여기에서 우리는 초기 출생 후 마우스의 피질로 이식된 피질 interneuron 선조의 활동을 조작하기 위하여 화학유전학 공구를 이용하기 위하여 디자인된 프로토콜을 제시합니다.
신경 발달은 환경과 유전 요인의 복잡한 조합에 의해 통제됩니다. 각 성분의 상대적 기여도를 평가하는 것은 복잡한 작업이며, 이는 γ-아미노부티르산(GABA)의 발달과 관련하여 특히 어렵다. CIs는 대뇌 피질의 주요 억제 뉴런이며, 개별 피라미드 뉴런의 활동과 뉴런 앙상블의 진동 행동을 모두 조절함으로써 뉴런 네트워크에서 중요한 역할을 합니다. 그(것)들은 자궁 전기 천공 접근에서 사용하여 능되게 표적으로 하기 매우 어려운 일시적인 배아 구조물 (내측 및 꼬리 신경절 저명한 – MGE 및 CGE)에서 생성됩니다. 인터뉴런 선조는 정상적인 배아 발달 중에 피질 회로에 통합되기 전에 먼 거리를 이동합니다. 개발 네트워크에 분산하고 통합하는이 놀라운 능력은 초기 출생 후 호스트 코르티제로 배아 인터뉴런 전구체를 이식하여 납치 될 수 있습니다. 여기에서, 우리는 국소 생체 내 전기를 사용하여 배아 간 신경 세포 선조의 유전자 변형을 허용하는 프로토콜을 제시한다. 이 조작된 인터뉴런 전구체는 그 때 초기 출생 후 호스트 cortices로 이식되고, 그(것)들은 쉽게 식별 가능한 CIs로 성숙할 것입니다. 이 프로토콜은 여러 유전자 부호화 된 도구의 사용, 또는 인터 뉴런 선조에서 특정 유전자의 발현을 조절하는 능력을 허용, 성숙에 유전 적 또는 환경 적 변수중 하나의 영향을 조사하기 위해 및 C의 통합.
신경 네트워크의 기능은 흥분성의 투영 뉴런과 억제 인터뉴런의 균형 잡힌 보완의 존재에 의존한다. 피질 인터뉴런 (CIs)은 포유류 코르티크의 모든 뉴런의 20 %를 나타내지만, 그 수 또는 기능의 적자는 신경 발달 장애의 발병 기전에서 중요한 역할을하는 것으로 생각됩니다1,2. CI개발연구는 CI가 접근하기 어려운 일시적인 배아 구조에서 생성되고, 팔륨에 도달하고 성숙한 해부학적 및 생리학적 으로 발전하기 전에 긴 접선 이동을 따르기 때문에 도전적입니다. 속성3. 유전적 및 환경적 기전 모두CI 개발 4를 조절하는 것으로 알려져 있지만, 여러 요인의 상대적 기여도를 연구하기는 어렵다는 것이 입증되었습니다.
CI 개발에 대한 많은 통찰은 신경절 저명5,6으로부터선조를 격리한후 시험관내 배양 시스템을 사용하여 얻어졌다. 이 방법의 큰 이점 의 한은 고립된 선조를 표지하고 유전으로 수정하고 세포 자율적인 변경을 검출하기 위하여 그들의 분화를 상세히 따르는 가능성입니다. 그러나, 이러한 방법은 인터뉴런 개발과 활성 네트워크 사이의 상호 작용에 관한 정보를 제공 할 수 없습니다. 우리는 초기 출생 후 피질에 수정 된 전구체의 이식에 의해, 이러한 프로토콜을 적응했다. 배아 신경절 전도자로부터 분리된 인터뉴런 선조는 피질7,8로이식시 생존, 분산 및 숙주 네트워크로 통합할 수 있다. 이 방법은 유전마우스 모델에서 간질 발작의 중증도를 감소시키기 위해 사용되어 왔으며, 상이한신경발달 장애9,10에대한 가능한 새로운 치료법으로 제안되고 있다. 이전 프로토콜은 이식11전에 바이러스 벡터로 이러한 전구체를 변환하는 절차를 설명합니다. 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 또한 interneurons의 유전 적 변형을 허용하지만, 크게 유연성을 증가 만 플라스미드 DNA를 필요로 하는 바이러스 벡터의 생성을 필요로하지 않습니다. 몇몇 연구 결과는 꼬리 신경절 eminences (CGE)12에있는 interneuron 선조를 유전으로 수정하기 위하여 자궁 전기천공에서 사용에 있는 성공을 보고했습니다, 그러나 이 방법은 재생하기 아주 어려운 입증되었습니다.
대표적인 결과 섹션에서, 우리는 이식된 IS에서 디자이너 약물(DREADDs 13)에의해 독점적으로 활성화된 디자이너 수용체를 발현하기 위해 이 방법의 사용을 예시하고, 최근 간행물14에사용된 방법. 우리는 hM3D (Gq), 인간의 해 수용체 CHRM3에 기초하여 엔지니어링 수용체를 표현, 이는 그것의 특정 리간 클로자핀 -N-산화물 (CNO)를 결합하지 않는 한 신경 기능에 영향을미치지 않는. CNO 투여는 선택적으로 hM3D(Gq) 발현 세포의 활성화를 트리거한다. 우리는 세포 자율과 과도 탈분극이 개발14동안 CIs의 세포 사멸을 방지하기에 충분하다는 것을 보여주기 위해이 방법을 사용했다. 다른 유전자 부호화 된 도구와 결합, 이 프로토콜은 위- 또는 하향 조절 유전자 발현에 잠재력을 가지고, 인터뉴런 분화의 다른 단계 동안 세포 활동을 시각화하거나 조작.
