Summary
Vi har optimeret en protokol til at isolere og rense murine hjerte pericytes for grundforskning og undersøgelse af deres biologi og terapeutiske potentiale.
Abstract
Pericytes, perivaskulære celler af mikrokar og kapillærer, er kendt for at spille en rolle i angiogenese, beholder stabilisering, og endotelens barriere integritet. Men, deres vævs-specifikke funktioner i hjertet er ikke godt forstået. Desuden er der i øjeblikket ingen protokol udnytter let tilgængelige materialer til at isolere og rense pericytes af hjertets oprindelse. Vores protokol fokuserer på at bruge den udbredte pattedyr model, musen, som vores kilde til celler. Ved hjælp af enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation af hjernevæv, fik vi en rå celle blanding, der blev yderligere renset ved fluorescens aktivering celle sortering (FACER) af en overflod af markører. Fordi der ikke er nogen enkelt entydig markør for pericytes, vi gated for celler, der var CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Efter rensning blev disse primære celler dyrket og urerne flere gange uden ændringer i morfologi og markør udtryk. Med evnen til regelmæssigt at få primær murine hjerte pericytes ved hjælp af vores protokol, vi håber at yderligere at forstå rollen af pericytes i hjerte-kar-fysiologi og deres terapeutiske potentiale.
Introduction
Perivaskulære celler kendt som pericytes omgiver mikroskibene og kapillærer af det vaskulære træ1,2. Fysiologisk, de er kendt for at fremme og spille en rolle i angiogenese, øge barriere integritet på grund af deres tætte forhold til endotelceller samt stabilisere og modne fartøjer1,2. Desuden, dysfunktion og/eller tab af disse celler har været impliceret i sygdomme som Alzheimers sygdom2,3 og forskellige hjerte-kar-sygdomme4. Disse celler findes i hele kroppen, men celle numrene er vævs afhængige. Pericytes har især været undersøgt i hjernen på grund af høj vaskularisering af blod-hjerne barrieren1,2. Men i hjertet, biologi af pericytes er undersøgt.
For nylig er der øgede interesser i marken for hjerte pericytes, men der er i øjeblikket ingen strømlinet protokol til rådighed for deres isolation fra en af de mest anvendte værktøjer i biologi-musen. Der er protokoller i litteraturen om isolerende pericytes fra hjernen5, Retina6, placenta7, og skeletmuskulatur8,9; Men, få protokoller er på isolerende pericytes fra hjertet. Der er flere grupper, der har isolerede hjerte pericytes. NeeS et al. var i stand til at isolere en rigelig mængde af hjerte pericytes fra flere arter, herunder musen; Hvordan end, deres metoder anvendte specifik i-hus bygget udstyr hvilke aftager reproducerbarhed10. Avolio et al.11, Chen et al.12, og Baily et al.13 også med succes isoleret hjertepericytes fra humant hjerte væv, men humane væv er ikke altid til rådighed og svært at opnå for nogle efterforskere. Her har vi udviklet en isolationsmetode til at opnå kardiale pericytes fra musemodeller for undersøgere til yderligere at studere deres biologi med let tilgængelige materialer.
Ved hjælp af enzymatisk fordøjelse og fluorescens aktiveret celle sortering (FACER) med kendte nøgle pericyte markører14, vores protokol giver os mulighed for at isolere og rense en population af pericytes, der er karakteriseret ved CD31-CD34-CD45- CD140b+NG2+CD146+. Vores panel af markører indeholder både inklusion og udelukkelse markører. CD45 bruges som en markør til at udelukke hæmatopoietiske celler. CD31 bruges som en markør til at udelukke endotelceller. CD34 bruges som en markør til at udelukke både hæmatopoietiske og endotelprogenitorceller. CD146 er en markør for perivaskulære celler. Endelig, NG2 og CD140b (også kendt som trombocytafledt vækstfaktor receptor beta — PDGFRβ) er begge accepterede markører for pericytes14. Den primære kultur opnået kan dyrkes og urerne flere gange uden ændringer i morfologi eller markør udtryk. Desuden kan disse celler være co-dyrket med endotelceller til at studere deres interaktioner og krydstale med hinanden. Denne celle isolationsmetode vil gøre det muligt for undersøgere at studere biologi og Patofysiologi af hjerte pericytes fra vildtype, sygdom og genetisk variant musemodeller.
Protocol
Alle dyr blev opstaldet og anvendt i en forening for vurdering og akkreditering af laboratorium Animal Care International (AAALAC) akkrediteret facilitet og alt animalsk arbejde blev udført under passende veterinærtilsyn og under den institutionelle Animal Udvalget for pleje og anvendelse (IACUC) godkendt protokol af Amgen Inc.
1. forberedelse af værktøjer og kultur medier
- Autoklave kirurgisk 9 cm lige spids fin punkt saks og 10 cm vinklet forceps.
- Der tilsættes 25 mL 5% føtal bovint serum (FBS) og 5 mL 1% penicillin streptomycin (P/S) til en 500 mL flaske calciummagnesiumfri Dulbecco's fosfat-bufferet saltvand (CMF-DPBS). Placer opløsningen i et isbad for at sikre, at den bliver kold på tidspunktet for brug. Aliquot 50 mL til et 50 mL konisk rør til hjerte isolering. Tilsæt 250 enheder/mL heparin natrium opløsning til 50 mL alikvot. Dette vil blive omtalt som hepariniseret CMF-dpbs.
- Der tilsættes 20% FBS (100 mL) og 1% P/S (5 mL) til en 500 mL flaske med høj glukose Dulbecco's modificerede ørne medium (DMEM). Dette vil blive omtalt som det enzym frie kultur medie. Aliquot 20 ml DMEM + 20% FBS + 1% P/s og tilsæt 500 μg/ml kollagenase B. Dette vil blive omtalt som enzymopløsningen. Hold både det enzym frie dyrkningsmedie og enzymopløsningen varm ved 37 °C i en inkubator eller et vandbad.
2. klargøring af dyr og udtagning af hjertevæv
- Intraperitonealt injicerer en mus med 250 enheder heparin natrium opløsning med en 31 G kanyle sprøjte. Vent derefter 10 − 15 minutter, mens musen forbliver aktiv i sit hjem bur.
Bemærk: Repræsentative data i dette studie blev indhentet fra en 4 måneder gammel mandlig C57BL/6 mus. Men, denne protokol kan bruges på enhver mus uanset stamme, alder, køn, vægt, osv. - Anæstetize musen med 5% isofluran. Kontroller anæstesi dybden af musen ved knibning refleks.
- Placer den bedøvede mus i liggende position og tape ned sine forbimbs. Åbn forsigtigt brysthulen og kanyle den faldende aorta ved hjælp af en 25 G Butterfly nål.
- Lav et nick i det højre atrium og perfuse hjertet med mindst 20 ml 250 enheder/ml hepariniseret CMF-dpbs ved 2 ml/min med en variabel-flow peristaltisk pumpe. Når PBS kommer ud af højre Atria ren, perfusion er komplet.
- Skær hjertet ud på aorta og Placer det i iskold CMF-DPBS.
3. dissociation af hjernevæv
- Overfør hjertet til en Petri skål på 15 cm x 15 cm. Skær hjertet i små stykker (1 mm/stykke) ved hjælp af fjeder saks og fine punkt pincet med nok enzym opløsning til at dække brikkerne (10 − 15 mL).
- Stykkerne og opløsningen overføres til et 50 mL konisk rør, tætning med paraffin plastfolie og Inkubér ved 37 °C på en orbital shaker ved 120 rpm i 75 min.
- Efter kollagenase fordøjelse med enzymopløsningen, dekanteres væsken gennem en 100 μm celle si i en ny 50 ml rør, men lad nok opløsning til at sikre, at brikkerne ikke tørrer ud.
- Ved hjælp af fine punkt pincet, tage vævet ud af røret og placere et par stykker på et mikroskop slide. Derefter male vævet mellem to mikroskopdias til at bryde op vævet. Skyl gliderne med enzym frie dyrkningsmedier i et nyt 50 mL konisk rør.
- Gentag trin 3,4, indtil alle Vævsstykker er dissocierede.
- Kombinér løsningerne fra trin 3.3 − 3.5 til ét rør. Træk den resulterende suspension gennem en 100 μm cellefilter i et nyt 50 mL konisk rør.
- Centrifugeres ved 220 x g, 4 °c, i 5 min. Aspirér fra tidligere opløsning, og resuspender forsigtigt celle pellet i friske enzym frie kultur medier.
- Tæl celler og kontrollere levedygtighed ved hjælp af en celle tæller. Cellerne fortyndes til 1 x 106/ml med kold FACS farvnings buffer indeholdende 500 ml dpbs og 10 − 25 ml 2 − 5% bovint serumalbumin (BSA). Cellerne er klar til at blive plettet og sorteret.
4. rensning af Pericytes fra rå celle blanding ved hjælp af FACS
- Forbered og mærk 5 mL FACS-rør til alle betjenings-og celleprøver. Alikvot celler (1 mL celler pr. rør) til en uforfarvet prøve, fluorescens minus en (FMO) kontrol og isotype matchede kontroller. Brug de resterende celler til sorteringen. Alle betjeningselementer og prøver kan tilberedes og farves på samme tid.
Bemærk:I alt 13 mL ved 0,5 x 106celler/mL blev brugt til den repræsentative slags fra ét hjerte. Men lydstyrken afhænger af, hvor mange celler investigator opnår fra deres isolation, hvor mange hjerter de bruger, og hvor godt hjertevævet er fordøjet; størrelsen af hvert hjerte er også en variabel, der kan ændre lydstyrken.- Brug kompensation perler (tabel af materialer) til at optimere fluorescens kompensation kontrol. Forbered én kompensations kontrol for hvert vha i forsøget i et mærket 5 ml FACS-rør. Til dette eksperiment, forberede i alt 9 kompensation kontrol-2 slags unstained perler plus 7 forskellige fluorchromes fra markør panelet herunder NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, og cellelevedygtighed-APC-Cy7 ( Tabel over materialer).
- Tilsæt en dråbe af kompensation perler (~ 50 μL) fra klemme hætteglasset til hvert rør. Tilsæt derefter 1 μL antistof til perlerne. Gentag for hvert antistof fra markør panelet. Bland kraftigt ved puls-vortexing. Inkuber i 30 min ved 4 °C beskyttet mod lys, bortset fra cellernes levedygtighed perler, der kan efterlades ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- Tilsæt derefter 3 mL FACS-farvnings buffer til hvert rør, og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Aspirér off opløsning og resuspension hver perle pellet i 400 μL FACS farvnings buffer. Kompensations kontrollerne er klar til brug. Hold på is.
- Brug FMO-kontrolelementer til at optimere baggrunds farvning på grund af spektral overlap.
- FMO-kontrolelementerne forberedes ved hjælp af 1 mL celler, der blev aliciteret fra afsnit 4,1 i et 5 mL FACS-rør, og som tilføjede alle antistoffer fra markeringspanelet beskrevet i trin 4.1.1 ved en 1:100-fortynding, men bortset fra ét antistof. For eksempel, forberede en NG2-AF488 FMO ved at medtage antistoffer for CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, cellelevedygtighed farvestof, men ikke NG2-AF488 antistof. Bland forsigtigt ved puls-vortexing. Gentag for hvert antistof for i alt 7 kontroller. Inkuber i 30 min ved 4 °C beskyttet mod lys.
- Tilsæt derefter 3 mL FACS-farvnings buffer til hvert rør, og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Aspirér off opløsning og resuspension hver celle pellet i 400 μL FACS farvnings buffer. FMO-kontrollerne er klar til brug. Hold på is.
- Brug isotype matchede kontrol antistoffer (tabel over materialer) til ikke-specifik farvning.
- Isotype-kontrollerne forberedes ved at tilføje det isotype matchede kontrol antistof (tabel over materialer) til 1 ml celleprøve, der er fremstillet af punkt 4,1 ved en 1:100 fortynding hver i et 5 ml FACS-rør. Bland forsigtigt ved puls-vortexing. Inkuber i 30 min ved 4 °C beskyttet mod lys.
- Tilsæt derefter 3 mL FACS-farvnings buffer til hvert rør, og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Aspirér off opløsning og resuspension hver celle pellet i 400 μL FACS farvnings buffer. Isotype-kontrollerne er klar til brug. Hold på is.
- Forbered celler, der skal sorteres ved at tilføje antistof cocktail til frisk isolerede celler.
- Forbered celleprøve fra afsnit 4,1 ved at tilføje i en antistof cocktail indeholdende anti-Mouse NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 ved 1:100 fortynding hver og cellelevedygtighed farvestof ved 1:1000 fortynding. Forsigtigt vortex at blande. Inkubere prøver ved 4 °C i 30 min. beskyttet mod lys.
- Efter farvning vaskes cellerne med FACS-farvnings buffer ved centrifugering ved 300 x g i 5 min. 4 °c. Aspirér off opløsning og resuspension celle pellet i FACS farvning buffer til 0,5 x 106 celler/ml.
- Brug nye FACS rør, der har 35 μm filter toppe, pipette farvede celleprøver på låsene og tyngdekraften filtrat for at opnå enkelt celle suspensioner. Hold på is.
- Brug kompensation perler (tabel af materialer) til at optimere fluorescens kompensation kontrol. Forbered én kompensations kontrol for hvert vha i forsøget i et mærket 5 ml FACS-rør. Til dette eksperiment, forberede i alt 9 kompensation kontrol-2 slags unstained perler plus 7 forskellige fluorchromes fra markør panelet herunder NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, og cellelevedygtighed-APC-Cy7 ( Tabel over materialer).
- Brug en celle sortering til at rense cellerne.
- Kør de ufarvede celler på celle sorteringen for at indstille spændinger og korrigere for baggrunds signalet (f. eks. indstille spændinger for fremad spredning til 490 − 560 og til side scatter til 180 − 250).
- Kør hver enkelt farve kompensation perle prøve en ad gangen for at justere spændinger for hver kanal og justere portene for det positive signal. Indsamle data. Brug softwaren til at beregne for spektral overlap ved beregning af kompensations matrixen. Alle spændinger er klar og indstillet.
- Kør hvert isotype-kontrolelement én ad gangen, og disse data kan bruges til at justere portene for uspecifik binding, hvis der er nogen.
- Kør hver FMO-prøve én ad gangen, og Juster spændinger for hver kanal for at korrigere for spektral beskæring på grund af et panel med flere farver.
- Kør de farvede celleprøver i celle sorteringen og saml cellerne i 10 mL enzym frie dyrkningsmedier (DMEM + 20% FBS + 1% P/S) i et 15 mL konisk opsamlings glas. Brug følgende gating strategi: Gate for enkeltceller, gate for levende celler, gate for CD45 negative celler, gate for CD34 og CD31 negative celler, gate for NG2 positive celler, og endelig Gate for CD146 og CD140b positive celler.
5. dyrkning af Pericytes
- Coat en 24-brønd plade med 0,2% gelatine i 5 min og aspirat off gelatineopløsning. Frø frisk fremstillede celler fra trin 4.2.5 i DMEM + 20% FBS + 1% P/S op til 2 x 104 celler/cm2. Dyrknings celler i en celle inkubator sat til 37 °C, 5% CO2 og 95% O2.
- Passaging af pericytes
- Når cellerne er 95% konflydende, vask celler med varm 1x DPBS, og løft celler med 200 μL af 0,1% trypsin i hver brønd ved stuetemperatur i 3 − 5 min.
- Tryk forsigtigt pladen for at løsne cellerne.
- Neutraliserer trypsin med 3,5 x mængden af kultur medier (700 μL DMEM + 20% FBS + 1% P/S) og Seed passage to (P2) celler på en ubestrøget 6-brønd plade ved 2 x 104 celler/cm2.
- Hver brønd, når confluent, kan flyttes til en enkelt T-75 kolbe som P3 celler, som derefter kan opdeles på en 1:6 ratio.
6. karakterisering af Pericytes
-
Analyse af strømnings cytometri
- Brug den samme FACS-farvnings protokol og gating-strategi som tidligere beskrevet i afsnit 4.
- Kør kontrol og farvede prøver på flow cytometer. Indsaml data, og analysér data ved hjælp af analysesoftwaren (tabel over materialer).
- For at indsamle lysfelt-billeder skal du dyrke celler i en kolbe i en celle inkubator, der er indstillet til 37 °c, 5% Co2 og 95% O2. Optag billeder på et mikroskop efter celler, der er fastgøres til overfladen.
-
Immuncytokemi
- Vokse celler i en 96-brønd plade indtil 90% confluent. Vask celler med varm 1x DPBS og Fix med 4% PARAFORMALDEHYD i 30 min ved stuetemperatur.
- Vask cellerne 3x med 1x DPBS og permeabilize med 0,1% vaskemiddel i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber celler med blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur. Efter blokering tilsættes primære antistoffer (et antistof pr. brønd) 1:100 i blokerende buffer og inkubates ved 4 °C natten over. Primære antistoffer er: anti-NG2, anti-CD140b, anti-CD31, anti-vimentin, anti-desmin, og anti-Alpha glat muskel actin.
- Næste dag, vaske celler 3x med vask buffer (tabel over materialer). Tilsæt sekundært antistof fortyndet 1:1000 i blokerende buffer og Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur i mørke. Sekundært antistof er en anti-kanin konjugeret til FITC.
- Vask cellerne 3x med vaskebuffer. Tilsæt 300 μM nuklear pletter fortyndet ved 1:1000 for 5 min ved stuetemperatur.
- Vask cellerne 3x med 1x DPBS og monter med monterings medie.
- Billed celler med et Konfokal mikroskop.
Representative Results
Efter enzymatisk fordøjelse og dissociation af hele hjertet og før FACS rensning af cellerne er cellerne en rå blanding, der indeholder mange forskellige celletyper fra hjertet (figur 1a). Efter FACS rensning og dyrkning er cellerne homogene. De er enkelt nucleated, ganske flad, og har den typiske pericyte rhomboideus morfologi (figur 1b).
Ved hjælp af FACS renses cellerne til homogenien. Den ufarvede kontrol celleprøve bruges til at vise gating strategi (figur 2). For det første blev vragdele og form gated ud baseret på fremad og side scatter distributioner. Så døde celler blev gated ud på grund af deres Amin reaktion med farvestoffet, som producerer et signal større og mere intens end levende celler. Af levende celler, hæmatopoietiske celler blev gated ud ved at være CD45+. For yderligere at fjerne hæmatopoietiske og endoteliale celler, CD34+ og CD31+ celler blev gated out. Endelig blev NG2+ og CD140b+/cd146+ celler udvalgt til at være perivaskulære celler med ekspression af typiske pericyte markører (figur 3). Markeringspanelet blev også testet på mus koronare endotelceller som en kontrol (supplerende figur 1). Kun omkring 1% af rå celle blandingen bestod af pericytes efter sortering.
For at validere, at cellerne faktisk var pericytes, vi urerne cellerne for yderligere karakterisering. Cellerne voksede hurtigt, når de nåede P3 i T-75-kolberne uden ændringer i levedygtigheden, da de blev ældre (supplerende figur 2). Sammenlignet med menneskelige hjerne pericytes, cellerne havde en lignende morfologi (figur 4a). Sammenlignet med mus og humane glatte muskelceller, cellerne havde en anden morfologi (figur 4a). Der blev heller ikke observeret ændringer i morfologi eller markør udtryk ved P7 ved immun plettet eller ved flowcytometri-analyse efter passaging (figur 4b,C).
Figur 1 : Rå celler versus rensede celler. A) det lysfelt-billede af råcelle blandingen post hele hjertets enzymatiske fordøjelse og dissociation, som er blevet dyrket i en T25-kolbe i 14 dage. B) det lysfelt-billede af en homogen population af kardiale pericytes efter sortering og kulturering i 14 dage. Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentative billeder af FACS analyse af ufarvede celler. Skematisk repræsentation af gating strategi bruges til at rense rå celle blanding. Gate for celler, der er single, Live,CD45-,CD31-, CD34-, NG2+, CD146+og CD140b+. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentative billeder af FACS analyse af rå celler. Skematisk gengivelse af den sortering, der anvendes til at opnå en homogen population af kardiale pericytes. Ca. 1% af råcellerne er CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Karakterisering af primære isolerede kardiale pericytes (A) brightfield billeder af dyrkede celler fra menneskelig hjerne (hPC) og muse hjerter (MPC) viser lignende pericyte celle morfologi, men forskellige morfologi fra humane glatte muskelceller hSMC) og mus glatte muskelceller (MSMC). Scale bar = 100 μm.B) fænotypiske karakterisering af celler på P7 ved immunocytokemi for pericyte markører. Scale bar = 100 μm.C) analyse ved flowcytometri af pericytes på P7, hvor de blev gated for negative markører CD31, CD34, CD45 og positive markører NG2, CD140b, og CD146. Befolkningen forbliver homogen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: repræsentative billeder af flow cytometri analyse af endotelceller ved hjælp af markør panel. En mus koronar endotel cellelinje blev brugt som kontrol for den bindende specificitet for markører. Ved hjælp af den samme gating strategi, der blev brugt i den slags, bortset fra en positiv Gate for CD31 i stedet for en negativ port, de endotelceller var negative for CD45, CD34, NG2, CD140b, og CD146 men positiv for CD31 som forventet. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: repræsentative billeder af flow cytometri analyse af forskellige passager i MPC. Primære isolerede hjerte pericytes blev dyrket og urerne op til passage 12. Celler blev plettet med propidium kaliumiodid og analyseret på et flow cytometer. Kontrol population er en blanding af døde celler og levende celler. Der var ingen signifikante forskelle i antallet af levedygtige celler mellem passager. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Discussion
Da undersøgelser af kardiale pericytes er relativt nye, rollen af pericytes i kardiovaskulær fysiologi og patofysiologi er endnu ikke defineret. I andre organer har de vist sig at spille en central rolle i fartøjs homøostase og perfusion1,2. Sammenlignet med litteraturen af pericytes fra andre organer såsom hjernen, der er betydeligt færre publikationer om hjertets pericytes. Isolationen af hjerte pericytes er afgørende for forståelsen af deres funktionelle egenskaber og signalerings mekanismer. Derfor vil denne protokol give efterforskere en lettere måde at få adgang til hjertepericytes fra en mere let tilgængelig vævs kilde og fremme undersøgelser af deres biologi. Det vil hjælpe med at besvare spørgsmål om, hvordan hjertepericytes bidrage til hjertehomøostase og patofysiologi samt undersøge deres terapeutiske potentiale.
Den pericyte befolkning isoleret fra murine hjerte og karakteriseret ved CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ er blevet urerne flere gange (op til P12 og var stadig i gang stærk), som ikke rentabilitet og udbrede hurtigt (supplerende figur 2). Cellerne har også været cryofrozen og genvundet med mindst 95% levedygtighed. Men vi foretrækker at bruge celler P7 eller yngre til vores eksperimenter. Sammenligne lysfelt billeder af vores pericytes med menneskelig hjerne pericytes, de to cellelinjer har sammenlignelige celle morfologi (figur 4a), mens de adskiller sig i morfologi fra glatte muskelceller (figur 4a). Vores P7 celler var karakteriseret ved immuncytokemi for pericyte markører, nogle fra vores FACS panel (NG2 og CD140b), og et par ikke i panelet (vimentin, desmin, αsma) og vi fandt, at cellerne udtrykte pericyte markører homogen (figur 4b). Derudover blev vores P7-celler analyseret ved flow cytometri igen med det samme markør panel for at vurdere ændringer i markør udtryk på grund af passaging, og vi konstaterede, at der ikke var nogen ændringer (figur 4c). Derfor, både phenotypisk og morfologisk, vores celler er pericytes.
Studierne af NeeS et al.10, avolio et al.11, Chen et al.12, og Baily et al.13 har vist succesfuld kardiel pericyte isoleringer. Men brugen af en in-House specialbygget udstyr til at løsne pericytes fra mikroskibene af NeeS et al.10 involveret to kamre med pumper, der perfektionerede proteaseopløsning frem og tilbage gennem en mesh net stak, som var svært at replikere, da de gav ikke en skematisk og/eller billede af apparatet, og hvordan det blev bygget. Selv om NeeS et al.10 held isoleret hjerte pericytes fra mange arter, vi var aldrig i stand til at reproducere deres metode. Vores pericyte løsrivelse skridt i vores protokol blot bruger en orbital shaker (at adskille alle celler), som er tilgængelig i de fleste, hvis ikke alle laboratorier, med væv og enzym opløsning i en konisk rør efterfulgt af en mekanisk dissociation trin. Der kræves ikke noget brugerdefineret apparat. For det andet involverer de resterende protokoller brugen af humane væv, og derfor begrænser indkøbere af humant væv til undersøgere. Vores protokol er en modifikation og optimering af de nuværende protokoller9,12 ved hjælp af musemodeller (vildtype, genetisk modificeret, syge) og materialer, der er let tilgængelige for alle efterforskere.
Fordi perivaskulære celler generelt er følsomme, er levedygtigheden af cellerne afgørende for at opnå et godt udbytte. Under udtagning af hjertevæv og farvning af celler, væv/celler skal holdes iskold. For det andet kan enzymatisk fordøjelse af vævet kræve optimering på individuel basis. Afhængigt af de enheder af aktivitet på ens hætteglas af enzymer, koncentration og fordøjelsestid kan være nødvendigt at være optimeret. Sørg for, at den enzymatiske opløsning tilberedes frisk, hver gang ellers udbyttet vil falde. For det tredje, den rå blanding indeholder en masse celler, nogle døde og/eller døende, er det bedst at sænke koncentrationen af FBS i farvnings bufferen fra 5% til 2%. Hvis du har problemer med celler tilstopning dysen under sortering, berige cellerne først ved hjælp af en død celle fjernelse kit. Du kan også tilføje EDTA/HEPES buffer eller DNase behandling til cellen pre-sortering for at forhindre celle clumping. Endelig, fordi vores panel af antistoffer er temmelig stor og bruger mange fluorophorer, være sikker på din FMO kontrol og kompensation kontrol er gjort korrekt.
En begrænsning til denne metode er mængden af hjerte pericytes, der kan opnås pr hjerte. I vores tilfælde, kun 1,1% af vores rå blanding fra et muse hjerte var pericytes, som er sammenlignelig med den procent i det menneskelige hjerte isoleringer, men antallet af celler er betydeligt mindre på grund af mængden af hjernevæv en mus giver. Fordi startantallet af celler er så lavt efter FACS, ville det være bedre at isolere fra flere hjerter på én gang. Men problemet med det er det blotte antal celler, du skal sortere igennem på en dag. Hvis du har mere end 30.000.000 celler, vil det være svært at komme igennem den slags uden at påvirke levedygtigheden af cellerne. Hvis investigator havde flere celle sortere, ville det være muligt at isolere fra flere hjerter på en dag. En anden begrænsning er, at fordi vi ikke ved, om der er subpopulationer af pericytes i hjertet ligesom der er skeletmuskulatur15,16, vi ved ikke, om vi er at eliminere en subtype i vores gating strategi. Vi er i færd med at karakterisere vores hjerte pericytes og hidtil i vores ikke-offentliggjorte data, de er funktionelt som andre pericytes i litteraturen.
Vores protokol vil gøre det muligt for undersøgere at besvare spørgsmål om hjertets pericyte egenskaber, egenskaber, funktionalitet, og andre aspekter, der vil hjælpe med at definere deres bidrag til hjertets homøostase og Hæmodynamik. Disse celler kan have terapeutisk potentiale til hjerte-kar-sygdom, når deres biologi er bedre forstået.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Amgen flow cytometry Core for deres hjælp med fluoroforet panel design, fejlfinding og celle sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-053-Cl | dilute with 1x DPBS to get 0.1% |
| 100 μM Cell strainer | FisherSci | 22363549 | |
| 15 mL Falcon conical tubes | BD | 352096 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| 25 G butterfly needle | FisherSci | 22-253-146 | |
| 31 G needle syringe | FisherSci | B328446 | |
| 50 mL Falcon conical tubes | BD | 352098 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb | abcam | ab32575 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD140b rabbit mAb | Cell Signaling | 28E1 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD31 rabbit pAb | abcam | ab28364 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-desmin rabbit pAb | abcam | ab8592 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-NG2 conjugated to AF488 | Millipore | MAB5384A4 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-vimentin rabbit mAb | abcam | ab92547 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| ArC Amine Reactive Compensation bead kit | Invitrogen | A10346 | compensation beads for Live/Dead Near IR dye |
| Brightfield Microscope | camera attached | ||
| CD140b-PE (clone APB5) | eBioscience | 12-1402-81 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD146-BV605 (clone ME-9F1) | BD | 740434 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD31-APC (clone MEC 13.3) | BD | 551262 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD34-BV421 (clone RAM 34) | BD | 56268 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) | BD | 552848 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Centrifuge | eppendorf | ||
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | 0.226 U/mg lyo. |
| Confocal Microscope | |||
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | nuclear stain |
| DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | 500 mL |
| Dowell scissors | FST | 15040-11 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21-030-CV | 500 mL |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) | Corning | 21-031-CV | 500 mL |
| Dumont #5 Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| FACSAria cell sorter | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| FACSAria software | BD | ||
| Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL | BD | 38057 | |
| Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL | BD | 08-771-23 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015-CV | 500 mL |
| Fine scissors | FST | 14060-09 | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | ||
| Fortessa LSR flow cytometer | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| Gelatin-based coating | Cell Biologics | 6950 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Antibody used in ICC 1:1000 dilution |
| Graefe Forceps | FST | 11049-10 | |
| Heparin sodium solution | Hospira | NDC 0409-2720-02 | 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines |
| Incubator | set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 | ||
| Live/Dead-Near IR | Life Technologies | L10119 | |
| Microscope slides | FisherSci | 12-550-343 | |
| NG2-FITC | Millipore | AB5320A4 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Oribital shaker | VWR | Inside 37 °C incubator or room | |
| Paraformaldehyde | FisherSci | 50-980-487 | dilute with 1x DPBS to get 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Petri dish | FisherSci | FB0875714 | |
| Pipette and tips | |||
| ProLong Diamond | ThermoFisher | P36965 | mounting media |
| Propidum Iodide | ThermoFisher | cell viability dye for supplemental figure 2 | |
| Rabbit IgG FITC | eBiosciences | 11-4614-80 | Isotype control antibody - FITC |
| Rat IgG2a APC | Biolegend | 400512 | Isotype control antibody - APC |
| Rat IgG2a BV421 | Biolegend | 400536 | Isotype control antibody - BV421 |
| Rat IgG2a BV605 | BD | 563144 | Isotype control antibody - BV605 |
| Rat IgG2a PE | Biolegend | 400308 | Isotype control antibody - PE |
| Rat IgG2b PE-Cy7 | Biolegend | 400617 | Isotype control antibody - PE-Cy7 |
| SuperBlock | ThermoFisher | 37515 | blocking buffer |
| T75 | ThermoFisher | 156499 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | detergent, dilute with x DPBS to get 0.1% |
| UltraComp beads | Invitrogen | 01-2222-42 | compensation beads |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | FisherSci | 13-876-1 | |
| ViCell Cell counter | Beckman | ||
| Wash buffer | 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS |
References
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C.
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Sengillo, J. D., et al. Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease. Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).
- Avolio, E., Madeddu, P. Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease. Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).
- Dore-Duffy, P. Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes. Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).
- Bryan, B. A., D'Amore, P. A. Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models. Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. Perivascular cells for regenerative medicine. Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Avolio, E., et al. Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease. Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043 (2015).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Baily, J. E., et al. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. Journal of Visualized Experiments. (116), e54252 (2016).
- Murray, I. R., et al. Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
