Summary
O objetivo deste protocolo é demonstrar técnicas de necropsia seguras em animais pequenos e grandes para obter amostras de tecido satisfatórias para o teste de raiva.
Abstract
O laboratório de raiva do departamento de saúde de Nova York (NYSDOH) recebe entre 6.000 a 9.000 espécimes anualmente e realiza testes de raiva para todo o estado, com exceção da cidade de Nova York. Os necropsias do laboratório da raiva uma variedade de animais que variam no tamanho dos bastões aos bovids. A maioria destes espécimes são animais exibindo sinais neurológicos, no entanto, menos de 10% realmente teste positivo para a raiva; implicando trauma, lesões ou outros agentes infecciosos como a causa destes sintomas. Devido ao risco de aerosolizar agentes infecciosos não diagnosticados, o laboratório da raiva não utiliza ferramentas elétricas ou serras. Três técnicas de necropsia serão apresentadas para animais cujos crânios são impenetráveis com tesouras. O laboratório implementou essas técnicas para diminuir a exposição potencial a agentes infecciosos, eliminar a manipulação desnecessária da amostra e reduzir o tempo de processamento. As vantagens de uma técnica preferida oposto a outra estão sujeitas ao indivíduo treinado que processa o espécime.
Introduction
Trabalhar no assoalho do necropsia de um laboratório da raiva é inerentemente perigoso. Às vezes, os espécimes chegam com os Quills incorporados do porco-espinho, objetos extrangeiros que incluem setas/balas/pelotas ou fragmentos de osso expor que podem penetrar o envoltório protetor do transporte. O empacotamento impróprio pode conduzir ao escapamento, pondo em perigo indivíduos que desempacotam espécimes. Além do que ferimento físico, os técnicos do necropsia arriscam a exposição aos agentes infecciosos zoonóticos desconhecidos do CNS e dos líquidos de corpo dos espécimes. Adicionalmente, os ectoparasitas transportados pelo espécime podem transmitir outras doenças zoonóticas, pois as pulgas e carrapatos são comumente observadas em animais submetidos. Dependendo da localização geográfica e das espécies envolvidas, as doenças expostas variam. Arbovírus, como o vírus da encefalite eqüina Oriental (EEEV) ou o vírus do Nilo Ocidental (WNV), doenças transmitidas por carrapatos, incluindo doença de Lyme ou tularemia, bactérias que causam febre Q ou tuberculose, e os priões infecciosos nomeam um pequeno número dos possíveis perigos1 , 2. º , a 3.
O objetivo destes métodos é demonstrar técnicas de necropsia seguras e eficientes usando instrumentos que minimizam o potencial de aerosolização ao contrário de ferramentas elétricas ou serras4,5. Comumente, a necropsia de pequenos animais no laboratório de raiva requer o corte dos músculos cranianos e o uso de martelo e cinzel para abrir a porção dorsal caudal do calvarium6. Remover esta área do calvarium expõe o cérebro traseiro, incluindo o cerebelo inteiro e a haste de cérebro craniana. Técnicas de necropsia modificadas podem ser realizadas na parte ventral do crânio, evitando os grandes músculos cranianos e regiões mais grossas do crânio. Entretanto, estas técnicas modificadas do necropsia são somente possíveis quando o espécime é sem vértebras cervicais.
Da mesma forma, o tecido cerebral em grandes animais pode ser removido separando os músculos cranianos e abrindo a porção dorsal caudal do crânio7. Um esforço considerável é exigido para expor o cerebelo e o tronco de cérebro porque os crânios de animais maiores são geralmente mais grossos. Para evitar penetrar no crânio, a cabeça de um animal grande é posicionada para que a porção ventro-caudal do crânio esteja voltada para o técnico. Usando instrumentos modificados, o cerebelo e o tronco encefálico são removidos através do forame Magnum. Isto é semelhante ao método de aquisição da amostra recomendado pelo laboratório de referência da União Europeia TSE para investigações de encefalopatia espongiforme transmissível (TSE)8. As vértebras cranianas devem ser removidas de antemão para fornecer acesso ao forame Magnum.
A aplicação destas técnicas é benéfica para técnicos adequadamente treinados em laboratórios de raiva. Enquanto o laboratório da raiva recebe amostras de vários tamanhos, dos bastões juvenis aos cavalos de esboço adultos9, o técnico tem diversos métodos a escolher de baseado na circunstância individual. O método demonstrado para um grande animal também é apropriado para os veterinários que realizam necropsias no campo, uma vez que o transporte de uma cabeça grande animal inteiro para o teste de raiva é complicado e caro. A implementação de qualquer uma dessas técnicas irá melhorar a segurança, diminuindo o potencial de produção de aerossóis, reduzir o manuseio da amostra e economizar tempo de processamento. No entanto, como o campo não tem as mesmas vantagens que um laboratório criado específico para o teste de raiva, é essencial que quaisquer modificações feitas nesses procedimentos se concentrem na segurança, especialmente no uso de equipamentos de proteção individual (EPI).
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Protocol
Todos os métodos descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais do centro Wadsworth (IACUC).
1. preparação
- Don PPE, com proteção ocular mínima (óculos ou escudo facial), máscara cirúrgica ou N-95 e luvas sem látex.
- Prepare a área de trabalho, idealmente um gabinete de biossegurança (BSC), com uma cobertura de superfície de trabalho descartável (por exemplo, papel kraft ou almofadas absorventes) e instrumentos de necropsia limpos (Figura 1).
- Coloque o espécime na superfície de trabalho e use instrumentos para manipulá-lo para avaliar a condição da amostra, incluindo evidências de decomposição, danos ao crânio, perigos potenciais (por exemplo, Quills de porco-espinho, lâminas de bisturi) e a qualidade da decapitação.
2. método ventral
Nota: quando o espécime é decapitado corretamente na linha da mandíbula, o forame Magnum e o côndilo occipital serão expostos. O método ventral é menos complicado para recuperar o cerebelo e o tronco cerebral.
- Posicione a amostra com o lado ventral para cima e o nariz dirigindo distalmente em direção à parte de trás do BSC.
- Segure um martelo ortopédico/malho na mão direita (se destro) e ao mesmo tempo segurar um formão vereadores na mão esquerda.
- Posicione o cinzel em um ângulo de 45 ° com o ponto de canto do cinzel que dirige entre o lado direito do osso temporal e do osso occipital que faz uma abertura de "V".
- Bata o topo do cinzel com o martelo até que os dois ossos separados. Faça o corte ao adjacente ao osso basisfenóide.
- Repita no lado esquerdo do osso temporal/osso occipital (Figura 2a).
- Dobre a área "V" do crânio para baixo com o cinzel. Expor toda a área de rombencéfalo do cérebro (cerebelo e tronco encefálico) (Figura 2b).
- Retire o tronco cerebral e cerebelo com tesouras e fórceps. Retire todas as peças restantes do crânio se o tronco cerebral e cerebelo não saiu em uma única peça.
3. método dorsal
Nota: se a amostra tiver uma decapitação fraca (forame Magnum não visível) e o pescoço não puder ser facilmente removido durante a necropsia ou se houver suspeita de dano ao cerebelo, o método dorsal deve ser utilizado.
- Posicione o espécime dorsalmente com o nariz dirigindo distalmente em direção à parte de trás do BSC.
- Usando o tenacula do tumor, segure o músculo temporal esquerdo com os dentes do tenacula e trave apertando o punho.
- Corte o músculo temporal para baixo ao osso com a faca de cinzeladura afiada.
- Gire o espécime 180 ° com tenacula e faca (não mão) e repita o processo no músculo temporal oposto. Expor o crânio.
- Posicione um cinzel em um ângulo de 45 ° com o ponto de canto do cinzel no centro do crânio na conjuntura do osso parietal e sulco.
- Bata a parte superior do cinzel com um martelo até que uma abertura horizontal seja feita na metade superior do crânio no osso parietal.