여기서 우리는 CI 성숙에 대한 본질적 활동의 영향 및/또는 통합 피질의 조립/기능에 대한 활동의 영향을 연구하기 위해 CI 전구체의 활동을 유전적으로 수정하는 널리 접근가능한 방법론을 설명합니다. 회로.
과거에는, 저희를 포함하여 몇몇 실험실은, 유전적으로 투영 뉴런6을 수정하기 위하여 자궁전기 천공 실험에서 수행했습니다. 그러나, 자궁내 전기천공에서 CI 전구체를 포함하는 신경절 전도체로의 전기전도 문제는 매우 어렵다. 이 문제를 해결하기 위해 소수의 실험실에서 초음파 유도 주사를 수행하고 전기 천공에 이어 고가의 장비를 필요로하는 까다로운 기술입니다. 이 프로토콜은 대부분의 과학 커뮤니티에 액세스 할 수있는 이러한 방법론에 대한 대안을 제공합니다.
이 프로토콜의 가장 어려운 측면 중 하나는 현상형 분석이 일반적으로 수행될 때 숙주 피질에서 생존하는 세포의 수를 최대화하는 것입니다(실험 설계에 매우 의존하지만 일반적으로 P17보다 오래되다). 조사자가 주의해야 할 세 가지 주요 단계가 있습니다: (1) 전기 포공의 효율. 이것은 DNA 플라스미드의 순도를 보장함으로써 최대화될 수 있다. 이 절차에는 고품질 DNA 플라스미드(A260/A280 비율 1.9-2.0)만 사용해야 합니다. 우리는 염화 세슘 DNA 정제를 채택하여 이러한 고품질 DNA 제제를 얻습니다. 또 다른 중요한 요인은 관심 있는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터입니다. 우리는 닭 b-액틴 프로모터로 구성된 pCAGG 벡터가 매우 강력하고 전기 천공 효율을 극적으로 증가시킬 수 있음을 발견했습니다. (2) 시작 기증자 배아의 수. 동일한 단계의 배아의 많은 수 (12-16)가 전기 화되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 더 많은 실험자가 배아 해부를 수행하고 함께 단면을 수행하는 경우이 숫자를 증가 시킬 수 있습니다., 배아 피 질 조각을 얻을 하는 것이 중요 하기 때문에, 전기 및 가능한 한 빨리 인큐베이터에 전송. (3) 성숙 단계까지 이식 세포 생존의 높은 기회를 보장하기 위해 각 강아지에 많은 수의 세포가 주입되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 저밀도 세포 제제는 세포의 고르지 못한 혼합을 배지와 혼합하여 이식된 뇌에서 상당한 가변성을 생성하기 때문에 성공적인 이식의 가능성을 극적으로 향상시킵니다15 .
여기서 설명된 프로토콜은 세포 자율방식으로 CI 생존을 조절하는 활동의 역할을 조사하기 위해 맞춤화되었다. CNO 주사를 수행하기 위한 P14-P17 시간 윈도우는 게시된 데이터에 따라 특별히 선택되었으며, 이는 이식된 CI 전구체의 세포 사멸의 피크가 이 기간16동안 발생한다는 것을 보여준다. 따라서, 이 시간 프레임 또는 CNO 주사의 주파수는 다른 세포 유형 또는 뇌 영역에 대해 사실이 아닐 수 있으며, 조사자는 특정 실험 목적에 따라 이러한 파라미터를 조정해야 한다. 마지막으로, 여기에 설명된 CI의 두개내 주사에 대해 설명된 방법론은 P0-P5 새끼(마우스 라인 배경에 따라 다름)에 대해서만 가능합니다. 원칙적으로 P5를 통해 주사하면 두개골15의숱이 또는 제거해야합니다.
이 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 새로운 유전자 인코딩 도구를 사용하여 개발 네트워크에 통합할 때 차별화 단계 동안 CIs의 활동을 시각화하거나 조작할 수 있다는 것입니다. 새로운 유전자 부화 전압 및 칼슘 센서의 발견 속도뿐만 아니라 새로운 화학 유전학 및 광유전학 도구로, 이 프로토콜은 연구원이 Addgene와 같은 플라스미드 저장소에 방출의 주 이내에 그들을 사용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 ERC 스타터 그랜트 (282047), 웰컴 트러스트 조사관 상 (095589 / Z / 11 / Z), FP7 EC DESIRE 교부금 및 JB에 리스터 연구소 상에 의해 지원되었다. V.P.의 실험실에서 일은 BBSRC (BB/L022974/1), 영국 의학 연구 위원회 (MRC), 프랜시스 크릭 연구소 (MRC, 암 연구 영국 및 웰컴 트러스트로부터 자금을 받는)에 의해 지원됩니다. M.D. 실험실에서 연구는 그리스 연구를 지원하는 재단의 이니셔티브의 일환으로 B.S.R.C. “알렉산더 플레밍”에 스타브로스 니아코스 재단의 보조금을 통해 가능하게되었다.
Medium/Supplements | |||
B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
Equipment | |||
Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Other Material | |||
Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |