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Medicine

यूरीन कार्डिएक पेरिसाइट्स का अलगाव और शुद्धि

Published: August 16, 2019 doi: 10.3791/59571
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cardiometabolic Disorders, Amgen Research and Discovery, Amgen Inc., 2Department of Translational Sciences, Amgen Research and Discovery, Amgen Inc.

Summary

हम अलग और बुनियादी अनुसंधान और उनके जीव विज्ञान और चिकित्सीय क्षमता की जांच के लिए murine कार्डियक pericytes शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है.

Abstract

पेरिसाइट्स, माइक्रोवेअर्स और केशिकाओं की पेरिवास्कुलर कोशिकाओं, एंजियोजेनेसिस, पोत स्थिरीकरण, और एंडोथेलियल बाधा अखंडता में एक भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। हालांकि, दिल में उनके ऊतक-विशिष्ट कार्य ों को अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है। इसके अलावा, वर्तमान में हृदय मूल के pericytes को अलग और शुद्ध करने के लिए आसानी से सुलभ सामग्री का उपयोग कोई प्रोटोकॉल है. हमारे प्रोटोकॉल व्यापक रूप से इस्तेमाल किया स्तनधारी मॉडल का उपयोग करने पर केंद्रित है, माउस, कोशिकाओं के हमारे स्रोत के रूप में. हृदय ऊतक के एंजाइमी पाचन और यांत्रिक वियोजन का उपयोग करके, हमने एक कच्चे सेल मिश्रण को प्राप्त किया जो कि मार्कर ों की एक बहुतायत द्वारा सेल छँटाई (FACS) को सक्रिय करने वाले फ्लोरोसेंट द्वारा और अधिक शुद्ध किया गया था। क्योंकि pericytes के लिए कोई एकल स्पष्ट मार्कर है, हम कोशिकाओं है कि CD31 थे के लिए gated-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. शुद्धि के बाद, इन प्राथमिक कोशिकाओं को सुसंस्कृत और आकृति विज्ञान और मार्कर अभिव्यक्ति में किसी भी परिवर्तन के बिना कई बार पारित किया गया. नियमित रूप से हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग प्राथमिक murine हृदय pericytes प्राप्त करने की क्षमता के साथ, हम आगे हृदय शरीर क्रिया विज्ञान और उनकी चिकित्सीय क्षमता में pericytes की भूमिका को समझने की उम्मीद है.

Introduction

पेरिवास्कुलर कोशिकाएं जिन्हें पेरिसाइट्स के रूप में जाना जाता है , संवहनी वृक्ष1,2के माइक्रोवेअर्स और केशिकाओं को घेरे हुए हैं . शारीरिक रूप से, वे एंजियोजेनेसिस में एक भूमिका निभाने के लिए जाने जाते हैं, एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ अपने घनिष्ठ संबंध के कारण बाधा अखंडता को बढ़ाते हैं और साथ ही स्थिर और परिपक्व वाहिकाओं1,2। इसके अलावा, इन कोशिकाओं के रोग और/या हानि अल्जाइमर रोग2,3 और विभिन्न हृदय रोगों4जैसे रोगों में फंसाया गया है . इन कोशिकाओं को पूरे शरीर में पाए जाते हैं, लेकिन सेल संख्या ऊतक पर निर्भर हैं. रक्त मस्तिष्क अवरोध1,2के उच्च संवहनी के कारण मस्तिष्क में पेरिसाइट्स का सबसे विशेष अध्ययन किया गया है . हालांकि, दिल में, pericytes के जीव विज्ञान understudied है.

हाल ही में, वहाँ हृदय pericytes के लिए क्षेत्र में रुचिमें वृद्धि हुई है, लेकिन वर्तमान में कोई सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल जीव विज्ञान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया उपकरणों में से एक से उनके अलगाव के लिए उपलब्ध है - माउस. मस्तिष्क से पेरिसाइट्स को अलग करने पर साहित्य में प्रोटोकॉल हैं5, रेटिना6, प्लेसेंटा7, और कंकाल की मांसपेशी8,9; हालांकि, कुछ प्रोटोकॉल दिल से pericytes अलग पर हैं. वहाँ कई समूहों है कि अलग हृदय pericytes है. Nees एट अल माउस सहित कई प्रजातियों से कार्डियक pericytes की एक प्रचुर मात्रा को अलग करने में सक्षम थे; हालांकि, उनके तरीकों विशिष्ट घर में निर्मित उपकरण है जो reproducibility10कम हो जाती है इस्तेमाल किया. Avolio एट अल11, चेन एट अल12, और बेली एट अल13 भी सफलतापूर्वक मानव हृदय ऊतक से हृदय pericytes अलग है, लेकिन मानव ऊतकों हमेशा उपलब्ध नहीं हैं और कुछ जांचकर्ताओं के लिए प्राप्त करने के लिए मुश्किल. यहाँ, हम जांचकर्ताओं के लिए माउस मॉडल से कार्डियक pericytes प्राप्त करने के लिए एक अलगाव विधि विकसित की है आगे आसानी से उपलब्ध सामग्री के साथ उनके जीव विज्ञान का अध्ययन.