- Gire o espécime 180 ° e repita o processo no lado oposto.
- Insira o ponto do cinzel na extremidade do corte 1 (Figura 3a) e a 90 ° de abertura horizontal. Golpeie com o martelo até que a abertura alcangue o osso occipital (aproximadamente 10 cm dependendo em cima do tamanho do espécime).
- Enrole o espécime e repita no lado oposto no final do corte 2.
Nota: com a amostra dorsal e nariz posicionado em direção à parte de trás do BSC, as aberturas no crânio se assemelham a um "U" de cabeça para baixo. - Insira os dentes da tenacula no crânio na parte inferior do "U" e levante-se para si mesmo. Expor a extremidade caudal do encéfalo e do cerebelo (Figura 3B).
- Use a tesoura como uma colher e retire o cerebelo inteiro de dentro da cavidade.
- Use fórceps de tecido para provocar o tronco cerebral do forame.
4. grande método animal
- Posicione a amostra de modo que a parte dorsal do crânio esteja em contato com a superfície da necropsia com a porção caudal do crânio e o forame Magnum voltado para o técnico.
- Insira a faca de estilete modificada no forame Magnum entre a medula espinhal e as meninges espinhais na medida do possível.
- Pontuação em torno da medula espinhal para separar o cerebelo e tronco cerebral das meninges da coluna vertebral. Depois que a faca é inserida através do forâmen Magnum, suavemente o ângulo da faca para seguir ao longo do crânio, tanto quanto possível.
- Insira uma espátula química ou uma colher fina e longa no espaço entre o tecido neural e as meninges espinhais.
- Sonda em torno da medula espinhal e cerebelo para garantir a conexão com as meninges da coluna vertebral foram cortados.
- Segure o tronco cerebral com fórceps. Com a outra mão, avance a colher rostralmente então dorsalmente para colher acima do cerebelo. Puxe simultaneamente para trás na haste de cérebro com o fórceps e retire o cerebelo usando a colher.
Nota: pode demorar mais do que uma tentativa de recuperar cerebelo adequado para o teste de raiva.
5. pós necropsia
- Elimine todos os materiais descartáveis (luvas, almofadas, revestimentos de área de trabalho) e os tecidos não utilizados em resíduos bioperigosos.
- Limpe e desinfete todos os instrumentos com o método disponível (por exemplo, máquina de lavar louça industrial, autoclave, desinfetante químico, ebulição).
- Limpe e desinfete todas as superfícies de trabalho com 20% de lixívia e/ou 70% etanol.
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Representative Results
Todas as amostras terrestres submetidas com crânios entre 31 de janeiro de 2019 e 28 de fevereiro de 2019 tiveram informações sobre a presença de um pescoço e o método de necropsia coletado. Durante esse tempo, 170 cabeças foram necropsiadas com 18 espécies representadas. 52% (89/170) foram Decapitated corretamente. O restante teve pelo menos uma vértebra unida que inclui três espécimes inteiros do corpo. Utilizou-se o método ventral 75% (128/170) do tempo, dos quais os pescoços estavam presentes em 49. Os espécimes submetidos com um pescoço tê-lo-ão removido durante o necropsia para permitir o método ventral sempre que possível. Três grandes animais (vaca, veado, porco) foram submetidos e, em dois casos, utilizou-se o grande protocolo animal. O protocolo animal grande não foi usado no porco porque as amostras extra do tecido de cérebro foram exigidas para o teste adicional. Um esquilo foi submetido com um crânio esmagado e simplesmente cortando o tecido cerebral exposto à pele, portanto nenhum dos métodos acima foi utilizado (tabela 1).
Em submissões intactas frescas, todos os três métodos conduzirão com o tecido exigido para resultados de teste diagnósticos de confiança da raiva. Ocasionalmente, o cerebelo e o tronco cerebral não podem ser removidos intactos, embora após a remoção de todo o tecido do rombencéfalo estes tecidos podem ser identificados e processados em conformidade.
