Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
| Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |
References
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Glausier, J. R., Lewis, D. A. GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go. Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual Review Neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nature Review Neuroscience. 18 (5), 299-309 (2017).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. Journal of Neuroscience. 24 (11), 2612-2622 (2004).
- Denaxa, M., et al. Maturation-promoting activity of SATB1 in MGE-derived cortical interneurons. Cell Reports. 2 (5), 1351-1362 (2012).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. Nature Neuroscience. 2 (5), 461-466 (1999).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Vogt, D., et al. Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies. Journal of Visualized Experiments. (98), e52740 (2015).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Denaxa, M., et al. Modulation of Apoptosis Controls Inhibitory Interneuron Number in the Cortex. Cell Reports. 22 (7), 1710-1721 (2018).
- Quatrocolo, G., et al. Homochronic Transplatation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (136), e57723 (2018).
- Southwell, D. G., et al. Intrinsically determined cell death of developning cortical interneurons. Nature. 491 (7422), 103-113 (2012).
