Summary
Vi har optimerat ett protokoll för att isolera och rena murina hjärtpericyter för grundläggande forskning och utredning av deras biologi och terapeutiska potential.
Abstract
Pericyter, perivaskulära celler av mikrokärl och kapillärer, är kända för att spela en roll i angiogenes, kärl stabilisering, och endotelial barriär integritet. Men, deras vävnads-specifika funktioner i hjärtat är inte väl förstått. Dessutom finns det för närvarande inget protokoll som utnyttjar lätt åtkomliga material för att isolera och rena pericyter av hjärt ursprung. Vårt protokoll fokuserar på att använda den utbredda däggdjurs modellen, musen, som vår källa till celler. Med hjälp av enzymatisk nedbrytning och mekanisk dissociation av hjärtvävnad, fick vi en rå cell blandning som ytterligare renas genom fluorescens aktivera cell sortering (FACS) av en uppsjö av markörer. Eftersom det inte finns någon enda entydiga markör för pericyter, vi gated för celler som var CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Efter rening, dessa primära celler var odlade och blint flera gånger utan några förändringar i morfologi och markör uttryck. Med förmågan att regelbundet få primär murina hjärtinpericyter med hjälp av vårt protokoll, vi hoppas att ytterligare förstå rollen av pericyter i kardiovaskulär fysiologi och deras terapeutiska potential.
Introduction
Perivaskulära celler som kallas pericyter omger mikrokärlen och kapillärerna i det vaskulära trädet1,2. Fysiologiskt, de är kända för att främja och spela en roll i angiogenes, öka barriär integritet på grund av deras nära relation med endotelceller samt stabilisera och mogna fartyg1,2. Dessutom, dysfunktion och/eller förlust av dessa celler har varit inblandade i sjukdomar som Alzheimers sjukdom2,3 och olika hjärt-kärlsjukdomar4. Dessa celler finns i hela kroppen, men cellnumren är vävnads beroende. Pericyter har framför allt studerats i hjärnan på grund av hög vascularisering av blod-hjärnbarriären1,2. Men i hjärtat, är biologi pericyter understuderas.
Nyligen, det finns ökade intressen inom området för hjärt pericyter, men det finns för närvarande ingen strömlinjeformad protokoll tillgängliga för deras isolering från en av de mest använda verktygen i biologi-musen. Det finns protokoll i litteraturen om att isolera pericyter från hjärnan5, näthinnan6, moderkakan7, och skelettmuskulaturen8,9; emellertid, få protokoll på isolera pericyter från hjärtat. Det finns flera grupper som har isolerade hjärt pericyter. Nees et al. kunde isolera en riklig mängd hjärt pericyter från flera arter inklusive musen; men deras metoder används specifik inbyggd utrustning som minskar reproducerbarhet10. Avolio et al.11, Chen et al.12, och Baily et al.13 också framgångsrikt isolerade hjärt pericyter från mänsklig hjärtvävnad, men mänskliga vävnader är inte alltid tillgängliga och svårt att få för vissa utredare. Här har vi utvecklat en isoleringsmetod för att få hjärt pericyter från musmodeller för utredare för att ytterligare studera deras biologi med lätt tillgängliga material.
Använda enzymatisk matsmältning och fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) med kända viktiga pericytbiologi markörer14, vårt protokoll tillåter oss att isolera och rena en population av pericyter som kännetecknas av CD31-CD34-CD45- CD140b+NG2+CD146+. Vår panel av markörer innehåller både inkludering och uteslutnings markörer. CD45 används som en markör för att utesluta hematopoietiska celler. CD31 används som markör för att utesluta endotelceller. CD34 används som en markör för att utesluta både hematopoietiska och endoteliala progenitorceller. CD146 är en markör för perivaskulära celler. Slutligen, NG2 och CD140b (även känd som trombocyter härledda tillväxtfaktorreceptor beta — PDGFRβ) är båda accepterade markörer för pericyter14. Den primära kulturen erhålls kan odlas och blint flera gånger utan förändringar i morfologi eller markör uttryck. Dessutom kan dessa celler Co-odlade med endotelceller att studera deras interaktioner och överhörning med varandra. Denna cell isoleringsmetod gör det möjligt för utredarna att studera biologi och patofysiologi av hjärtrelaterade pericyter från vildtyp, sjukdom och genetiskt variant musmodeller.
Protocol
Alla djur var inhysta och används i en sammanslutning för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg International (AAALAC) ackrediterad anläggning och allt djur arbete utfördes under lämplig veterinär tillsyn och under den institutionella djur Skötsel-och användnings utskott (IACUC) godkänt protokoll från Amgen Inc.
1. förberedelse av verktyg och odlingsmedier
- Autoklav kirurgisk 9 cm rak spets fin punkt sax och 10 cm vinklade räfflad pinps.
- Tillsätt 25 mL av 5% foster bovint serum (FBS) och 5 mL 1% penicillin streptomycin (P/S) i en 500 mL flaska kalcium magnesium fri Dulbecco s fosfat-buffrad saltlösning (CMF-DPBS). Placera lösningen i ett isbad för att säkerställa att den blir kall vid användningstillfället. Aliquot 50 mL till ett 50 mL koniskt rör för hjärt isolering. Tillsätt i 250 enheter/mL heparin natrium lösning i 50 mL alikvot. Detta kommer att kallas hepariniserad CMF-dpbs.
- Tillsätt 20% FBS (100 mL) och 1% P/S (5 mL) i en 500 mL flaska med hög glukos Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM). Detta kommer att kallas den enzymfria kulturen media. Alikvot 20 mL DMEM + 20% FBS + 1% P/S och tillsätt i 500 μg/mL kollagenas B. Detta kommer att kallas för enzym lösningen. Håll både de enzymfria odlings medierna och enzym lösningen varma vid 37 ° c i en inkubator eller vattenbad.
2. beredning av djur och tillvaratagande av hjärtvävnad
- Intraperitonealt injicera en mus med 250 enheter av heparin natrium lösning med en 31 G nål spruta. Vänta sedan 10 − 15 min medan musen förblir aktiv i sin hem bur.
Anmärkning: Representativa data i denna studie erhölls från en 4 månader gammal hane C57BL/6 mus. Detta protokoll kan dock användas på alla möss oavsett stam, ålder, kön, vikt, etc. - Anesthetize musen med 5% isofluran. Kontrollera anestesidjupet av musen genom att nypa reflex.
- Placera den sövda musen i liggande läge och tejpa ner dess armar. Öppna försiktigt brösthålan och kanylera fallande aorta med en 25 G fjäril nål.
- Gör en nick i rätt Atrium och parfymera hjärtat med minst 20 ml 250 enheter/ml hepariniserad CMF-dpbs på 2 ml/min med en variabel-flöde Peristaltisk pump. När PBS kommer ut ur rätt Atria ren, perfusion är klar.
- Skär hjärtat ut vid aorta och placera den i iskall CMF-DPBS.
3. dissociation av hjärtvävnad
- Överför hjärtat till en 15 cm x 15 cm petriskål. Skär hjärtat i små bitar (1 mm/styck) med hjälp av vår sax och fina punkt tång med tillräckligt enzymlösning för att täcka bitarna (10 − 15 mL).
- Överför bitar och lösning i en 50 mL koniskt rör, tätning med paraffin plastfilm, och inkubera vid 37 ° c på en orbitalshaker vid 120 RPM för 75 min.
- Efter kollagenase matsmältning med enzymet lösningen, dekanera vätskan genom en 100 μm cell SIL i en ny 50 mL rör men lämna tillräckligt med lösning för att se till att bitarna inte torkar ut.
- Med hjälp av Fine Point forceps, ta ut vävnaden från röret och placera några stycken på ett Mikroskop bild. Sedan slipa vävnaden mellan två Mikroskop diabilder för att bryta upp vävnaden. Skölj glasen med enzymfria odlingsmedier i ett nytt 50 mL koniskt rör.