एंजाइमी पाचन और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) ज्ञात कुंजी pericyte मार्करों14के साथ का उपयोग करना, हमारे प्रोटोकॉल हमें अलग करने और pericytes कि CD31 की विशेषता है की एक आबादी को शुद्ध करने की अनुमति देता है-CD34 - CD45-CD45- CD140b+NG2+CD146+| मार्करों के हमारे पैनल दोनों शामिल किए जाने और बहिष्करण मार्कर होते हैं. CD45 हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को बाहर करने के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है। CD31 endothelial कोशिकाओं को बाहर करने के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है. CD34 एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है दोनों hematopoietic और endothelial जनक कोशिकाओं को बाहर करने के लिए. CD146 perivascular कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है. अंत में, NG2 और CD140b (भी प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर बीटा के रूप में जाना जाता है [ PDGF] ) दोनों pericytes के लिए मार्कर स्वीकार किए जाते हैं14. प्राप्त प्राथमिक संस्कृति सुसंस्कृत और आकृति विज्ञान या मार्कर अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन के साथ कई बार पारित किया जा सकता है. इसके अलावा, इन कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ उनकी बातचीत और crosstalk का अध्ययन करने के लिए endothelial कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृत किया जा सकता है। इस सेल अलगाव विधि जांचकर्ताओं जीव विज्ञान और जंगली प्रकार से हृदय pericytes के pathophysiology अध्ययन करने की अनुमति देगा, रोग, और आनुवंशिक रूप से संस्करण माउस मॉडल.

Protocol

सभी जानवरों को रखा और मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल इंटरनेशनल (AAALAC) मान्यता प्राप्त सुविधा के प्रत्यायन के लिए एक एसोसिएशन में इस्तेमाल किया गया था और सभी पशु काम उचित पशु चिकित्सा निरीक्षण के तहत और संस्थागत पशु के तहत आयोजित किया गया देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) Amgen इंक के प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी

1. उपकरण और संस्कृति मीडिया की तैयारी

  1. ऑटोक्लेव सर्जिकल 9 सेमी सीधे टिप ठीक बिंदु कैंची और 10 सेमी कोण serated संदंश।
  2. कैल्शियम मैग्नीशियम मुक्त Dulbecco के फॉस्फेट-बफर नमकीन (CMF-DPBS) की एक 500 एमएल बोतल में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/ एस) के 25 एमएल जोड़ें। यह उपयोग के समय ठंडा हो जाएगा यह सुनिश्चित करने के लिए एक बर्फ स्नान में समाधान रखें। दिल के अलगाव के लिए एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में अलीकोट 50 एमएल। हेपरिन सोडियम विलयन की 250 इकाइयों/एमएल में 50 एमएल एलिकोट में जोड़ें। इसे हेपरिनीकृत सीएमएफ-डीपीएस के रूप में संदर्भित किया जाएगा।
  3. उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) की एक 500 एमएल बोतल में 20% FBS (100 एमएल) और 1% P/ यह एंजाइम मुक्त संस्कृति मीडिया के रूप में भेजा जाएगा. DMEM के 20 एमएल + 20% FBS + 1% P/ यह एंजाइम समाधान के रूप में संदर्भित किया जाएगा. एंजाइम मुक्त संस्कृति मीडिया और एंजाइम समाधान दोनों को एक इनक्यूबेटर या पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखें।

2. पशु और कार्डिएक ऊतक की खरीद की तैयारी

  1. इंट्रापर्टिनली एक 31 जी सुई सिरिंज के साथ हेपरिन सोडियम समाधान की 250 इकाइयों के साथ एक माउस इंजेक्ट. फिर 10 -15 मिनट प्रतीक्षा करें, जबकि माउस अपने घर पिंजरे में सक्रिय रहता है.
    नोट: इस अध्ययन में प्रतिनिधि डेटा एक 4 महीने पुराने पुरुष C57BL/6 माउस से प्राप्त किए गए थे. हालांकि, इस प्रोटोकॉल तनाव, उम्र, लिंग, वजन, आदि की परवाह किए बिना किसी भी माउस पर इस्तेमाल किया जा सकता है
  2. 5% isoflurane के साथ माउस एनेस्थेटाइज करें। चुटकी पलटा द्वारा माउस की संज्ञाहरण गहराई की जाँच करें.
  3. एनेस्थेटाइज्ड माउस को सुपाच्य स्थिति में रखें और इसके फोरलीम्ब्स को टेप करें। ध्यान से छाती गुहा खोलने के लिए और एक 25 जी तितली सुई का उपयोग कर उतरते aorta cannulate कर सकते हैं।
  4. सही एट्रियम में एक निक बनाएं और 250 इकाइयों/एमएल हेपरिनइज्ड सीएमएफ-डीपीबीएस के कम से कम 20 एमएल के साथ एक चर-प्रवाह peristaltic पंप के साथ 2 एमएल/मिनट पर दिल perfuse। जब पीबीएस सही atria साफ से बाहर आता है, भ्रम पूरा हो गया है.
  5. ऑरटा में दिल को काटकर बर्फ-ठंडा सीएमएफ-डीपीबीएस में रखें।

3. हृदय ऊतक का विघटन

  1. दिल को 15 सेमी x 15 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। टुकड़ों को कवर करने के लिए पर्याप्त एंजाइम समाधान के साथ वसंत कैंची और ठीक बिंदु बलप्स का उपयोग करके दिल को छोटे टुकड़ों (1 मिमी/पीस) में काटें(10 डिग्री 15 एमएल)।
  2. टुकड़े और समाधान को 50 एमएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें, पैराफिन प्लास्टिक फिल्म के साथ सील करें, और 75 मिनट के लिए 120 आरपीएम पर एक कक्षक शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. एंजाइम समाधान के साथ कोलैज़ानेज़ पाचन के बाद, एक नया 50 एमएल ट्यूब में एक 100 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से तरल decant लेकिन पर्याप्त समाधान छोड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि टुकड़े बाहर सूखी नहीं है.
  4. ठीक बिंदु संदंश का उपयोग करके, ट्यूब से ऊतक बाहर ले और एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कुछ टुकड़े जगह है. फिर ऊतक को तोड़ने के लिए दो माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच ऊतक पीस. एक नया 50 एमएल शंकु ट्यूब में एंजाइम मुक्त संस्कृति मीडिया के साथ स्लाइड कुल्ला.
  5. कदम 3.4 दोहराएँ जब तक सभी ऊतक टुकड़े अलग कर रहे हैं.
  6. चरण 3.3$3.5 से समाधानों को एक नली में संयोजित करें. एक नया 50 एमएल शंकु ट्यूब में एक 100 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से जिसके परिणामस्वरूप निलंबन तनाव.
  7. 220 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज, 5 मिनट के लिए पिछले समाधान से प्रेरित करें और ताजा एंजाइम मुक्त संस्कृति मीडिया में सेल पेलेट को धीरे से निलंबित करें।
  8. कक्षों की गणना करें और कक्ष काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्यता की जांच करें. डी पी बी एस के 500 एमएल और 2 डिग्री 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 10 डिग्री 25 एमएल वाले ठंडे FACS धुंधला बफर के साथ 1 x 106/एमएल के लिए कोशिकाओं को पतला करें। कोशिकाओं को दाग और हल किया जा करने के लिए तैयार हैं।

