Anrikning av Native Lipoproteinpartiklar med mikroRNA och efterföljande bestämning av deras absoluta/relativa mikroRNA innehåll och deras cellulära överföringshastigheten

Summary

Här, ett kvantitativt i real tid polymeras kedje reaktion-baserat protokoll presenteras för bestämning av den infödda Micro-RNA innehåll (absoluta/relativa) av lipoproteinpartiklar. Dessutom, en metod för att öka mikro-RNA-nivån, samt en metod för att bestämma den cellulära upptagshastigheten av lipoproteinpartiklar, visas.

Abstract

Lipoproteinpartiklar är huvudsakligen transportörer av lipider och kolesterol i blodet. Dessutom innehåller de små mängder av strängar av kodande mikroRNA (Mirna). I allmänhet förändrar miRNA protein uttrycks profilen på grund av interaktioner med Messenger-RNA (mRNA). Således är kunskapen om det relativa och absoluta miRNA-innehållet i lipoproteinpartiklar avgörande för att uppskatta den biologiska effekten av cellernas partikel upptag. Här, en kvantitativ real tid polymeras kedje reaktion (QPCR)-baserat protokoll presenteras för att bestämma den absoluta Mirna innehållet av lipoproteinpartiklar-exemplifieras visas för infödda och Mirna-berikad lipoprotein partiklar. Det relativa Mirna-innehållet kvantifieras med multispot mikroflödessystem array-kort. Dessutom, detta protokoll gör det möjligt för forskare att uppskatta cellulära miRNA och därmed lipoprotein partikel upptagshastigheten. En signifikant ökning av cellulär miRNA nivå är observerbar när du använder High-density lipoprotein (HDL) partiklar artificiellt laddad med miRNA, medan inkubation med inhemska HDL-partiklar ger ingen signifikant effekt på grund av deras ganska låga miRNA innehåll. I kontrast, det cellulära upptaget av low-density lipoprotein (LDL) partiklar-varken med infödda miRNA eller artificiellt laddad med det-inte ändra cellulär miRNA nivå.

Introduction

Lipoproteinpartiklar består av en enskiktslager av amfifila molekylers lipider och kolesterol innesluter en kärna av kolesterylestrar estrar och triglycerid fetter. Hela partikeln stabiliseras av membraninbäddade apolipoproteiner, som definierar partikelns biologiska funktionalitet. Lipoproteinpartiklar kan särskiljas beroende på deras respektive ökande densitet och därmed minskande storlek, nämligen som mycket-low-density lipoprotein (VLDL), mellanliggande densitet lipoprotein (IDL), LDL, och HDL-partiklar. Trots transporten av vatten olösliga komponenter i blod omloppet, det har visats att HDL-partiklar bär kodande strängar av Mirna^1,2. Mikro-rnas är en klass av korta (vanligt vis två dussin nukleotider) RNA-strängar, som försämrar intracellulärt kompletterande mRNA strängar och därmed ändra uttrycks profilen för vissa proteiner^3,4,^5, och ⁶. Vidare har förändringar av miRNA-profilen hittats i en mängd olika sjukdomar och därför är profilen tillämplig som bio markör för diagnos och prognos. Den extracellulära transporten av miRNAs mellan celler via lipoproteinpartiklar kan fungera som en extra mekanism för intercellulär mRNA-nivåmodulering. För att kvantitativt uppskatta den biologiska effekten behövs kunskap om det absoluta och relativa miRNA-innehållet i lipoproteinpartiklar.

Kvantitativ realtids-PCR är en lämplig och relativt snabb metod för att få denna information. Därför kan värdet för relativ kvantifiering (RQ) beräknas, och relativa skillnader mellan olika prover och lipoproteinfraktioner är uppskattnings bara. Multiwell mikroflödessystem array kort är en snabb och enkel att använda metod för att bestämma den relativa närvaron (motsvarar RQ värde) av mirnas i ett prov. Multiwell mikroflödessystem array kort består av 96 eller 384 individuella reaktionskammare för enskilda QPCR reaktioner inbäddade i en mikroflödessystem enhet. Varje kammare innehåller den erforderliga hydrolyssonden och specifika qPCR-primers för en individuell miRNA. Fördelarna är en kort hanterings tid på grund av standardisering, ett enkelt arbets flöde och ett minskat antal pipetteringsteg. Dessutom minimeras den nödvändiga prov volymen. I motsats till den relativa kvantifieringen kräver det absoluta miRNA-innehållet en jämförelse av resultaten av qPCR-provet med standard kurvor av det kända absoluta antalet miRNA-strängar. Det bör noteras att, på grund av deras relativt låga miRNA innehåll, standard och dessutom även Single-molekylen känsliga Imaging tekniker inte är genomförbara-den artificiella berikningen av lipoproteinpartiklar med miRNA är oundvikligt att studera cellulära lipoproteinpartikelinteraktion och miRNA-överföring. När det gäller detta, delipidation av HDL-partikel följt med efterföljande relipidation⁷ tillåter införlivande av och, därmed, berikning med Mirna strängar. Liknande berikning av LDL-partiklar med miRNA är inte genomförbart på grund av hydrofobicity av apoB-100 protein, som är den viktigaste bestånds delen i LDL-partikeln. Men genom tillsats av Polar lösnings medel dimetylsulfoxid (DMSO), som kan penetrera Lipidmembran, kan LDL-partiklar vara artificiellt laddad med miRNA strängar också.

Hög hastighet atomär mikroskopi (HS-AFM) är ett kraftfullt verktyg för karakterisering av biologiska prover som erbjuder subnanometer rumsliga och subsecond temporal resolution⁸. Därför är det en väl lämpad teknik för kvalitets kontroll av modifierade lipoproteinpartiklar som infödda/rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar kan avbildas under en nästan fysiologisk miljö.

Här presenteras ett qPCR-baserat protokoll steg-för-steg för att bestämma det absoluta/relativa miRNA-innehållet i lipoproteinpartiklar och cellprover, vilket möjliggör en uppskattning av den cellulära lipoproteinpartikelupptagshastigheten. Dessutom demonstreras en metod för berikning av lipoproteinpartiklar med miRNA. Denna metod kan anpassas för allmän manipulation av lipoproteinhalten och, därmed, visar tillämpligheten av lipoproteinpartiklar som mål för läkemedels leverans.

Protocol

Blod donationer har godkänts av etik kommittén, Medical University of Vienna (EK-nr. 511/2007, EK-nr. 1414/2016). Nomenklaturen är enligt den minsta information för publicering av kvantitativa Real-time PCR experiment (MIQE)⁹ rikt linjer.

1. lipoproteinpartikel isolering från humant blod

1. Förkyla en ultracentrifugen till 4 ° c. Dra blod från friska frivilliga efter natten fasta.
   Anmärkning: typiskt krävs är tre donatorer, donera 80 mL vardera, och blod uppsamlings rör som innehåller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) som antikoagulantia.
2. Centrifugera vid 2 000 x g i 20 min vid 4 ° c och skörd plasma (övre fasen); undvika skjuvkrafter. Bestäm den totala volymen V och justera vid behov till en multipel av centrifugeringsrörets volym med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Mät massan av 1 mL 3x och beräkna den genomsnittliga densiteten ρ.
3. Beräkna erforderlig mängd kaliumbromid (KBr) för densitetsjustering med följande ekvation¹⁰ (för önskad densitet i gram/milliliter, Använd A = 1,019, och för den specifika volymen av kbr, Använd = 0,364 ml/g). Tillsätt KBr i plasman och rör om försiktigt för att undvika skjuvkrafter tills KBr är helt upplöst.
   
4. Mät densiteten enligt beskrivningen i steg 1,2 och justera igen, om det behövs, genom att lägga till mer KBR. fyllnings-och tätnings centrifugeringsrör som lämpar sig för ultracentrifugering med plasma. Undvik eventuella luft bubblor; annars kan röret kollapsa. Placera rören i rotorn enligt tillverkarens anvisningar och centrifugera vid 214 000 x g i 20 h vid 4 ° c.
5. Öppna rören enligt tillverkarens anvisningar och kassera den övre fasen som innehåller VLDL och IDL. Bestäm den totala volymen V och justera vid behov till en multipel av centrifugeringsrörets volym med PBS.
6. Bestäm densiteten ρ i botten fraktionen. Beräkna erforderlig mängd KBr för densitetsjustering (Använd A = 1,063). Rör om försiktigt för att undvika skjuvkrafter tills KBr har lösts upp. Upprepa steg 1,4.
7. Ta bort och samla in den övre fasen som innehåller LDL-partiklar. Förvara LDL-partikellösningen under en inert gasatmosfär vid 4 ° c. Bestäm den totala volymen V och justera vid behov till en multipel av centrifugeringsrörets volym med PBS. Bestäm densiteten ρ i den undre fraktionen enligt beskrivningen i steg 1,2.
8. Beräkna erforderlig mängd KBr för densitetsjustering (Använd A = 1,220) och Lägg till den. Rör om försiktigt för att undvika skjuvkrafter tills KBr har lösts upp. Upprepa steg 1,4.
9. Ta bort och samla in den övre fasen som innehåller HDL-partiklar. Bestäm dess totala volym V och justera vid behov till en multipel av centrifugeringsrörets volym med PBS. Bestäm densiteten ρ. Ett andra centrifugeringssteg i den övre fasen vid 214 000 x g i 20 h vid 4 ° c rekommenderas för att ta bort albumin. Om det behövs upprepar du steg 1,8. Ta bort och samla in den övre fasen som innehåller HDL-partiklar.
10. Bered och förkyla minst 20 L dialys buffert (0,9% NaCl, 0,1% EDTA [pH 7,4]) till 4 ° c. Prewet dialys rör (molekyl vikt cut-off: 12-14 kDa) och tillsätt LDL och HDL partikel lösning enligt tillverkarens anvisningar. Dialyze mot 5 L dialys buffert vid 4 ° c och ändra bufferten efter 1, 2 och 4 h.
11. Efter 24 h, återvinna lipoprotein partikel lösningar från dialys rören och bestämma protein koncentrationen med hjälp av Bradford assay¹¹ eller annan lämplig en. Förvara HDL-och LDL-partikellösningarna under inert gasatmosfär vid 4 ° c.

2. syntetiska Mirna-Ali kvoter

Anmärkning: vid hantering av RNA oligonukleotides, arbete RNase-Free. Arbeta endast med färska, engångsartiklar av plast och Använd alltid handskar, som bör bytas ofta. Använd endast nukleasfria lösningar. Arbeta alltid på is.

1. Snurra ner flaskan som erhållits från tillverkaren vid maximal kraft för att bilda en pellet av den frystorkade syntetiska miRNA. Tillsätt en lämplig volym av 10 mM tris (hydroxymetyl) aminometan (TRIS) buffert, pH 7,5, för en slutlig koncentration av 10 μM (lager koncentration) miRNA.
2. Pipettera försiktigt upp och ner ett par gånger för resuspension. Bered Ali kvoter av 100 μL vardera i sterila tuber. Förvara dem vid-20 ° c om de inte används omedelbart. Undvik upprepad upptining och frysning.

3. beredning av HDL-partiklar

1. Delipidation
   1. Förbered buffert A (150 mM NaCl, 0,01% EDTA, 10 mM Tris/HCl [pH 8,0]). Förkyla centrifugen till-10 ° c. Precool 100 mL av en blandning av etanol: dietyleter (3:2) vid-20 ° c.
      Varning: Använd lämplig personlig skyddsutrustning och arbeta i en draghuv medan du hanterar dietyleter eftersom det är extremt brandfarligt och skadligt för huden.
   2. Blanda en volym motsvarande 5 mg HDL-partiklar med 50 mL av den förkylda etanolen: dietyleter (3:2) blandning och inkubera i 2 h vid-20 ° c. Centrifugera vid 2 500 x g i 10 min vid-10 ° c.
   3. Kassera supernatanten, omsuspendera pelleten i 50 mL förkyld etanol: dietyleter blandning genom vortexing, och inkubera en andra gång för 2 h vid-20 ° c. Centrifugera igen vid 2 500 x g i 10 min vid-10 ° c.
      Anmärkning: om så önskas, lyophilize supernatanten för en analys av miRNA innehåll i lipidfraktion av HDL-partiklar.
   4. Torka pelleten under N₂ gas flöde och omsuspendera den i 250 ΜL buffert a (se steg 3.1.1). Bestäm protein koncentrationen med hjälp av Bradford protein analysen eller en annan lämplig och späd till en slutlig koncentration av 1 mg protein/250 μL buffert A.
      Obs: protokollet kan pausas här. Förvara lösningen över natten vid 4 ° c under inert gasatmosfär.
2. Rekonstituering
   1. Förbered en fosfatidylkolin (PC) stam lösning med hjälp av en blandning av kloroform: metanol (2:1) vid en koncentration av 5,6 mg PC/mL. På samma sätt, förbereda lager lösningar av kolesterylestrar oleate (5 mg co/ml) och kolesterol (5 mg C/ml). Förvara alla lösningar vid-20 ° c.
   2. Blanda 500 μL av PC, 100 μL CO och 13,5 μL C i ett rent glasrör. Dessa volymer motsvarar en ungefärlig molar ratio på 100 PC: 22 CO: 4.8 C. torka blandningen under N₂ gas flöde medan rotera röret för att ge ett homogent ytskikt.
      Obs: protokollet kan pausas här. Förvara glas flaskan (om så önskas, lagring är möjlig) under inert gas atmosfär vid-20 ° c.
   3. Bered en fräsch 30 mM sperminlösning i buffert A. blanda en alikvot (100 μL, 10 μM) av syntetisk miRNA (se steg 2,2) med 100 μL sperminlösning och inkubera i 30 min vid 30 ° c.
      Anmärkning: för negativa kontroll experiment, Ersätt miRNA och/eller spermine lösning med samma volym av buffert A.
   4. Lös upp en PC/CO/C-huvudblandning i blandningen från steg 3.2.3.
   5. Bered en lösning på 30 mg/mL natriumdeoxycholat i buffert A och tillsätt 50 μL till lösningen från steg 3.2.4. Rör vid 4 ° c i 2 h.
   6. Tillsätt 250 μL av den delipidaterade HDL-lösningen från steg 3.1.4. Denna volym motsvarar en ungefärlig molar förhållande av 100 PC: 22 CO: 4.8 C:1 delipidated HDL-proteiner. Rör vid 4 ° c över natten.
3. Dialys
   1. Förkyla minst 15 L PBS vid 4 ° c. Tillsätt 50 g adsorbent pärlor till 800 mL dubbelt destillerat vatten (ddH₂O) och rör om i 1 min. vänta 15 min, Häll av supernatanten och upprepa proceduren med PBS.
   2. Prewet dialys kassetter (molekyl vikt cut-off: 20 kDa) eller lämpliga dialys rör och tillsätt lösningen från steg 3.2.6, med hjälp av en spruta enligt tillverkarens anvisningar.
   3. Tillsätt adsorbent pärlor från steg 3.3.1 till 3 L PBS och dialyze vid 4 ° c. Ändra bufferten och pärlorna efter 1 h och 2 h.
   4. Efter 24 h, återvinna den rekonstituerade HDL (rHDL) partikel lösning och bestämma protein koncentrationen med hjälp av Bradford analysen. Förvara rHDL-partikellösningen under inert gasatmosfär vid 4 ° c.