- Upprepa steg 3,4 tills alla Vävnadsdelar har separerats.
- Kombinera lösningarna från steg 3.3 − 3.5 i ett rör. Sila den resulterande suspensionen genom en 100 μm cell SIL i ett nytt 50 mL koniskt rör.
- Centrifugera vid 220 x g, 4 ° c, i 5 min. Aspirera bort tidigare lösning och försiktigt Omsuspendera cellpelleten i färska enzym fria odlingsmedier.
- Räkna celler och kontrollera lönsamheten med hjälp av en cell räknare. Späd ut cellerna till 1 x 106/ml med infärgningsbufferten Cold FACS innehållande 500 ml dpbs och 10 − 25 ml 2 − 5% bovint serumalbumin (BSA). Cellerna är redo att färgas och sorteras.
4. rening av pericyter från rå cell blandning med FACS
- Bered och märk 5 mL FACS-rör för alla reglage och cellprov. Alikvot ut celler (1 mL celler per tub) för ett omålat prov, fluorescens minus en (FMO) kontroller och isotypmatchade kontroller. Använd de återstående cellerna för sorteringen. Alla reglage och prover kan förberedas och färgas på samma gång.
Observera:Totalt 13 mL vid 0,5 x 106celler/mL användes för den representativa sorteringen från ett hjärta. Emellertid, volymen beror på hur många celler som prövaren erhåller från sin isolering, hur många hjärtan de använder, och hur väl hjärtat vävnaden är smält; storleken på varje hjärta är också en variabel som kan förändra volymen.- Använd kompensations kulor (tabell över material) för att optimera fluorescenskompensationer. Förbered en kompensations kontroll för varje fluorokrom i experimentet i ett märkt 5 mL FACS-rör. För detta experiment, Förbered totalt 9 kompensationskontroller-2 typer av ofärgade pärlor plus 7 olika fluorokromer från markör panelen inklusive NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, och cell lönsamhet-APC-Cy7 ( Tabell över material).
- Tillsätt en droppe kompensationpärlor (~ 50 μL) från injektionsflaskan med squeeze till varje tub. Tillsätt sedan 1 μL antikropp till pärlorna. Upprepa för varje antikropp från markör panelen. Blanda kraftigt med puls-vortexing. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° c skyddat från ljus med undantag för cell viabilitet som kan lämnas vid rumstemperatur skyddat från ljus.
- Tillsätt därefter 3 mL FACS-färgningsbuffert till varje tub och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° c. Aspirera på lösning och Omsuspendera varje pärlpellet i 400 μL av FACS färgbuffert. Kompensations kontrollerna är klara att användas. Håll på is.
- Använd FMO-kontroller för att optimera bakgrunds färgning på grund av spektralöverlappning.
- Bered FMO-kontroller genom att använda 1 mL celler som alicierats från avsnitt 4,1 i ett 5 mL FACS-rör och lägga in alla antikroppar från markör panelen som beskrivs i steg 4.1.1 vid en 1:100 utspädning men exklusive en antikropp. Till exempel, Förbered en NG2-AF488 FMO genom att inkludera antikroppar för CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, cell viabilitet färgämne men inte NG2-AF488 antikropp. Blanda försiktigt med puls-vortexing. Upprepa för varje antikropp för totalt 7 kontroller. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° c skyddat mot ljus.
- Tillsätt därefter 3 mL FACS-färgningsbuffert till varje tub och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° c. Aspirera bort lösningen och Omsuspendera varje cellpellet i 400 μL av FACS färgbuffert. FMO-kontrollerna är klara att användas. Håll på is.
- Använd isotypmatchade kontroll antikroppar (tabell över material) för ospecifik färgning.
- Förbered isotypen-kontroller genom att tillsätta den isotypmatchade kontroll antikroppen (tabell över material) till 1 ml cellprov som framställts från avsnitt 4,1 vid en 1:100 utspädning vardera i ett 5 ml FACS-rör. Blanda försiktigt med puls-vortexing. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° c skyddat mot ljus.
- Tillsätt därefter 3 mL FACS-färgningsbuffert till varje tub och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° c. Aspirera bort lösningen och Omsuspendera varje cellpellet i 400 μL av FACS färgbuffert. Isotypen-kontrollerna är klara att användas. Håll på is.
- Förbered cellerna sorteras genom att lägga till antikropp cocktail till nyligen isolerade celler.
- Förbered cell provet från avsnitt 4,1 genom att tillsätta en antikropps cocktail som innehåller anti-Mouse NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 på 1:100 spädning vardera och cell livskraft färg vid 1:1000 utspädning. Skaka försiktigt för att blanda. Inkubera proverna vid 4 ° c i 30 minuter som skyddas mot ljus.
- Efter färgning, tvätta celler med FACS färgbuffert genom centrifugering vid 300 x g för 5 min 4 ° c. Aspirera bort lösningen och Omsuspendera cellpelleten i FACS färgbuffert till 0,5 x 106 celler/ml.
- Med nya FACS-rör som har 35 μm filter toppar, Pipettera färgade cellprover på locken och gravitationen filtratet för att få enstaka cellsuspensioner. Håll på is.
- Använd kompensations kulor (tabell över material) för att optimera fluorescenskompensationer. Förbered en kompensations kontroll för varje fluorokrom i experimentet i ett märkt 5 mL FACS-rör. För detta experiment, Förbered totalt 9 kompensationskontroller-2 typer av ofärgade pärlor plus 7 olika fluorokromer från markör panelen inklusive NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, och cell lönsamhet-APC-Cy7 ( Tabell över material).
- Använd en cell sorterare för att rena celler.
- Kör de obefläckade cellerna på cell Sorteraren för att ställa in spänningar och korrigera för bakgrunds signalen (till exempel, Ställ in spänningar för framåt scatter till 490 − 560 och för sido spridning till 180 − 250).
- Kör varje enskild färgkompensation pärla provet en i taget för att justera spänningar för varje kanal och justera portarna för den positiva signalen. Samla in data. Använd programvaran för att beräkna för spektralöverlappning genom att beräkna kompensations matrisen. Alla spänningar är klara och inställda.
- Kör varje isotypen-kontroll en i taget och dessa data kan användas för att justera portarna för icke-specifik bindning om det finns några.
- Kör varje FMO-prov ett i taget och justera spänningar för varje kanal för att korrigera för spektralblödning genom en Multi-Color panel.
- Kör de färgade cellproverna i cell Sorteraren och samla in celler i 10 mL enzymfria odlingsmedier (DMEM + 20% FBS + 1% P/S) i ett 15 mL koniskt uppsamlings rör. Använd följande gating strategi: grind för enskilda celler, grind för levande celler, grind för CD45 negativa celler, grind för CD34 och CD31 negativa celler, grind för NG2 positiva celler, och slutligen grind för CD146 och CD140b positiva celler.
5. odling av pericyter
- Coat en 24-brunn tallrik med 0,2% gelatin för 5 min och aspirera av gelatin lösning. Utsäde nyligen erhållna celler från steg 4.2.5 i DMEM + 20% FBS + 1% P/S upp till 2 x 104 celler/cm2. Kultur celler i en cell inkubator inställd på 37 ° c, 5% CO2 och 95% O2.
- Passaging av pericyter
- När cellerna är 95% confluent, tvätta celler med varma 1x DPBS, och lyft celler med 200 μL av 0,1% trypsin i varje brunn vid rumstemperatur för 3 − 5 min.
- Knacka försiktigt på plattan för att lossa cellerna.
- Neutralisera trypsin med 3.5 x mängden kultur media (700 μL DMEM + 20% FBS + 1% P/S) och Seed passage två (P2) celler på en obestruket 6-brunn tallrik till 2 x 104 celler/cm2.
- Var brunn, när confluent, kanna bli flyttat in i en enkel T-75 kolv så P3 cellerna vilken då kanna bli splittra på en 1:6 grad.
6. karakterisering av pericyter
-
Flöde flödescytometrianalys analys
- Använd samma FACS färgning protokoll och gating strategi som tidigare beskrivits i avsnitt 4.
- Kör kontroller och färgade prover på flödescytometern. Samla in data och analysera data med hjälp av analysprogram varan (tabell över material).
- För att samla in brightfield bilder, odla celler i en kolv i en cell inkubator inställd på 37 ° c, 5% CO2 och 95% O2. Fånga bilder på ett Mikroskop efter celler fäster på ytan.
-
Vävnad
- Odla celler i en 96-brunn plattan tills 90% confluent. Tvätta celler med varma 1x DPBS och fixera med 4% PARAFORMALDEHYD i 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta celler 3x med 1x DPBS och permeabilize med 0,1% tvättmedel för 10 min vid rumstemperatur.
- Inkubera celler med blockerande buffert för 1 h vid rumstemperatur. Efter blockering, tillsätt primära antikroppar (en antikropp per brunn) utspädd 1:100 i blockerande buffert och inkubera vid 4 ° c över natten. Primära antikroppar är: anti-NG2, anti-CD140b, anti-CD31, anti-vimentin, anti-desmin, och anti-alfa smidig muskel Actin.
- Nästa dag, tvätta celler 3x med tvättbuffert (tabell över material). Tillsätt sekundär antikropp utspädd 1:1000 i blockerande buffert och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur i mörker. Sekundär antikropp är en anti-kanin konjugerat till FITC.
- Tvätta celler 3x med tvättbuffert. Tillsätt 300 μM kärn fläck utspädd vid 1:1000 för 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta celler 3x med 1x DPBS och montera med monteringsmaterial.
- Bildceller med ett konfokalmikroskop.
Representative Results
Efter enzymatisk nedbrytning och dissociation av hela hjärtat och innan FACS rening av cellerna, celler är en rå blandning som innehåller många olika celltyper från hjärtat (figur 1a). Efter FACS rening och odling, celler är homogena. De är enkelnucleated, ganska platt, och har den typiska pericytbiologi romboid morfologi (figur 1b).
Använda FACS, celler renas till homogeny. Det obefläckade kontroll cell provet används för att visa den gating strategin (figur 2). Först, skräp och dubletter var gated ut baserat på framåt och sida scatter-distributioner. Sedan var döda celler gated ut på grund av deras Amin reaktion med färgämne som ger en signal större och intensivare än levande celler. Av de levande cellerna, hematopoietiska celler var gated ut genom att vara CD45+. För att ytterligare ta bort hematopoietiska och endotelceller, CD34+ och CD31+ celler var gated ut. Slutligen valdes NG2+ och CD140b+/cd146+ -celler ut för att vara perivaskulära celler med uttryck för typiska pericytmarkörer (figur 3). Markör panelen testades också på mus koronar endotelceller som en kontroll (kompletterande figur 1). Endast omkring 1% av rå cell blandningen bestod av pericyter efter sortering.
För att validera att cellerna verkligen var pericyter, passerade vi cellerna för ytterligare karakterisering. Cellerna växte snabbt när de nådde P3 i flaskor T-75 utan förändringar i lönsamheten när de blev äldre (kompletterande figur 2). Jämfört med mänskliga hjärn pericyter, cellerna hade en liknande morfologi (figur 4a). Jämfört med mus och mänskliga glatta muskelceller, cellerna hade en annan morfologi (figur 4a). Det fanns heller inga observerade förändringar i morfologi eller markör uttryck vid P7 vid immunfärgade eller flödescytometrianalys efter passaging (figur 4b,C).
Figur 1 : Råa celler kontra renade celler. (A) brightfield bild av rå cell blandning post hela hjärtat enzymatisk matsmältning och dissociation som har odlades i en T25 kolv i 14 dagar. B) brightfield-bilden av en homogen population av kardiella pericyter efter sortering och odling efter 14 dagar. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa bilder av FACS analys av ofärgade celler. Schematisk representation av den gating strategi som används för att rena rå cell blandning. Grind för celler som är Single, Live, CD45-, CD31-, CD34-, NG2+, CD146+och CD140b+. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa bilder av FACS analys av råa celler. Schematisk representation av den sortering som används för att få en homogen population av hjärtrelaterade pericyter. Ungefär 1% av de råa cellerna är CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Karakterisering av primära isolerade hjärt pericyter (A) brightfield bilder av odlade celler från mänskliga hjärnan (hPC) och mus hjärtan (MPC) visar liknande pericytbiologi cell morfologi men olika morfologi från mänskliga glatta muskelceller hsmc) och mus glattmuskelceller (MSMC). Skalstapel = 100 μm.Bfenotypisk karakterisering av celler vid P7 med immunocytokemi för pericytmarkörer. Skalstapel = 100 μm.Canalys genom flödescytometri av pericyterna vid P7 där de var gated för negativa markörer CD31, CD34, CD45 och positiva markörer NG2, CD140B och CD146. Populationen förblir homogen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: representativa bilder av flödescytometri analys av endotelceller med markör panel. En mus koronar endotelial cellinjer användes som kontroll för bindningen specificitet för markörer. Använda samma gating strategi som användes i sort förutom en positiv grind för CD31 i stället för en negativ grind, endotelceller var negativa för CD45, CD34, NG2, CD140b, och CD146 men positivt för CD31 som förväntat. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: representativa bilder av flödescytometri analys av olika avsnitt av MPC. Primära isolerade hjärtrelaterade pericyter var odlade och passerade upp till passage 12. Celler färgas med propidiumjodid jodid och analyseras på en flödescytometer. Kontrollpopulation är en blandning av döda celler och levande celler. Det fanns inga signifikanta skillnader i antal livskraftiga celler mellan passager. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Discussion
Eftersom studier av hjärtrelaterade pericyter är relativt nya, har den roll som pericyter har i kardiovaskulär fysiologi och patofysiologi ännu inte definierats. I andra organ, de har visat sig spela viktiga roller i fartyget homeostas och perfusion1,2. Jämfört med litteraturen av pericyter från andra organ såsom hjärnan, det finns betydligt färre publikationer om hjärt pericyter. Isoleringen av hjärtrelaterade pericyter är avgörande för förståelsen av deras funktionella egenskaper och signaleringsmekanismer. Därför kommer detta protokoll att ge utredare ett enklare sätt att få tillgång till hjärt-pericyter från en mer lättillgänglig vävnads källa och främja studier av deras biologi. Det kommer att hjälpa besvara frågor om hur hjärt pericyter bidra till hjärtats homeostas och patofysiologi samt undersöka deras terapeutiska potential.
Den pericytbiologi befolkningen isolerats från murin Heart och kännetecknas av CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ har varit blint flera gånger (upp till P12 och var fortfarande går stark), som inte och sprids snabbt (kompletterande figur 2). Cellerna har också varit cryofrozen och återhämtat sig med minst 95% lönsamhet. Vi föredrar dock att använda celler P7 eller yngre för våra experiment. Jämföra brightfield bilder av våra pericyter med mänskliga hjärnan pericyter, de två cellinjer har jämförbar cellmorfologi (figur 4a) medan de skiljer sig i morfologi från glattmuskelceller (figur 4a). Våra P7 celler präglades av immunocytokemi för pericytbiologi markörer, några från vår FACS panel (NG2 och CD140b), och några inte i panelen (vimentin, desmin, αsma) och vi fann att cellerna uttryckte pericytbiologi markörer likartad (figur 4b). Dessutom analyserades våra P7-celler av flödescytometri igen med samma markör panel för att bedöma förändringar i markör uttryck på grund av passaging och vi fann att det inte fanns några förändringar (figur 4c). Därför, både fenotypiskt och morfologiskt, våra celler är pericyter.
Studierna av Nees et al.10, avolio et al.11, Chen et al.12och Baily et al.13 har visat framgångsrika hjärtpericytisolationer. Men användningen av en egen specialbyggd utrustning för att lossa pericyter från mikrokärlen av Nees et al.10 inblandade två kammare med pumpar som parfymerade proteas lösning fram och tillbaka genom en mesh netto stack, som var svårt att replikera som de gav inte en schematisk och/eller bild av apparaten och hur den byggdes. Även om Nees et al.10 framgångsrikt isolerade hjärt pericyter från många arter, kunde vi aldrig reproducera deras metod. Vår pericytbiologi avlossning steg i vårt protokoll använder helt enkelt en orbital shaker (att separera alla celler) som finns i de flesta, om inte alla laboratorier, med vävnad och enzymlösning i ett koniskt rör följt av en mekanisk dissociation steg. Det finns ingen anpassad apparat som krävs. För det andra omfattar de återstående protokollen användningen av mänskliga vävnader och därför är tillvaratagandet av mänsklig vävnad begränsande för utredarna. Vårt protokoll är en modifiering och optimering av nuvarande protokoll9,12 med hjälp av musmodeller (Wild Type, genetiskt modifierade, sjuka) och material som är lätt tillgängliga för alla utredare.
Eftersom perivaskulära celler i allmänhet är känsliga, är livskraften hos cellerna avgörande för att få en bra avkastning. Vid tillvaratagande av hjärtvävnad och färgning av celler måste vävnaden/cellerna hållas iskall. För det andra kan den enzymatiska nedbrytning av vävnaden kräva optimering på individuell basis. Beroende på aktivitetsenheter på en s flaskor av enzymer, koncentration och matsmältning tid kan behöva optimeras. Se till att den enzymatiska lösningen bereds färsk varje gång annars avkastningen kommer att minska. För det tredje innehåller den råa blandningen många celler, några döda och/eller döende, det är bäst att sänka koncentrationen av FBS i färgbufferten från 5% till 2%. Om du har problem med celler som täpper till munstycket under sortering, berika cellerna först med hjälp av en död cell Removal kit. Du kan också lägga till EDTA/HEPES buffert eller DNase behandling till cellen pre-sort för att förhindra cell clumping. Slutligen, eftersom vår panel av antikroppar är ganska stor och använder många fluoroforer, se till att din FMO kontroller och kompensation kontroller görs på rätt sätt.
En begränsning av denna metod är mängden hjärtrelaterade pericyter som kan erhållas per hjärta. I vårt fall, endast 1,1% av vår råa blandningen från en mus hjärta var pericyter som är jämförbar med den procent i människans hjärta isoleringar, men antalet celler är betydligt mindre på grund av mängden av hjärtvävnad en mus ger. Eftersom start antalet celler är så lågt efter FACS, skulle det vara bättre att isolera från flera hjärtan på en gång. Men problemet med det är det stora antalet celler som du måste sortera igenom på en dag. Om du har mer än 30 000 000 celler, kommer det att bli svårt att få igenom sorteringen utan att påverka livskraften hos cellerna. Om prövaren hade flera cell sorterare, isolerar från flera hjärtan på en dag skulle vara genomförbart. En annan begränsning är att eftersom vi inte vet om det finns subpopulationer av pericyter i hjärtat som det finns skelettmuskulaturen15,16, vi vet inte om vi eliminerar en subtyp i vår gating strategi. Vi är i färd med att karakterisera våra hjärt pericyter och hittills i våra opublicerade data, de är funktionellt som andra pericyter i litteraturen.