4. कच्चे तेल सेल मिश्रण से Pericytes की शुद्धि FACS का उपयोग

  1. सभी नियंत्रण और सेल नमूनों के लिए 5 एमएल FACS ट्यूबों को तैयार और लेबल करें। एक बेदाग नमूना के लिए कोशिकाओं (1 एमएल प्रति ट्यूब) बाहर Alicot, एक (FMO) नियंत्रण, और आइसोटाइप-मिलान नियंत्रण शून्य से फ्लोरोसेंट। सॉर्ट के लिए शेष कक्षों का उपयोग करें. सभी नियंत्रण और नमूने तैयार किया जा सकता है और एक ही समय में दाग.
    नोट:0.5 x 10 पर कुल 13 एमएल6कोशिकाओं / एमएल एक दिल से प्रतिनिधि तरह के लिए इस्तेमाल किया गया. हालांकि, मात्रा कितनी कोशिकाओं अन्वेषक उनके अलगाव से प्राप्त पर निर्भर करता है, कितने दिल वे उपयोग करते हैं, और कितनी अच्छी तरह दिल के ऊतकों पचा जाता है; प्रत्येक दिल का आकार भी एक चर है कि मात्रा को बदल सकते हैं.
    1. फ्लोरोसेंट मुआवजा नियंत्रण का अनुकूलन करने के लिए मुआवजा मोती (सामग्री कीतालिका) का उपयोग करें। प्रयोग में प्रत्येक फ्लोरोक्रोम के लिए एक प्रतिकर नियंत्रण को 5 एमएल एफएसयू ट्यूब में तैयार कीजिए। इस प्रयोग के लिए, कुल 9 मुआवजा नियंत्रण तैयार करें - NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, और सेल व्यवहार्यता-APC-Cy7 सहित मार्कर पैनल से 2 प्रकार के बेदाग मोती प्लस 7 विभिन्न fluorchromes ( सामग्री की तालिका)
      1. प्रत्येक ट्यूब के लिए निचोड़ शीशी से मुआवजा मोती ($ 50 डिग्री सेल्सियस) की एक बूंद जोड़ें। फिर मोती के लिए एंटीबॉडी के 1 डिग्री एल जोड़ें. मार्कर पैनल से प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए दोहराएँ. पल्स-वॉर्टेक्सिंग द्वारा जोरदार मिश्रण करें। सेल व्यवहार्यता मोती जो प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर छोड़ा जा सकता है को छोड़कर प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      2. इसके बाद, प्रत्येक ट्यूब के लिए एफएसीएस धुंधला बफर के 3 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर अपकेंद्रित्र। समाधान बंद aspirate और FACS धुंधला बफर के 400 डिग्री एल में प्रत्येक मनका गोली resuspend. मुआवजा नियंत्रण उपयोग किए जाने के लिए तैयार हैं। बर्फ पर रखें.
    2. वर्णक्रमीय ओवरलैप के कारण पृष्ठभूमि धुंधला अनुकूलन करने के लिए FMO नियंत्रण का उपयोग करें.
      1. एक 5 एमएल FACS ट्यूब में धारा 4.1 से alictioned किया गया था कि कोशिकाओं के 1 एमएल का उपयोग करके FMO नियंत्रण तैयार करें और एक 1:100 कमजोर पड़ने पर चरण 4.1.1 में वर्णित मार्कर पैनल से सभी एंटीबॉडी में जोड़ने लेकिन एक एंटीबॉडी को छोड़कर. उदाहरण के लिए, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, सेल व्यवहार्यता डाई नहीं बल्कि NG2-AF488 एंटीबॉडी के लिए एंटीबॉडी शामिल करके एक NG2-AF488 FMO तैयार करें। पल्स-वॉर्टेक्सिंग द्वारा धीरे से मिलाएं। 7 नियंत्रण की कुल के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए दोहराएँ. प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      2. इसके बाद, प्रत्येक ट्यूब के लिए एफएसीएस धुंधला बफर के 3 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर अपकेंद्रित्र। समाधान बंद aspirate और FACS धुंधला बफर के 400 डिग्री एल में प्रत्येक सेल गोली resuspend. FMO नियंत्रण का उपयोग किया जा करने के लिए तैयार हैं। बर्फ पर रखें.
    3. गैर-विशिष्ट धुंधला के लिए समप्रकार-मेल्ड नियंत्रण एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें।
      1. समप्रकार-अनुसूचत जनन नियंत्रण को खंड4ण्1 से 1:100 तनुत तनुमें तनु में 5 एमएल एफएसयू ट्यूब में प्रत्येक को खंड 4ण्1 से तैयार किए गए सेल नमूने के 1 एमएल में जोड़कर समप्रकार-मेलित नियंत्रण तैयार कीजिए। पल्स-वॉर्टेक्सिंग द्वारा धीरे से मिलाएं। प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      2. इसके बाद, प्रत्येक ट्यूब के लिए एफएसीएस धुंधला बफर के 3 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर अपकेंद्रित्र। समाधान बंद aspirate और FACS धुंधला बफर के 400 डिग्री एल में प्रत्येक सेल गोली resuspend. समप्रकार नियंत्रण उपयोग किए जाने के लिए तैयार हैं. बर्फ पर रखें.
    4. ताजा अलग कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़कर हल किया जा करने के लिए कोशिकाओं को तैयार करें।
      1. धारा 4.1 से सेल नमूना तैयार विरोधी माउस NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 पर 1:100 कमजोर पड़ने प्रत्येक और सेल जीवंतता डाई युक्त एक एंटीबॉडी कॉकटेल में जोड़कर 1:100 पर प्रत्येक और सेल व्यवहार्यता 1:000 पर. मिश्रण करने के लिए धीरे भंवर. प्रकाश से सुरक्षित 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के नमूने।
      2. धुंधला करने के बाद, एफएसीएस के साथ धोने की कोशिकाओं को 5 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा बफर धुंधला। समाधान बंद aspirate और FACS में सेल गोली resuspend 0.5 x 106 कोशिकाओं /
      3. 35 डिग्री फिल्टर सबसे ऊपर है कि नए FACS ट्यूबों का उपयोग करना, पिपेट एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए lids और गुरुत्वाकर्षण छानना पर सेल नमूने दाग. बर्फ पर रखें.
  2. कक्षों को शुद्ध करने के लिए सेल सॉर्टर का उपयोग करें.
    1. voltages सेट करने के लिए और पृष्ठभूमि संकेत के लिए सही करने के लिए सेल सॉर्टर पर unstained कोशिकाओं को चलाने (उदाहरण के लिए, आगे तितर बितर करने के लिए 490 डिग्री 560 के लिए और पक्ष तितर बितर करने के लिए 180 डिग्री 250 के लिए voltages सेट).
    2. प्रत्येक चैनल के लिए voltages को समायोजित करने और सकारात्मक संकेत के लिए फाटकों को समायोजित करने के लिए एक समय में प्रत्येक एकल रंग मुआवजा मनका नमूना एक चलाएँ. डेटा एकत्रित करें. मुआवजा मैट्रिक्स की गणना करके वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. सभी voltages तैयार है और सेट कर रहे हैं.
    3. एक समय में प्रत्येक समप्रकार नियंत्रण एक चलाएँ और इस डेटा nonspecific बाइंडिंग के लिए द्वार समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर कोई भी हैं.
    4. समय पर प्रत्येक FMO नमूना एक चलाने के लिए और एक बहु रंग पैनल के कारण के माध्यम से वर्णक्रमीय खून के लिए सही करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए voltages समायोजित करें.
    5. सेल सॉर्टर में दाग सेल नमूने चलाने के लिए और एक 15 एमएल शंकु संग्रह ट्यूब में 10 एमएल एंजाइम मुक्त संस्कृति मीडिया (डीएमईएम + 20% FBS + 1% पी / निम्नलिखित गेटिंग रणनीति का उपयोग करें: एकल कोशिकाओं के लिए गेट, लाइव सेल के लिए गेट, CD45 नकारात्मक कोशिकाओं के लिए गेट, CD34 के लिए गेट और CD31 नकारात्मक कोशिकाओं, NG2 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए गेट, और अंत में CD146 और CD140b सकारात्मक कोशिकाओं के लिए गेट.

5. पेरिसाइट्स की गणना

  1. कोट एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के साथ 0.2% जिलेटिन के लिए 5 मिनट और जिलेटिन समाधान बंद aspirate. बीज ताजा प्राप्त कोशिकाओं से चरण 4.2.5 में DMEM + 20% FBS + 1% P/ 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 95% हे2पर सेट सेल इनक्यूबेटर में संस्कृति कोशिकाओं।
  2. पेरिसाइट्स की दर्रा
  3. एक बार कोशिकाओं 95% confluent हैं, गर्म 1x DPBS के साथ कोशिकाओं को धोने, और 3 के लिए कमरे के तापमान पर प्रत्येक अच्छी तरह से 0.1% trypsin के 200 $ L के साथ कोशिकाओं को उठा.
  4. कोशिकाओं को ढीला करने के लिए प्लेट को धीरे से टैप करें।
  5. 3.5x संस्कृति मीडिया की राशि के साथ trypsin तटस्थ (700 $L DMEM + 20% FBS + 1% पी /
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से, जब confluent, P3 कोशिकाओं जो तब एक 1:6 अनुपात में विभाजित किया जा सकता है के रूप में एक एकल टी 75 फ्लास्क में ले जाया जा सकता है.

6. पेरिसाइट्स की विशेषता

  1. प्रवाह साइटोमिति विश् लेषण
    1. पहले अनुभाग 4 में वर्णित के रूप में एक ही FACS धुंधला प्रोटोकॉल और gating रणनीति का प्रयोग करें.
    2. प्रवाह साइटोमीटर पर नियंत्रण और दाग नमूने चलाते हैं। डेटा एकत्र करें और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण (सामग्री की तालिका) .
  2. ब्राइटफील्ड छवियों को एकत्र करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 95% ओ2पर सेट सेल इनक्यूबेटर में फ्लास्क में कोशिकाओं को विकसित करें। कोशिकाओं को सतह से जोड़ने के बाद एक माइक्रोस्कोप पर छवियों पर कब्जा।
  3. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री
    1. 90% confluent जब तक एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को बढ़ाएँ. गर्म 1x DPBS के साथ कोशिकाओं को धो लें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ ठीक करें।
    2. 1x DPBS के साथ 3x कोशिकाओं को धोएं और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.1% डिटर्जेंट के साथ permeabilize।
    3. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए बफर अवरुद्ध के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं। अवरुद्ध करने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी (एक एंटीबॉडी प्रति अच्छी तरह से) जोड़ें बफर और इनक्यूबेट को रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध करने में पतला 1:100। प्राथमिक एंटीबॉडी हैं: विरोधी NG2, विरोधी CD140b, विरोधी CD31, विरोधी vimentin, विरोधी desmin, और विरोधी अल्फा चिकनी मांसपेशी actin.
    4. अगले दिन, धोने की कोशिकाओं 3x धोने बफर के साथ (सामग्रीकीतालिका) . अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए बफर और इनक्यूबेट को अवरुद्ध करने में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1:1,000 जोड़ें। माध्यमिक एंटीबॉडी FITC के लिए एक विरोधी rabbit संयुग्मी है.
    5. धोने बफर के साथ कोशिकाओं 3x धो लें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1:1,000 पर पतला 300 डिग्री सेल्सियस परमाणु दाग जोड़ें।
    6. 1x DPBS के साथ 3x कोशिकाओं को धो एंबर लैस करें और बढ़ते मीडिया के साथ माउंट करें।
    7. एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ छवि कोशिकाओं.

Representative Results

पूरे हृदय के वियोजन और कोशिकाओं के एफएसीएस शुद्धिकरण से पहले, कोशिकाओं में एक कच्चा मिश्रण होता है जिसमें हृदय से अनेक प्रकार के कोशिकाएं होती हैं (चित्र 1क)। FACS शुद्धि और culturing के बाद, कोशिकाओं समरूप हैं. वे एक नाभिक, काफी सपाट होते हैं और विशिष्ट परिकोशिका समचतुर्भुज आकृति विज्ञान (चित्र 1ख)होते हैं।

FACS का उपयोग करना, कोशिकाओं homogeny के लिए शुद्ध कर रहे हैं. बिना दाग वाले नियंत्रण कक्ष नमूने का प्रयोग गेटिंग रणनीति दिखाने के लिए किया जाता है (चित्र 2) । सबसे पहले, आगे और साइड स्कैटर वितरण के आधार पर मलबे और डबल्स को गेट आउट किया गया। फिर मृत कोशिकाओं को डाई जो एक संकेत अधिक से अधिक और जीने की कोशिकाओं की तुलना में अधिक तीव्र पैदा करता है के साथ उनके amine प्रतिक्रिया के कारण बाहर gated थे. जीवित कोशिकाओं में से, हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को सीडी 45+होने से बाहर द्वार किया गया था। हेमाटोपोइटिक और एंडोथेलियल कोशिकाओं को दूर करने के लिए, CD34+ और CD31+ कोशिकाओं को बाहर गेट किया गया था। अंत में, NG2+ और CD140b+/CD146+ कोशिकाओं विशिष्ट pericyte मार्करों की अभिव्यक्ति के साथ perivascular कोशिकाओं होने के लिए चुना गया (चित्र 3). मार्कर पैनल भी एक नियंत्रण के रूप में माउस कोरोनरी endothelial कोशिकाओं पर परीक्षण किया गया था (पूरक चित्र 1). केवल कच्चे सेल मिश्रण के बारे में 1% छँटाई के बाद pericytes शामिल थे.

यह सत्यापित करने के लिए कि कोशिकाओं को वास्तव में pericytes थे, हम आगे की विशेषता के लिए कोशिकाओं को पारित कर दिया. जब वे टी-75 फ्लास्क में पी 3 तक पहुँच गए तो कोशिकाएं तेजी से बढ़ी क्योंकि वे बड़े हो गए थे (पूरक चित्र 2)। जब मानव मस्तिष्क pericytes के साथ तुलना में, कोशिकाओं को एक समान आकृति विज्ञान था (चित्र 4A). जब माउस और मानव चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ तुलना में, कोशिकाओं को एक अलग आकृति विज्ञान था (चित्र 4A). P7 पर आकारिकी या मार्कर अभिव्यक्ति में कोई भी परिवर्तन नहीं किया गया जब प्रतिरक्षा या प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा पासिंग के बाद (चित्र 4बी,ब्) .