4. märkning av LDL-partiklar

1. Förbered 10x LDL-buffert (1,5 M NaCl, 3 mM EDTA, 1 mM etylenglykol-bis (β-aminoetyleter)-N, N, N ', N'-tetraättiksyra [EGTA, pH 7,4]) och förvara den i rums temperatur.
2. Förbered en fräsch 30 mM sperminlösning i RNase-fritt vatten. Blanda en alikvot (100 μL, 10 μM) syntetiskt miRNA (se steg 2,2) med 100 μL sperminlösning och inkubera i 30 min vid 30 ° c.
   Anmärkning: för negativa kontroll experiment, Ersätt miRNA och/eller spermine lösningen med samma volym 1x LDL-buffert.
3. Tillsätt 100 μL av DMSO till miRNA/spermine-lösningen från steg 4,2 och späd den ytterligare med 1,2 mL 1x LDL-buffert.
4. Späd ut LDL-partikellösningen till en slutlig koncentration på cirka 4 mg/mL med PBS och blanda 450 μL med 50 μL 10x LDL-buffert. Inkubera den för 10 min på isen.
5. Kombinera LDL-partikellösningen från föregående steg och miRNA/spermine/DMSO-lösningen (från steg 4,3) och inkubera den i 2 h vid 40 ° c.
6. Utför dialys liknande som beskrivs i avsnitt 3,3 och förvara den märkta LDL-partikellösningen i enlighet med detta.

5. kvalitets kontroll av rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar

Anmärkning: för kvalitets kontroll, diameter och allmän form av lipoproteinpartiklar kan bestämmas med hjälp av, till exempel, AFM eller elektronmikroskopi (EM). Här, HS-AFM används för att mäta storleks fördelningen av infödda/rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar.

1. Späd ut HDL/LDL-partikellösningen i PBS (1:100 – 1:1000) och inkubera den på nyklyvt glimmer i 5 min. För klyvning av glimmer¹², tryck tejp mot underlaget och ta bort de övre glimmer lagren genom att dra av tejpen.
   Anmärkning: beroende på det särskilda AFM-instrumentet, observations området och den initiala koncentrationen av partiklar måste utspädnings faktorn justeras för att observera enskilda partiklar.
2. Efter inkubation, skölj provet med PBS och utför HS-AFM avbildning i PBS och i gängnings läge med cantispakar med fjäderkonstanter k_cant ≪ 0,2 N/m. Det rekommenderas att använda skannings storlekar < 1 μm² och för att hålla bild krafterna så låga som möjligt.
3. Bestäm höjden på de avbildade partiklarna med avseende på glimmerytan med lämplig program vara.
   1. Ladda data till gwyddion (freeware), upptäcka partiklarna via korn analys (mark korn av tröskel) och ställa in tröskeln ovanför substratet bakgrund. Platta till bilden (ta bort polynom bakgrund) genom att välja alternativet undanta maskerat område .
   2. Exportera höjdvärdena för de upptäckta partiklarna (fördelning av olika korn egenskaper) och upprepa dessa steg för alla inspelade bilder. Utföra statistisk analys genom att antingen skapa histogram eller beräkna sannolikhets täthet funktioner av de erhållna partikel höjder.
4. Upprepa steg 5,1 – 5.3 med infödda samt rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar och jämföra de erhållna resultaten för att kontrol lera partikel kvalitet. Om du observerar skräp och/eller konglomerat ska du kassera provet.

6. cell kultur

1. Odla vid häftande celler enligt ett etablerat protokoll (t. ex. ldlA7-SRBI¹³) tills det når confluency.
   Obs: flera oberoende kammare beroende på antalet experiment (rekommenderas två kammare per experimentell inställning) och negativa kontroll experiment (rekommenderas är två kammare utan tillsats av lipoproteinpartiklar) behövs. Dessutom krävs två kammare för bestämning av cell nummer.
2. Tvätta försiktigt cellerna 3x med förvärmda Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS) för att ta bort cell skräp och täck cell lagret med en lämplig volym av serum fritt odlings substrat. Tillsätt en lämplig volym lipoproteinpartikellösning för att nå en slutlig koncentration av 50 μg/mL lipoproteinpartiklar. Inkubera vid 37 ° c och 5% CO₂ för 16 h.
   Obs: beroende på experimentell design och cellinjen måste inkubations tiden anpassas för att uppnå en tillräcklig (dvs. mätbar) ökning av den cellulära miRNA-nivån.
3. Tvätta försiktigt cellerna 3x med förvärmt (37 ° c) HBSS för att ta bort cell skräp/lipoproteinpartiklar och täck cell skiktet med en lämplig volym av serum fritt medium.
4. Bestäm cell tätheten med en lämplig metod (t. ex. hemocytometer, automatiserad cell räknare) i minst två oberoende kammare för att beräkna antalet celler i prov volymen från steg 6,3. Detta nummer används för normalisering.

7. miRNA extraktion från cell-och lipoproteinpartikelprover

Anmärkning: extraktion av miRNA från celler utförs med miRNA extraktionssats med följande modifieringar.

1. Cellprover
   1. Förkyla centrifugen till 4 ° c. Tillsätt 350 μL lyseringsreagens vardera till två kammare som innehåller celler. Som ett negativt kontroll experiment, Använd en kammare utan celler.
      Varning: Använd lämplig personlig skyddsutrustning och arbeta i en draghuv medan du hanterar Lys-reagens eftersom det innehåller fenol och tiocyanat.
   2. Vänta 3 – 5 min (beroende på cellinjen) för cell avlossning. Om det behövs, kontrol lera cell avlossning med brightfield mikroskopi. Poolinnehållet i de två kamrarna i ett 1,5 mL-rör.
   3. Använd en 20 G nål och en 5 mL spruta, homogenisera/störa provet 5x – 10x genom aspiration och inkubera i 5 min. Tillsätt 140 μL kloroform (CHCl₃), skaka kraftigt i 15 s och inkubera i 3 min.
   4. Centrifugera vid 12 000 x g i 15 min vid 4 ° c. Efteråt, sluta kyla centrifugen.
   5. Överför den övre vatten fasen till ett nytt 1,5 mL-rör; undvika fas blandning/kontaminering eftersom interfasen innehåller DNA och den undre fasen innehåller proteiner. Tillsätt 1,5 x volymen 100% etanol och blanda grundligt med pipettering.
   6. Placera en rotations kolumn i ett 2 mL samlings rör och tillsätt 700 μL av blandningen från steg 7.1.5. Centrifugera vid 8 000 x g i 15 s vid rums temperatur. Kassera genomflödet och upprepa detta steg med den resterande prov volymen.
   7. Kassera flödet genom och tillsätt 700 μL av den första tvättbufferten till rotations kolonnen. Centrifugera den vid 8 000 x g i 15 s vid rums temperatur.
   8. Kassera flödet genom och tillsätt 500 μL av den andra tvättbufferten till rotations pelaren. Centrifugera den vid 8 000 x g i 15 s vid rums temperatur. Upprepa hela detta steg en andra gång med 2 min centrifugering tid.
   9. Placera rotations kolonnen i ett nytt 2 mL samlings rör och centrifugera den med full hastighet i 1 min för att torka membranet.
   10. Placera rotations kolumnen i ett 1,5 mL samlings rör. Tillsätt 30 μL RNase-fritt vatten i mitten av membranet för eluering och centrifugera det vid 8 000 x g i 1 min. upprepa hela detta steg en andra gång med det första flödet genom som elutionslösning. Det omvända transkriptionssteget görs omedelbart efter extraktionen. i annat fall, förvara de extraherade miRNA-proverna vid-20 ° c.
2. Lipoproteinpartiklar
   1. Ställ in prov volymen med den lägsta protein koncentrationen på 100 μL (= maximal prov volym). Beräkna prov volymerna för de andra proverna enligt denna normalisering, omvänt till deras koncentration. För negativa kontroll experiment, Använd 100 μL RNase-fritt vatten.
      Obs: normalisering krävs inte men fören klar direkt jämförelse av resultat under qPCR steg och analys.
   2. Förkyla centrifugen till 4 ° c. Tillsätt 700 μL lysreagens till prov volymen i steg 7.2.1.
   3. Utför miRNA-extraktion enligt steg 7.1.3 – 7.1.10.