Vårt protokoll kommer att göra det möjligt för utredare att besvara frågor om hjärt pericytbiologi egenskaper, egenskaper, funktionalitet och andra aspekter som kommer att bidra till att definiera deras bidrag till hjärt homeostas och hemodynamik. Dessa celler kan ha terapeutisk potential till hjärt-kärlsjukdom när deras biologi är bättre förstådd.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Amgen Flow Cytometry Core för deras hjälp med fluorophore panel design, felsökning och cell sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-053-Cl | dilute with 1x DPBS to get 0.1% |
| 100 μM Cell strainer | FisherSci | 22363549 | |
| 15 mL Falcon conical tubes | BD | 352096 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| 25 G butterfly needle | FisherSci | 22-253-146 | |
| 31 G needle syringe | FisherSci | B328446 | |
| 50 mL Falcon conical tubes | BD | 352098 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb | abcam | ab32575 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD140b rabbit mAb | Cell Signaling | 28E1 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD31 rabbit pAb | abcam | ab28364 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-desmin rabbit pAb | abcam | ab8592 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-NG2 conjugated to AF488 | Millipore | MAB5384A4 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-vimentin rabbit mAb | abcam | ab92547 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| ArC Amine Reactive Compensation bead kit | Invitrogen | A10346 | compensation beads for Live/Dead Near IR dye |
| Brightfield Microscope | camera attached | ||
| CD140b-PE (clone APB5) | eBioscience | 12-1402-81 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD146-BV605 (clone ME-9F1) | BD | 740434 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD31-APC (clone MEC 13.3) | BD | 551262 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD34-BV421 (clone RAM 34) | BD | 56268 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) | BD | 552848 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Centrifuge | eppendorf | ||
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | 0.226 U/mg lyo. |
| Confocal Microscope | |||
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | nuclear stain |
| DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | 500 mL |
| Dowell scissors | FST | 15040-11 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21-030-CV | 500 mL |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) | Corning | 21-031-CV | 500 mL |
| Dumont #5 Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| FACSAria cell sorter | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| FACSAria software | BD | ||
| Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL | BD | 38057 | |
| Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL | BD | 08-771-23 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015-CV | 500 mL |
| Fine scissors | FST | 14060-09 | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | ||
| Fortessa LSR flow cytometer | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| Gelatin-based coating | Cell Biologics | 6950 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Antibody used in ICC 1:1000 dilution |
| Graefe Forceps | FST | 11049-10 | |
| Heparin sodium solution | Hospira | NDC 0409-2720-02 | 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines |
| Incubator | set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 | ||
| Live/Dead-Near IR | Life Technologies | L10119 | |
| Microscope slides | FisherSci | 12-550-343 | |
| NG2-FITC | Millipore | AB5320A4 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Oribital shaker | VWR | Inside 37 °C incubator or room | |
| Paraformaldehyde | FisherSci | 50-980-487 | dilute with 1x DPBS to get 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Petri dish | FisherSci | FB0875714 | |
| Pipette and tips | |||
| ProLong Diamond | ThermoFisher | P36965 | mounting media |
| Propidum Iodide | ThermoFisher | cell viability dye for supplemental figure 2 | |
| Rabbit IgG FITC | eBiosciences | 11-4614-80 | Isotype control antibody - FITC |
| Rat IgG2a APC | Biolegend | 400512 | Isotype control antibody - APC |
| Rat IgG2a BV421 | Biolegend | 400536 | Isotype control antibody - BV421 |
| Rat IgG2a BV605 | BD | 563144 | Isotype control antibody - BV605 |
| Rat IgG2a PE | Biolegend | 400308 | Isotype control antibody - PE |
| Rat IgG2b PE-Cy7 | Biolegend | 400617 | Isotype control antibody - PE-Cy7 |
| SuperBlock | ThermoFisher | 37515 | blocking buffer |
| T75 | ThermoFisher | 156499 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | detergent, dilute with x DPBS to get 0.1% |
| UltraComp beads | Invitrogen | 01-2222-42 | compensation beads |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | FisherSci | 13-876-1 | |
| ViCell Cell counter | Beckman | ||
| Wash buffer | 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS |
References
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C.
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Sengillo, J. D., et al. Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease. Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).
- Avolio, E., Madeddu, P. Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease. Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).
- Dore-Duffy, P. Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes. Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).
- Bryan, B. A., D'Amore, P. A. Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models. Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. Perivascular cells for regenerative medicine. Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Avolio, E., et al. Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease. Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043 (2015).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Baily, J. E., et al. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. Journal of Visualized Experiments. (116), e54252 (2016).
- Murray, I. R., et al. Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