Figure 1
चित्र 1 : शुद्ध कोशिकाओं बनाम क्रूड सेल. (ए) कच्चे सेल मिश्रण की उज्ज्वल छवि पूरे दिल एंजाइमी पाचन और वियोजन के बाद जो 14 दिनों के लिए एक T25 फ्लास्क में सुसंस्कृत किया गया है। (ख) 14 दिनों के बाद कार्डियक पेरिसाइट्स पोस्ट-सॉर्टिंग और culturing की समरूप आबादी की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : बेदाग कोशिकाओं के FACS विश्लेषण के प्रतिनिधि छवियों. कच्चे सेल मिश्रण को शुद्ध करने के लिए उपयोग की जाने वाली गैटिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। उन कोशिकाओं के लिए गेट जो एकल, लाइव, CD45-, CD31-, CD34-, NG2+, CD146+और CD140b+हैं . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : कच्चे कोशिकाओं के FACS विश्लेषण के प्रतिनिधि छवियों| हृदय पेरिसाइट्स की समरूप जनसंख्या प्राप्त करने के लिए प्रत्यांचल का योजनाबद्ध निरूपण. कच्चे तेल की कोशिकाओं का लगभग 1% CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : प्राथमिक अलग हृदय pericytes की विशेषता (ए) मानव मस्तिष्क (एचपीसी) और माउस दिल (एमपीसी) से सुसंस्कृत कोशिकाओं के ब्राइटफील्ड छवियों को इसी तरह की पेरिसाइट सेल आकारिकी लेकिन मानव चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं एचएसएमसी से अलग आकृति विज्ञान ( माउस चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं) और माउस चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (mSMC) दिखाते हैं। स्केल बार - 100 डिग्री मी. (बी) फेनोटाइपिक लक्षणानुसार पी 7 में कोशिकाओं का पेरिसाइट मार्कर के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा लक्षणीकरण। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. (ग) P7 पर pericytes के प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण जहां वे नकारात्मक मार्करों CD31, CD34, CD45 और सकारात्मक मार्करों NG2, CD140b, और CD146 के लिए gated थे. जनसंख्या समरूप बनी हुई है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: मार्कर पैनल का उपयोग कर endothelial कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के प्रतिनिधि छवियों. एक माउस कोरोनरी endothelial सेल लाइन मार्करों के लिए बाध्यकारी विशिष्टता के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एक ही gating रणनीति है कि एक नकारात्मक गेट के बजाय CD31 के लिए एक सकारात्मक गेट के लिए छोड़कर सॉर्ट में इस्तेमाल किया गया था का उपयोग करना, endothelial कोशिकाओं CD45, CD34, NG2, CD140b, और CD146 के लिए नकारात्मक थे, लेकिन सीडी 31 के लिए सकारात्मक के रूप में उम्मीद है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

पूरक चित्र 2: एमपीसी के विभिन्न अंशों के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के प्रतिनिधि छवियों। प्राथमिक पृथक हृदय pericytes सुसंस्कृत और 12 पारित करने के लिए पारित किया गया. कोशिकाओं को प्रोपिडियम आयोडाइड से दागा गया और प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण किया गया। नियंत्रण जनसंख्या मृत कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं का एक मिश्रण है. मार्ग के बीच व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

Discussion

के रूप में हृदय pericytes पर अध्ययन अपेक्षाकृत नए हैं, हृदय शरीर क्रिया विज्ञान और pathophysiology में pericytes की भूमिका अभी तक परिभाषित किया जाना है. अन्य अंगों में, उन्हें पोत गृहस्थी और परफ्यूजन1,2में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है। मस्तिष्क जैसे अन्य अंगों से pericytes के साहित्य की तुलना में, वहाँ हृदय pericytes पर काफी कम प्रकाशन कर रहे हैं. कार्डियक पेरिसाइट्स का अलगाव उनके कार्यात्मक विशेषताओं और संकेतन तंत्र की समझ के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल एक और अधिक आसानी से उपलब्ध ऊतक स्रोत से कार्डियक pericytes का उपयोग और उनके जीव विज्ञान पर अध्ययन को बढ़ावा देने के लिए एक आसान तरीका के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करेगा. यह कैसे हृदय pericytes हृदय homeostasis और pathophysiology के लिए योगदान के रूप में अच्छी तरह से उनकी चिकित्सीय क्षमता की जांच पर सवालों के जवाब में मदद मिलेगी.