8. omvänd transkription

Anmärkning: omvänd transkription av miRNA utförs med hjälp av en omvänd transkription kit med följande modifieringar.

1. Tina kit reagenser och omvänd transkription primers på isen. Förbered följande Master mix i ett reaktions rör på is: 45,7 μL av RNase-fri H₂O, 16,5 μl av 10x omvänd transkription buffert, 11 μl av omvänd transkription enzym, 2,1 ΜL av RNase hämmare, och 1,7 ΜL av dNTP mix. Blanda försiktigt, inte virvel.
   Obs: skalan beror på prov mängden; här, det beräknas för 10 reaktioner.
2. Etikett 0,2 mL rör därefter och blanda 7 μL av masterblandningen från steg 8,1 med 5 μL av det extraherade provet från steg 7.1.10 och 3 μL av omvänd transkription primer. Blanda försiktigt, Centrifugera inom kort och förvara blandningen på isen.
3. Om du vill använda samma cell nummer för varje cellrad minskar du cell linjens samplings volym med ett högre totalt cell nummer. Använd detta som restvolym för att nå den totala prov volymen på 5 μL RNase-fritt vatten.
   Anmärkning: lipoproteinpartikelproverna är redan normaliserade i steg 7.2.1. För beredning av standard kurva, späd en alikvot av miRNA sekventiellt i RNase-fritt vatten och beräkna antalet trådar per prov volym. Obligatoriskt är minst fem data punkter inom intervallet för de resulterande provkvantifieringscykelvärdena (c_q). Vanligt vis är de totala utspädnings faktorerna mellan 10² och 10⁶ lämpliga.
4. Placera rören i termocyklermaskinen och starta följande program: 30 min vid 16 ° c (glödgnings steg), 30 min vid 42 ° c (omvänd transkription), 5 min vid 85 ° c (smält steg) och pausa vid 4 ° c (lagring). Utför qPCR-steget omedelbart efter omvänd transkription; Förvara annars det kompletterande DNA (cDNA) som syntetiserats från miRNA-proverna vid-20 ° c.

9. qPCR

1. Utför en qPCR av cDNA (omvänd transkriberad från miRNA) med hjälp av en kommersiellt tillgänglig analys (se material tabell) med följande modifieringar.
2. Tina alla reagenser (supermix, RNase-Free H₂O), cDNA prover (från steg 8,4), och primers på isen. Förbered följande mastermix i ett reaktions rör på is: 75 μl supermix, 47,5 μL RNase-Free H₂O, 7,56 μl primer. Blanda försiktigt, inte virvel.
   Obs: skalan beror på prov mängden; här, det beräknas för 10 reaktioner.
3. Märk 0,2 mL i enlighet med detta och tillsätt 2 μL av cDNA-provet till 13 μL av masterblandningen och blanda försiktigt. I allmänhet mäta varje prov 2x.
   Anmärkning: minst två negativa kontrollprover krävs dessutom – Använd RNase-fritt vatten som ett prov. Om kalibrerings kurvan inte bestäms i samma kör som provet, krävs också ett prov från mätningen av kalibrerings kurvan. Det används för att kalibrera varje enskild springa till samma reaktions effektivitet.
4. Placera rören i PCR-maskinen och starta följande program: 2 min vid 50 ° c, 10 min vid 95 ° c, 15 s vid 95 ° c och 60 s vid 60 ° c. Upprepa de sista två stegen i programmet upp till 50x.
5. För en analys av c_q värden med PCR-maskinens programpaket, aktivera Dynamictube normalisering (för ersättning av olika bakgrunds nivåer med hjälp av andra derivatan av varje prov spår) och brus lutning Korrigering (normalisering till ljud nivån).
   Anmärkning: c_q -värdet för den negativa kontrollen bör vara flera cykler högre än det högsta provet c_q -värdet.
   1. För en kalibrerings kurva analys, fastställa tröskeln för beräkning av c_q för varje Mirna från standard kurvor för varje Mirna individuellt, med hjälp av Auto-find tröskel funktion av mjukvaru paketet, och hålla det konstant för varje specifik miRNA.
   2. För prov analys, om nödvändigt, kompensera för olika reaktions verknings grad i prov körningen med data punkten från kalibrerings kurvans prov. Program varan beräknar c_q -värdena för proverna från tröskel nivån för respektive kalibrerings kurvans mätning.

10. beräkning av miRNA-innehåll

1. Kalibreringskurvan
   1. Beräkna, från det ursprungliga antalet miRNA-strängar per alikvot (100 μL på 10 μM miRNA, molekyl vikt från datablad) och efterföljande seriella utspädnings steg, antalet miRNA-strängar i prov volymen (5 μL prov volym från steg 8,3).
      Obs: förutsatt en omvänd transkription effektivitet 1, detta antal är lika med antalet cDNA-strängar.
   2. Beräkna antalet cDNA-strängar i prov volymen 2 μL från steg 9,3. Överväg därmed den extra utspädnings faktorn på 7,5 (2 μL prov volym från steg 9,4 från 15 μL prov volym från steg 8,4).
   3. Plotta c_q -värdet från steg 9.5.1 mot antalet trådar n-_strängar beräknat i steg 10.1.2 i en semilogaritmisk bas-10-kurva och passa in data punkterna med följande regressionskurva (M = lutningen på den linjära Regressions kurva, B = offset).
      
      Kontrol lera att korrelationskoefficienten (R²) för linjen är > 0,99.
2. Lipoproteinpartiklar
   1. Beräkna antalet miRNA-trådar per prov volym med det uppmätta provet c_q -värdet (steg 9.5.2) och följande ekvation (M och B är parametrarna för kalibrerings kurvan för den specifika Mirna).
      
   2. Beräkna motsvarande antal lipoproteinpartiklar i prov volymen, med början från volymen i steg 7.2.1 (100 μL), dess kända koncentration och efterföljande spädnings steg (100 μL-> 30 μL prov volym i steg 7.1.10-> 5 μL [utspädning 1:6] prov i den totala volymen på 15 μL i steg 8,4-> 2 μL [spädning 1:7.5] i steg 9,4). Anta en molekyl vikt på 250 kDa för HDL-partiklar och 3 MDa för LDL-partiklar och en 100% återhämtning av miRNA under miRNA extraktionssteg (ignorera någon lipid bidrag till molekyl vikt ger en liten överskattning av antalet miRNA strängar per lipoproteinpartikel).
   3. Dividera antalet miRNA-strängar från steg 10.2.1 med antalet partiklar som beräknats i föregående steg för att ge antalet miRNA-strängar per lipoproteinpartikel.
3. Celler
   1. Beräkna antalet miRNA-strängar per prov volym enligt steg 10.2.1.
   2. Beräkna motsvarande antal celler i prov volymen enligt steg 10.2.2, med början i den initiala cell nummer koncentrationen mätt i steg 6,4.
   3. Dividera antalet miRNA-strängar från 10.3.1 med antalet celler som beräknats i föregående steg för att ge antalet miRNA-strängar per cell.
   4. Beräkna upptag hastighet av lipoproteinpartiklar genom att dividera den totala mängden miRNA strängar från föregående steg efter korrigering för bakgrunden miRNA nivå av de celler som erhållits från ett negativt kontroll experiment med miRNA/partikel ratio (steg 10.2.3 ) och inkubations tiden (16 h, se steg 6,2).

11. multiwell mikroflödessystem arrayer

1. miRNA-extraktion
   1. Utför miRNA-extraktion enligt beskrivningen i steg 7.
2. Omvänd transkription
   1. Tina omvänd transkription primers, omvänd transkription kit komponenter, och MgCl₂ (25 mm) på isen. För åtta prover, blanda 8 μL av omvänd transkription primers (10x), 2,25 μL av dNTPs med dTTP (100 mM), 16,88 μL omvänt transkriptas (50 U/μL), 9,00 μL av 10x omvänd transkription buffert, 10,12 μL av MgCl₂, 1,12 μl av RNase hämmare (20 U/μl) och 1 μL nukleasfritt vatten.
   2. Blanda försiktigt och centrifugera en kort stund. Tillsätt 4,3 μL av den omvända transkriptionsreaktionen till 3,5 μL av den extraherade miRNA i ett rör och blanda, snurra ner och inkubera på is i 5 min. Placera rören i en termocyklermaskin och starta följande program: 16 ° c i 2 min, 42 ° c i 1 min , och 50 ° c i 1 s upprepad 40x totalt, och sedan, som stopp reaktion, 85 ° c i 5 min och håll vid 4 ° c tills stoppas.
3. Preamplificationen
   1. Tina primers på isen och Invertera och centrifugera kort. Blanda förförstärknings Mastermixen (2x) genom att snurra flaskan. Förbered förförstärknings reaktions blandningen enligt följande instruktion för åtta prover: 112,5 μL av förförstärknings Master Mix (2x), 22,5 μL av preamplifieringsprimers och 67,5 μL nukleasfritt vatten. Vänd och centrifugera en kort stund.
   2. Blanda 2,5 μL av produkten för omvänd transkriptionsreaktion från steg 11.2.2 med 22,5 μL av preamplifieringreaktionsblandningen från föregående steg och vänd och centrifugera en kort stund. Inkubera proverna på is i 5 min.
   3. Placera rören i en termocykelmaskin och inkubera vid följande inställningar: enzym aktivering vid 95 ° c i 10 min, glödgning vid 55 ° c i 2 min, som sträcker sig vid 72 ° c i 2 min, upprepad 12x: denaturering vid 95 ° c i 15 s och glödgning/förlängning vid 60 ° c i 4 min , enzym inaktive ring vid 99,9 ° c i 10 min och 4 ° c på håll.
   4. Snurra ner, tillsätt 7,5 μL 1x TE (pH 8,0) och 67,5 μL nukleasfritt vatten, Invertera och centrifugera en kort stund. Proverna kan förvaras vid-20 ° c i upp till 1 vecka.
4. qPCR
   1. Blanda masterblandningen genom att snurra flaskan. Förbered PCR-reaktionsblandningen för ett kort: 450 μL mastermix, 441 μL nukleasfritt vatten och 9 μL av förförstärknings provet från steg 11.3.4. Vänd och centrifugera en kort stund.
   2. Fyll på varje fyllnings behållare för multispot mikroflödessystem array-kort med 100 μl beredd PCR-reaktionsblandning enligt tillverkarens anvisningar och centrifugera 2x för 1 min vid 3 000 x g. Accelerationen under de två påföljande centrifugeringsstegen är viktig för korrekt fyllning av kortet. Försegla kortet enligt tillverkarens anvisningar.
   3. Använd ett PCR-system med följande program: enzym aktivering vid 95 ° c i 10 min och därefter, upprepad 40x: denaturering vid 95 ° c i 15 s och glödgning/förlängning vid 60 ° c under 1 min.
   4. Importera resultat filen från PCR-systemet och beräkna RQ-värden med hjälp av systemets program varu paket med följande analys inställningar: ett maximalt tillåtet c_q -värde på 40,0, Max c_q -värden i inkluderade beräkningar och avvikare bland replikat exkluderade. Aktivera Benjamini – Hochberg falsk upptäckt hastighet som alternativ för p-värde justering (korrigering av förekomsten av falska positiva identifieringar¹⁴) och global normalisering som normaliserings metod (med ett median värde för alla prover och ¹⁵).

Representative Results

Ett allmänt system av lipoproteinpartikel isolering
Figur 1 visar den allmänna ordningen av lipoproteinpartikel isolering från helblod, med sekventiell flotation ultracentrifugering¹⁶. Om så önskas, andra lipoprotein partikel fraktioner som VLDL och IDL partiklar kan skördas under detta protokoll. Den fasta vinkeln Titan rotor i kombination med polypropylen snabb tätning rör är lämplig för att motstå centrifugeringskrafterna. För att undvika att röret kollapsar är det viktigt att undvika luft bubblor i röret. Centrifugering sker vid 4 ° c för att minimera protein nedbrytning. Vanligt vis från plasma (60-80 mL per givare) av poolade blod donationer av tre frivilliga, en avkastning på LDL och HDL partikel lösnings volymer på 3 mL vardera med koncentrationer i intervallet 1-3 mg/mL kan förväntas. Hela proceduren, från blod donation, tog cirka 7 dagar.

I figur 1: Flödes schema med lipoproteinisolering. Centrifugera blod från friska frivilliga i vakuum behållare rör och samla plasma (övre fas). Efter justeringen av dess densitet till ρ = 1,019 g/ml med KBR Centrifugera lösningen vid 214 000 x g i 20 h vid 4 ° c. Efter justering av densiteten av botten fraktionen till ρ = 1,063 g/ml med KBR, Centrifugera lösningen igen vid 214 000 x g i 20 h vid 4 ° c. Förvara den övre fraktionen som innehåller LDL-partiklar tillfälligt vid 4 ° c. Efter justering av densiteten av botten fraktionen till ρ = 1,220 g/ml med KBR, Centrifugera lösningen två gånger vid 214 000 x g i 20 h vid 4 ° c. Samla in den övre fraktionen som innehåller HDL-partiklar, dialysera både HDL och LDL partikel lösningar och byta bufferten efter 1, 2, och 4 h. Efter 24 timmar, Bestäm protein koncentrationen och förvara proverna under inert gas vid 4 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Beredning av HDL-partiklar
Rekonstituering av HDL-partiklar utfördes enligt ett protokoll som tidigare publicerats av Jonas⁷. Det första steget var delipidation av HDL-partiklar som visas i figur 2A, följt av det andra steget av relipidation (dvs. beredning) som visas i figur 2b, med LIPIDPC, Co, och C utöver en blandning av Mirna och spermine. Vi valde mänskliga mogna miR-223 och miR-155 eftersom miR-223 visar ett högt överflöd och miR-155 är sällsynt i lipoproteinpartiklar¹⁷. Vanligt vis utförs båda stegen på två sekventiella dagar. Under beredning kan andra lipofila och/eller amfifila molekylers komponenter läggas till som önskas. Den kompletta avdunstning av etanol/dietyleter och metanol/kloroform lösnings medel av PC, CO, och C var kritisk. Det sista steget – som visas i figur 2C– var dialys förfarandet för att separera REKONSTITUERADE HDL-partiklar (rhdl) från fria lipider/Mirna/rengörings medel. Detta tog ytterligare 1-2 dagar. Tillsatsen av absorberande pärlor till dialys lösningen höll densitetsgradienten längs dialys membranet konstant. En avkastning på 50% av rHDL-partiklar kan förväntas.

Figur 2: Flödes schema för HDL-partikelberedning. A) delipidation: blanda HDL-partikellösningen med förkyld etanol/dietyleter och inkubera vid-20 ° c i 2 timmar. Efter kasse ring av supernatanten, omsuspendera pelleten och upprepa proceduren. Torka pelleten med N₂ gas och omsuspendera den i buffert A. Efter bestämning av koncentrationen, förvara det delipidaterade HDL under inert gasatmosfär vid 4 ° c. (B) beredning: efter blandning av fosfatidyl-kolin (PC), kolesterylestrar oleate (Co) och kolesterol (C), avdunsta lösnings medlet med N₂ gas medan du roterar röret. Inkubera miRNA-alikvot med sperminlösning i 30 min vid 30 ° c, tillsätt natriumdeoxycholat och resuspendera den torkade lipidfilmen. Rör provet i 2 h vid 4 ° c, tillsätt den delipidaterade HDL-lösningen och rör om provet igen, denna gång vid 4 ° c under inert gasatmosfär. Cdialys: överför lösningen från panel B som innehåller rekonstituerade HDL-partiklar (rhdl) till en dialys membran kammare (molekyl vikt cut-off: 20 kDa) och DIALYSERA mot PBS och absorberande pärlor vid 4 ° c. Växla bufferten och pärlorna efter 1 h och 2 h. Återställ rHDL-partikellösningen efter 24 timmar, Bestäm koncentrationen och förvara provet under inert gasatmosfär vid 4 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Märkning av LDL-partiklar
Märkningen av LDL-partiklar med miRNA (figur 3) som visades för HDL-partiklar var inte genomförbar på grund av hydrofobicitet av apob-100-proteinet, som är den viktigaste bestånds delen i LDL-partikeln. DMSO användes för penetration av lipidmonolayer av LDL-partikeln och därmed medierade miRNA föreningen. Hela förfarandet tog 1-2 dagar med en avkastning nära 100%.

Figur 3: Flödesschemat av LDL partikel märkning. Inkubera miRNA-alikvot med sperminlösning i 30 min vid 30 ° c och tillsätt DMSO och LDL-buffert. Inkubera LDL-prov med LDL-buffert för 10 min på isen och tillsätt miRNA/spermine/DMSO blandning. Efter inkubation vid 40 ° c i 2 timmar, överför lösningen till en dialys membran kammare (molekyl vikt cut-off: 20 kDa) och dialyze mot PBS och absorberande pärlor vid + 4 ° c. Växlingbuffert och pärlor efter 1 & 2 h. återvinna märkt LDL partikel lösning efter 24 h, bestämma koncentrationen och förvara under inert gas atmosfär vid + 4 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kvalitets kontroll av lipoproteinpartiklar
HS-AFM kan användas för att undersöka storlek och form av infödda och rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar på glimmer. Strax före användning, glimmer måste vara nycleaved (Använd tejp för att ta bort det övre skiktet [s]) för att ge en ren och plan yta. Vid inkubation av HDL/LDL-partiklar på glimmer måste utspädnings faktorn (och/eller inkubations tiden) justeras för att observera enskilda partiklar. Kluster tillåter inte bestämning av partikel dimensioner. HDL-partiklar är rörliga på glimmer. När du använder konventionella AFM istället för HS-AFM, måste immobilisering protokollet anpassas i enlighet med detta (buffert, ytbeläggning) för att minska den laterala partikel rörligheten. Vid skanning av provet måste bild kraften hållas låg (gängnings läge) för att undvika deformering av partiklarna, vilket därmed kommer att påverka de uppmätta värdena. För data analys upptäcktes partiklar via en tröskel algoritm (t. ex. i gwyddion: korn > märke efter tröskel) och deras höjd fastställdes med avseende på glimmerytan. Mätning av partiklarnas höjd är det mest exakta sättet att bestämma partikel storlekar, eftersom de skenbara laterala måtten breddas av spets formen (se exemplariska bilder i figur 4). Sannolikhetsdensitetsfunktioner (PDF) av partikel höjder beräknades för statistisk utvärdering och jämförelse av storleks fördelningar av de olika lipoproteinpartiklarna. En jämförelse mellan infödda och miRNA-märkta LDL-partiklar som visas i figur 4 gör det möjligt att verifiera den huvudsakliga likheten mellan märkta och icke-märkta (dvs. infödda) lipoproteinpartiklar (märkta LDL-partiklar utan tillsats av Mirna/ sperminblandningar visas som en kontroll för själva märknings förfarandet). Hela proceduren tog ungefär 1 dag.

Figur 4: flödes schema och representativa resultat för HS-AFM mätningar. Späd ut HDL/LDL-partikelprovet i PBS (1:10²-1:10³) och inkubera det på nyligen klyvs Mica i 5 min, följt av en noggrann sköljning med PBS för att avlägsna fria (inte elektrostatiskt adsorberade) partiklar. Utför HS-AFM-avbildning och kontrol lera partikel tätheten på ytan. Utför mätningarna i PBS vid rums temperatur. Den översta bilden av denna siffra visar en för hög partikel täthet; botten bilden är lämplig för analys. Höjden av enstaka partiklar analyserades efter tröskel innehav och Native (svart kurva) och rekonstituerade/märkta (röd och grön kurva) partiklar jämfördes i en statistisk utvärdering. Skalstapeln = 100 Nm. Denna siffra har modifierats från Axmann et al.¹⁹. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

miRNA-extraktion, omvänd transkription och qPCR
Utvinning av miRNA från infödda/artificiellt berikade lipoprotein eller cell prov utfördes med hjälp av en miRNA extraktion kit som visas i figur 5a. Härmed var en RNase-fri miljö kritisk. Detta steg tog cirka 1 h. omvänd transkription av det extraherade miRNA-provet (Figur 5b) utfördes med hjälp av standard biokemiska procedurer enligt tillverkarens beskrivning. Detta steg tog cirka 1,5 h. Slutligen bestämdes den mängd cDNA som erhölls under det sista steget med hjälp av qPCR (figur 5c). En standard kurva, som relaterar de erhållna c_q -värdena till det absoluta Mirna-strandnumret, gav den absoluta Mirna-halten i det ursprungliga provet. Detta tog ca 2,5 h.

Figur 5: flödes schema för miRNA-extraktion, omvänd transkription och qPCR. A) Mirna-extraktion: blanda provet med Lys-reagens och lysera det via aspiration med hjälp av en spruta. Inkubera i 5 minuter och tillsätt CHCl₃. Skaka kraftigt i 15 s och inkubera i 3 min. Efter centrifugering vid 1 200 x g i 15 min vid 4 ° c, samla upp den översta fasen och blanda den med etanol. Överför lösningen till en rotations kolumn (maximal volym < 700 μL) och centrifugera den vid 8 000 x g i 15 s. Kassera eluenten och upprepa det sista steget med resten av lösningen. Tillsätt den första tvättbufferten och centrifugera vid 8 000 x g i 15 s. Kassera eluenten, tillsätt den andra tvättbufferten och centrifugera vid 8 000 x g i 15 s. upprepa det sista steget med en centrifugeringstid på 2 min. Ytterligare torka membranet via centrifugering vid maximal hastighet i 1 min. eluera miRNA med H₂O och centrifugera vid 80 000 x g i 1 min. Förvara det extraherade Mirna-provet vid-20 ° c. (B) omvänd transkription: Tina 10x buffert, H₂O, dNTP mix, hämmare och enzym på isen och förbereda befälhavaren blandningen. Lägg till den extraherade miRNA från panel A till Master mix och omvänd transkription primer och utföra omvänd transkription med hjälp av en termocykler maskin. Förvara cDNA-provet vid-20 ° c. (C) QPCR: Tina Supermixen, H₂O, och primer på isen och Förbered Mastermixen. Lägg till cDNA från panel B till Mastermixen och utför QPCR. Analysera data för att erhålla c_q -värden och beräkna det absoluta Mirna-innehållet i provet (se figur 6 och de representativa resultaten för detaljer). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Absolut miRNA-innehåll och överföringshastighet
Den absoluta miRNA-halten av infödda och artificiellt berikade HDL-och LDL-partiklar beräknades utifrån proverna c_q och en standard kurva för respektive Mirna som visas i figur 6. Figur 6a visar data som beräknats av analys programmet (med aktive rad dynamictube normalisering [för ersättning av olika bakgrunds nivåer med hjälp av andra derivatan av varje prov spår] och brus lutning korrigering [normalisering till ljud nivån]). c_q värden av standard kurvor bestämdes med hjälp av Auto-find tröskel funktion av mjukvaru paketet på normaliserade fluorescens-signalen mätt med QPCR-maskinen. Program varan maximerar härmed R-värdet av standard kurvans pass form. Tröskel nivån hölls konstant för varje specifik miRNA-provanalys. Därefter plottas c-_q -värdena som en funktion av antalet Mirna-strängar och en Regressions linje beräknades. Prov c_q -värden fastställdes med samma tröskel nivå som visas i figur 6b. reaktions effektivitets skillnader mellan olika qPCR-körningar kompenserades automatiskt av program varan med hjälp av ett ytterligare kalibrerings kurv prov som ingick i varje körning. Med Regressions linje ekvationen kan den okända mängden miRNA i provet beräknas. Den lipoprotein partikel antalet beräknades från den initiala protein koncentrationen och dess genomsnittliga molekyl vikt (MW_HDL ~ 250 kDa). Därmed antogs inga lipidbidrag till molekyl vikten, vilket innebar att antalet miRNA-strängar per lipoproteinpartikel var något överskattat. Dessutom antogs en 100% återvinnings grad för miRNA under miRNA extraktionssteget. Dessutom fastställdes miRNA-halten i cellerna före och efter inkubationen med HDL-partiklar och miRNA-överföringshastigheten beräknades enligt figur 6C.

Figur 6: flödes schema för beräkning av det absoluta miRNA-innehållet och överföringshastigheten. Astandard kurva för mir-155: en miR-155 alikvot (100 μl, 10 μM) späddes med RNA-fritt vatten enligt anvisningarna. qPCR gav c_q värden för varje serie utspädning prov (mätt två gånger) med hjälp av Auto-find tröskel funktion av mjukvaru paketet. Negativa kontroll experiment (utan tillsats av miRNA) gav c_q -värden på > 35. Data punkter av c_q -värden som funktion av antalet Mirna-trådar per prov volym (beräknat från den initiala koncentrationen och de seriella utspädningar) var försedda med den presenterade ekvationen (röd linje, höger bild), vilket ger M =-3,36 och B = 42,12. Den bestämda PCR-effektiviteten var 0,98. Felstaplar beräknades från resultaten av experimentella repetitioner och var mindre än diametern på data punkt cirkeln. Bc_q -värdena för de infödda/artificiellt berikade HDL-partiklarna fastställdes med samma tröskel nivå som fastställdes i panel A och konverterades till antalet Mirna-strängar i QPCR-provvolymen. Det absoluta förhållandet mellan miRNA i det ursprungliga provet beräknades utifrån antalet (koncentrationen) av HDL-partiklar i prov volymen (3,2 x 10¹¹ partiklar). (C) cellprover (cellinjen LDLA7-srbi) inkuberades för 16 timmar med artificiellt BERIKADE HDL-partiklar (50 μg/ml) och analyserades på liknande sätt. De fastställda c-_q -värdena var 22,5, 22,5 och 19,3 endast för celler, för celler som inkuberats med inbyggt HDL eller för celler som odlas med rhdl-partikellösning (båda 50 μg/ml). Dessa värden konverterades till antalet miRNA-strängar som gjorts i panel B. Antalet miRNA-strängar efter inkubation (7,3 x 10⁶) korrigerades genom subtraktion av antalet Mirna-strängar före inkubation (8,6 x 10⁵). Resultatet delades av antalet celler i prov volymen (3 100), miRNA-Particle-kvoten (1,5 x 10^-4) och inkubations tiden (16 h). Detta gav överföringshastigheten av lipoproteinpartiklar via miRNA upptag (240 HDL-partikelupptagningshändelser per cell och sekund). Denna siffra har modifierats från Axmann et al.¹⁹. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Multiwell mikroflödessystem array
På grund av små avkastningar av miRNA-extraktion följdes omvänd transkription av den extraherade miRNA av ett preamplifieringssteg. Slutligen utfördes qPCR, som visas i figur 6. För alla steg användes standard biokemiska procedurer enligt tillverkarens beskrivning. Här, en del av den globala miRNA profilen på HDL-partiklar av uremiska patienter rekryterades för en studie om påverkan av CRF på kolesterol efflux från makro Fager¹⁸ visas. I denna studie, kolesterol tagaren kapacitet HDL eller serum i-förutom andra-17 unga vuxna uremiska patienter (CKD stadier 3-5) och 14 unga vuxna hemodialyspatienter utan tillhör ande sjukdomar och matchade kontroller mättes. För att analysera data användes standardinställningar (maximalt tillåtet CT-värde: 40,0, inklusive maximala CT-värden i beräkningar och exklusive avvikare bland replikat). P-värden justerades med hjälp av Benjamini-Hochberg falsk upptäckt frekvens (korrigering av förekomsten av falska positiva identifieringar), och som Normaliserings metod, Global normalisering valdes, som hittar den gemensamma analyser bland alla prover för att använda dess median värde för C_t för normalisering. I representativa resultat, vissa RQs av miRNAs isolerade från HDLs av uremiska patienter avbildas (RQs av kontroller är 1). Uppenbarligen, miR-122 och miR-224 är mycket uttrycks i HDLs av uremiska patienter. Hela detta steg tog ungefär 1 dag.

Figur 7: flödes schema och representativa resultat av multispot mikroflödessystem array. Efter miRNA extraktion som visas i figur 5a, blanda Mirna provet med omvänd transkription primer och en Master mix som innehåller 10x buffert, H₂O, dNTP mix, inhibitor, mgcl₂, och enzym. Efter inkubation på is i 5 min, utföra omvänd transkription med hjälp av en termocykler maskin. Tillsätt förförstärknings Mastermixen, Inkubera i 5 min på is och utför preamplifiering med hjälp av en termocyklermaskin. Tillsätt 0,1 x te (pH 8,0) och blanda en alikvot med PCR-mastermix och H₂O. Pipettera PCR-reaktionsblandningen i fyllnings porten på multispot mikroflödessystem array och snurra två gånger på 3 000 x g i 1 min vardera. Utför qPCR med ett PCR-system och analysera data för att ge RQ-värden (här visar figuren RQ-värden för HDL-partiklar av uremi-patienter jämfört med en frisk kontroll grupp¹⁸).  Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här beskrivs isoleringen av lipoproteinpartikelfraktioner från humant blod och bestämningen av deras individuella miRNA-innehåll steg för steg. Det är viktigt att arbeta i en RNase-fri miljö samtidigt hantera isolerade och syntetiserade miRNA-partikel-Embedded miRNA är uppenbarligen skyddad från enzymatisk nedbrytning. Eftersom miRNA/partikel förhållandet mellan infödda lipoproteinpartiklar är ganska låg, konstgjord berikning med miRNA krävs för att studera Holo partikel upptag av celler. Därmed, rekonstituering av HDL-partiklar som beskrivits tidigare⁷ modifieras för att införliva Mirna strängar. Dessutom, separation av lipid och protein fraktion under detta förfarande gör det möjligt för forskare att undersöka lipid-och proteinassocierade komponenter i lipoproteinpartikel¹⁹. På liknande sätt är märknings förfarandet för LDL-partiklar anpassat. Intressant, tillsatsen av spermine-en naturlig stabilisator av nukleotider-påverkade inte miRNA/partikel förhållandet. Det bör noteras att metoden i princip gör det möjligt att lägga till andra ämnen än miRNA inom en lipoproteinpartikel. Naturligtvis finns det en gräns när det gäller den fysiska storleken på ämnet baserat på den totala storleken på HDL (diameter: 5-12 nm) och LDL-partiklar (diameter: 18-25 nm).