pericyte आबादी murine दिल से अलग और CD31 द्वारा विशेषता-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ कई बार पारित किया गया है (P12 तक और अभी भी मजबूत जा रहा था), जो नहीं करता है व्यवहार्यता में कमी और शीघ्रता से प्रचारित हो जाता है (अनुपूरक चित्र 2)। कोशिकाओं को भी cryofrozen किया गया है और कम से कम 95% व्यवहार्यता के साथ बरामद. हालांकि, हम अपने प्रयोगों के लिए कोशिकाओं P7 या छोटे का उपयोग करना पसंद करते हैं. मानव मस्तिष्क pericytes के साथ हमारे pericytes के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों की तुलना, दो सेल लाइनों तुलनीय कोशिका आकृति विज्ञान है (चित्र 4A) जबकि वे चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से आकारिकी में अलग (चित्र 4A) . हमारे P7 कोशिकाओं pericyte मार्करों के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा विशेषता थी, हमारे FACS पैनल से कुछ (NG2 और CD140b), और कुछ पैनल में नहीं (vimentin, desmin, $SMA) और हमने पाया कि कोशिकाओं को समरूप रूप से pericyte मार्करों व्यक्त (चित्र 4B). इसके अतिरिक्त, हमारे P7 कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा फिर से एक ही मार्कर पैनल के साथ विश्लेषण किया गया passaging के कारण मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए आकलन करने के लिए और हमने पाया कि वहाँ कोई परिवर्तन नहीं थे (चित्र 4C). इसलिए, दोनों phenoआमरूपी और रूपात्मक रूपात्मक, हमारी कोशिकाओं pericytes हैं.

Nees et al.10, Avolio et al.11, चेन एट अल12, और बेली एट अल13 द्वारा किए गए अध्ययनों से सफल कार्डियक पेरिसाइट अलगाव दिखाया गया है. हालांकि, एक घर में कस्टम निर्मित उपकरणों का उपयोग Nees एट अल द्वारा microicys से pericytes अलग करने के लिए10 पंप है कि perfused प्रोटीज़ समाधान के साथ आगे और पीछे एक जाल शुद्ध ढेर के माध्यम से दो कक्षों शामिल है, जो के रूप में वे दोहराने के लिए मुश्किल था उपकरण की एक योजनाबद्ध और/या तस्वीर प्रदान नहीं की और यह कैसे बनाया गया था. हालांकि Nees एट अल10 सफलतापूर्वक कई प्रजातियों से हृदय pericytes अलग, हम उनकी विधि को पुन: पेश करने में सक्षम नहीं थे. हमारे प्रोटोकॉल में हमारे pericyte टुकड़ी कदम बस एक कक्षीय शेकर का उपयोग करता है (सभी कोशिकाओं को अलग करने के लिए) जो सबसे में उपलब्ध है, नहीं तो सभी प्रयोगशालाओं, एक शंकु ट्यूब में ऊतक और एंजाइम समाधान के साथ एक यांत्रिक वियोजन कदम के बाद. कोई कस्टम उपकरण की आवश्यकता है। दूसरे, शेष प्रोटोकॉल मानव ऊतकों का उपयोग शामिल है और इस प्रकार मानव ऊतक की खरीद जांचकर्ताओं के लिए सीमित है. हमारे प्रोटोकॉल एक संशोधन और वर्तमान प्रोटोकॉल के अनुकूलन9,12 माउस मॉडल का उपयोग कर (जंगली प्रकार, आनुवंशिक रूप से संशोधित, रोगग्रस्त) और सामग्री है कि सभी जांचकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध हैं.

क्योंकि सामान्य में perivascular कोशिकाओं संवेदनशील हैं, कोशिकाओं की व्यवहार्यता एक अच्छी उपज प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. हृदय ऊतक की खरीद और कोशिकाओं के दाग के दौरान, ऊतक/कोशिकाओं को बर्फ ठंडा रखने की आवश्यकता होती है। दूसरे, ऊतक के एंजाइमी पाचन एक व्यक्ति के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. एंजाइमों की एक शीशियों पर गतिविधि की इकाइयों पर निर्भर करता है, एकाग्रता और पाचन समय अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है. सुनिश्चित करें कि एंजाइमी समाधान हर बार ताजा तैयार किया जाता है अन्यथा उपज कम हो जाएगी। तीसरे, कच्चे तेल के मिश्रण कोशिकाओं का एक बहुत कुछ होता है, कुछ मर चुका है और / या मर रहा है, यह सबसे अच्छा है 5% से 2% तक धुंधला बफर में FBS की एकाग्रता को कम करने के लिए. यदि आप सॉर्ट के दौरान नोजल clogging कोशिकाओं के साथ परेशानी हो रही है, एक मृत सेल हटाने किट का उपयोग करके पहले कोशिकाओं को समृद्ध. आप सेल क्लंपिंग को रोकने के लिए सेल प्री-सॉर्ट में EDTA/HEPES बफ़र या DNase उपचार भी जोड़ सकते हैं। अंत में, क्योंकि एंटीबॉडी के हमारे पैनल बल्कि बड़ी है और कई fluorophores का उपयोग करता है, सुनिश्चित करें कि आपके FMO नियंत्रण और मुआवजा नियंत्रण सही ढंग से किया जाता है.