När det gäller kvalitets kontroll av rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar, HS-AFM är en tillämplig metod för att karakterisera HDL/LDL-partiklar på den enda partikel nivå. I jämförelse med EM, det möjliggör kortare förberedelse tider och nästan fysiologiska förhållanden (våt, rums temperatur).

Tack vare sin inneboende känslighet och amplifiering är qPCR den metod som används för att detektera låga miRNA-koncentrationer. Alternativt, enkelmolekylen känslig fluorescensmikroskopi, som kan detektera även enskilda molekyler, skulle inte vara lämplig på grund av de låga koncentrationerna av, till exempel, fluorescensmarkerade märkt Mirna strängar per partikel. Sålunda, förhållandet mellan miRNA trådar per Native lipoprotein partikel har visat sig vara 10^-8. Konstgjord berikning ökar förhållandet med en faktor på 10 000, vilket underlättar uppskattningen av cellulär lipoproteinupptagningsförmåga (ingen signifikant skillnad detekteras med hjälp av infödda lipoproteinpartiklar ¹⁹). Den höga känsligheten hos qPCR gör det möjligt att bestämma denna upptagnings hastighet genom att mäta antalet miRNA-strängar efter inkubations tiden och förhållandet mellan miRNA och partikel. Det bör noteras att det beräknade värdet ignorerar cellulär nedbrytning och frisättning av miRNA och därmed utgör åtminstone en lägre gräns för lipoproteinpartikelupptagningsförhållandet.

I framtiden, metoden kan anpassas för att överföra farmaceutiska substanser (särskilt också lipofila sådana) i celler och korrelera deras biologiska effekt till den intracellulära koncentrationen (bestäms via upptag hastighet av lipoproteinpartiklar).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultracentrifuge	Beckman	Optima L-100 XP	Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge rotor	Beckman	TI 55.2	Lipoprotein isolation
Vacutainer (EDTA)	Becton Dickinson	366643	Lipoprotein isolation
Kaliumbromid	Sigma Aldrich	2110	Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tubes	Beckman	342414	Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tube sealer	Beckman	342428	Lipoprotein isolation
Sodiumchlorid	Carl Roth GmbH	P029.2	Lipoprotein isolation
EDTA	Fisher Scientific	D/0650/50	Lipoprotein isolation
Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k	Spectra	132700	Lipoprotein isolation
synthetic miRNA	microSynth	-	synthetic miRNA
TRIS buffer pH 7	Ambion	AM9850G	synthetic miRNA
TRIS buffer pH 8	Ambion	AM9855G	synthetic miRNA
sterile tubes	Carl Roth GmbH	ENE8.1	synthetic miRNA
Photometer	Eppendorf	Eppendorf Biophotometer	Bradford assay
Cuvette	Carl Roth GmbH	XK20	Bradford assay
Coomassie G-250 Stain	BioRad GmbH	161-0786	Bradford assay
Sodiumchlorid	Carl Roth GmbH	3957.1	Delipitation
EDTA	Fluka Analytical	03690-100ML	Delipitation
TRIS buffer pH 8.0	Ambion	AM9855G	Delipitation
Ethanol 100%	AustrAlco	Ethanol Absolut 99.9%	Delipitation
Diethyl ether	Carl Roth GmbH	3942.1	Delipitation
Centrifuge	Thermo Scientific	Multifuge X3R	Delipitation
Chloroform	Carl Roth GmbH	3313.1	Reconstitution
Methanol	Carl Roth GmbH	4627.1	Reconstitution
Phosphatidylcholine	Sigma Aldrich GmbH	P3556-25mg	Reconstitution
Cholesterol oleate	Sigma Aldrich GmbH	C-9253-250mg	Reconstitution
cholesterol	Sigma Aldrich GmbH	C8667-500mg	Reconstitution
glass tubes	Carl Roth GmbH	K226.1	Reconstitution
spermine	Sigma Aldrich GmbH	S3256-1G	Reconstitution
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer comfort	Reconstitution
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich GmbH	3097-25G	Reconstitution
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH	0955.2	Reconstitution
100µL micropipettes	Carl Roth GmbH	A762.1	Reconstitution
PBS	Carl Roth GmbH	9143.2	Dialysis
Amberlite XAD-2 beads	Sigma Aldrich GmbH	10357	Dialysis
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)	Thermo Scientific	66003	Dialysis
Syringe	Braun	9161406V	Dialysis
Syringe needle	Braun	465 76 83	Dialysis
EGTA	Carl Roth GmbH	3054.2	Labeling of LDL particles
DMSO	life technologies	D12345	Labeling of LDL particles
Atomic Force Microscope	RIBM	SS-NEX	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Muscovite Mica (V-1 Grade)	Christine Gröpl	G250-1/V1	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
AFM Cantilever	Nanoworld	USC-F1.2-k0.15	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Gwyddion 2.49	Czech Metrology Institute	http://gwyddion.net	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Chamber slides, Nunc Lab-Tek	VWR	734-2122	Cell culture
HBSS	Carl Roth GmbH	9117.1	Cell culture
Cell counter	Omni Life Science GmbH	Casy	Cell culture
miRNeasy Mini Kit	QIAGEN	217004	miRNA extraction
Centrifuge	Eppendorf	5415R	miRNA extraction
20G needle	Braun	Sterican 465 75 19	miRNA extraction
5ml syringe	Becton Dickinson	309050	miRNA extraction
PCR cabinet	Esco	PCR-3A1	Reverse Transcription
TaqMan Reverse Transcription Kit	Thermo Scientific	4366596	Reverse Transcription
Rnase-free water	Carl Roth GmbH	T143	Reverse Transcription
0.2 ml tubes	Brand	781305	Reverse Transcription
Centrifuge	Carl Roth GmbH	Microcentrifuge AL	Reverse Transcription
Thermocycler	Sensoquest	Labcycler	Reverse Transcription
TaqMan Primer	Thermo Scientific	-	qPCR
iTaq Universal probe supermix	BioRad GmbH	1725131	qPCR
PCR machine	Corbett	Rotor-Gene RG-6000	qPCR
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4366596	TaqMan Array
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1	Applied Biosystems	4399966	TaqMan Array
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems	4391128	TaqMan Array
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1	Applied Biosystems	4399933	TaqMan Array
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG	Applied Biosystems	4440040	TaqMan Array
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards	Applied Biosystems	A31805	TaqMan Array
Nuclease-free water	Thermo Scientific	R0581	TaqMan Array
MgCl2 (25mM)	Thermo Scientific	R0971	TaqMan Array
TE, pH 8.0	Invitrogen	AM9849	TaqMan Array
7900HT Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4351405	TaqMan Array
TaqMan Array Card Sealer	Applied Biosystems	-	TaqMan Array