इस विधि के लिए एक सीमा हृदय pericytes कि प्रति दिल प्राप्त किया जा सकता है की मात्रा है. हमारे मामले में, एक माउस दिल से हमारे कच्चे तेल के मिश्रण का केवल 1.1% pericytes जो मानव दिल अलगाव में प्रतिशत के बराबर है थे, लेकिन कोशिकाओं की संख्या दिल के ऊतकों की मात्रा के कारण काफी कम है एक माउस प्रदान करता है. क्योंकि कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या FACS के बाद बहुत कम है, यह एक बार में कई दिल से अलग करने के लिए बेहतर होगा. हालांकि, उस के साथ समस्या कोशिकाओं की सरासर संख्या है कि आप के माध्यम से एक दिन में सॉर्ट करने की आवश्यकता है. यदि आपके पास 30 मिलियन से अधिक कोशिकाएं हैं, तो कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना इस प्रकार से प्राप्त करना कठिन होगा। यदि अन्वेषक कई सेल sorters था, एक दिन में कई दिलों से अलग करना करने योग्य होगा. एक और सीमा यह है कि क्योंकि हम नहीं जानते कि अगर वहाँ के दिल में pericytes के subpopulations की तरह वहाँ कंकाल की मांसपेशी15,16है, हम नहीं जानते कि अगर हम अपने gating रणनीति में एक उपप्रकार को नष्ट कर रहे हैं. हम अपने हृदय pericytes की विशेषता की प्रक्रिया में हैं और इस तरह अब तक हमारे अप्रकाशित डेटा में, वे कार्यात्मक साहित्य में अन्य pericytes की तरह हैं.

हमारे प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं हृदय pericyte गुण, विशेषताओं, कार्यक्षमता, और अन्य पहलुओं है कि हृदय homeostasis और hemodynamics के लिए उनके योगदान को परिभाषित करने में मदद मिलेगी पर सवालों के जवाब देने के लिए सक्षम हो जाएगा. इन कोशिकाओं हृदय रोग के लिए चिकित्सीय क्षमता हो सकता है एक बार उनके जीव विज्ञान बेहतर समझ है.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों fluorophore पैनल डिजाइन, समस्या निवारण, और सेल छँटाई के साथ उनकी मदद के लिए Amgen प्रवाह Cytometry कोर शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Corning 25-053-Cl dilute with 1x DPBS to get 0.1%
100 μM Cell strainer FisherSci 22363549
15 mL Falcon conical tubes BD 352096
24-well plate Corning CLS3527
25 G butterfly needle FisherSci 22-253-146
31 G needle syringe FisherSci B328446
50 mL Falcon conical tubes BD 352098
6-well plate Corning CLS3516
anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb abcam ab32575 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-CD140b rabbit mAb Cell Signaling 28E1 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-CD31 rabbit pAb abcam ab28364 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-desmin rabbit pAb abcam ab8592 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-NG2 conjugated to AF488 Millipore MAB5384A4 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-vimentin rabbit mAb abcam ab92547 Antibody used in ICC 1:100 dilution
ArC Amine Reactive Compensation bead kit Invitrogen A10346 compensation beads for Live/Dead Near IR dye
Brightfield Microscope camera attached
CD140b-PE (clone APB5) eBioscience 12-1402-81 Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD146-BV605 (clone ME-9F1) BD 740434 Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD31-APC (clone MEC 13.3) BD 551262 Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD34-BV421 (clone RAM 34) BD 56268 Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) BD 552848 Antibody used in FACS 1:100 dilution
Centrifuge eppendorf
Collagenase B Roche 11088815001 0.226 U/mg lyo.
Confocal Microscope
DAPI ThermoFisher D1306 nuclear stain
DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate Corning 10-013-CV 500 mL
Dowell scissors FST 15040-11
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Corning 21-030-CV 500 mL
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) Corning 21-031-CV 500 mL
Dumont #5 Fine Forceps FST 11254-20
FACSAria cell sorter BD Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW
FACSAria software BD
Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL BD 38057
Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL BD 08-771-23
Fetal Bovine Serum Corning 35-015-CV 500 mL
Fine scissors FST 14060-09
FlowJo software FlowJo LLC
Fortessa LSR flow cytometer BD Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW
Gelatin-based coating Cell Biologics 6950
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 Antibody used in ICC 1:1000 dilution
Graefe Forceps FST 11049-10
Heparin sodium solution Hospira NDC 0409-2720-02 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines
Incubator set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 
Live/Dead-Near IR Life Technologies L10119
Microscope slides FisherSci 12-550-343
NG2-FITC Millipore AB5320A4 Antibody used in FACS 1:100 dilution
Oribital shaker VWR Inside 37 °C incubator or room
Paraformaldehyde FisherSci 50-980-487 dilute with 1x DPBS to get 4%
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
 Petri dish FisherSci FB0875714
Pipette and tips
ProLong Diamond ThermoFisher P36965 mounting media
Propidum Iodide ThermoFisher cell viability dye for supplemental figure 2
Rabbit IgG FITC eBiosciences 11-4614-80 Isotype control antibody - FITC
Rat IgG2a APC Biolegend 400512 Isotype control antibody - APC
Rat IgG2a BV421 Biolegend 400536 Isotype control antibody - BV421
Rat IgG2a BV605 BD 563144 Isotype control antibody - BV605
Rat IgG2a PE Biolegend 400308 Isotype control antibody - PE
Rat IgG2b PE-Cy7 Biolegend 400617 Isotype control antibody - PE-Cy7
SuperBlock ThermoFisher 37515 blocking buffer
T75 ThermoFisher 156499
Triton X-100 Sigma X100 detergent, dilute with x DPBS to get 0.1%
UltraComp beads Invitrogen 01-2222-42 compensation beads
Variable-Flow Peristaltic Pump FisherSci 13-876-1
ViCell Cell counter Beckman
Wash buffer 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS

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References

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Lee, L. L., Khakoo, A. Y.,… More

Lee, L. L., Khakoo, A. Y., Chintalgattu, V. Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes. J. Vis. Exp. (150), e59571, doi:10.3791/59571 (2019).

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