Estes três métodos valiosos não podem compensar a qualidade pobre do espécime causada antes do recibo no laboratório. Trauma, decomposição e maus métodos de decapitação podem afetar o desfecho independentemente de quão eficientemente as amostras são coletadas.
Figura 1: instrumentos utilizados na necropsia da raiva. Curva afiada-Blunt Mayo tesoura, liso-derrubado tecido curativo fórceps sem dentes, vereador ortopédico osso cinzel, ortopédico malho-martelo, bloqueio tumor-tenacula, restaurante-qualidade escultura faca, modificado estilete faca, química colher, e colher de sopa afiada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: método ventral de necropsia. (A) localização dos cortes: Coloque o ponto de um cinzel na base da seta, corte na direção da seta verde e repita seguindo a seta amarela formando um "V" ao redor do forame Magnum. Levante "V" para expor o tronco cerebral e cerebelo. (B) tronco encefálico (verde) e cerebelo (azul) quando expostos usando o método ventral de necropsia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: método dorsal da necropsia. (A) localização dos cortes: Coloque o ponto de um cinzel na base da seta e corte na direção da seta na ordem notável formando um "U". Levante "U" para baixo para expor o cerebelo com o tronco cerebral abaixo dele. (B) cerebelo (circulado) quando exposto utilizando o método dorsal. A haste de cérebro encontra-se diretamente abaixo e não é visível até que o cerebelo esteja removido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécie | vértebras anexado | método utilizado V = ventral, D = dorsal, LA = animal grande | Total | Comentários |
| Urso | Não | V | 2 | |
| Gato | Não | V | 32 | |
| Gato | Não | D | 3 | 2 pequeno o suficiente para abrir o crânio com tesouras, 1 tinha Abcess que estava sendo investigado expondo parte superior do crânio |
| Gato | Sim | V | 11 | |
| Gato | Sim | D | 8 | |
| vaca | Não | LA | 1 | |
| Coiote | Não | V | 1 | |
| Coiote | Sim | V | 2 | |
| Coiote | Sim | D | 3 | |
| Veado | Não | LA | 1 | |
| Cão | Não | V | 19 | |
| Cão | Não | D | 3 | |
| Cão | Sim | V | 2 | 1 era pequeno cão |
| Cão | Sim | D | 18 | |
| Ferret | Não | V | 1 | |
| Fisher | Não | V | 1 | |
| esquilo voador | Sim | D | 1 | corpo inteiro |
| (França) | Não | V | 2 | |
| (França) | Sim | V | 4 | |
| Porco | Sim | V | 1 | |
| Porcupine | Não | V | 1 | |
| Guaxinim | Não | V | 16 | |
| Guaxinim | Não | D | 1 | Congelado |
| Guaxinim | Sim | V | 26 | |
| (França) | Não | V | 2 | |
| Skunk | Não | V | 1 | |
| Skunk | Sim | V | 3 | |
| Esquilo | Não | V | 1 | |
| Esquilo | Sim | D | 1 | corpo inteiro, crânio esmagado, tesouras usadas para cortar a pele afastado à cavidade exposta do cérebro |
| Weasle | Não | D | 1 | |
| Marmota | Sim | D | 1 | corpo inteiro |
| Total | 170 | |||
| Repartição do total | ||||
| com pescoço | 81 | |||
| sem pescoço | 89 | |||
| método ventral | 128 | |||
| método dorsal | 39 | |||
| método animal grande | 2 | |||
| outro método | 1 | |||
| método ventral com pescoço | 49 |
Tabela 1: repartição de espécimes que necessitaram de remoção tecidual do crânio submetido de 31 de janeiro de 2019 a 28 de fevereiro de 2019 no laboratório de raiva da saúde do estado de Nova York.
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Discussion
Espécimes submetidos à necropsia da raiva muitas vezes têm uma história de sinais clínicos compatíveis com uma doença neurológica. A presença de doença clínica pode estar associada a uma variedade de distúrbios, incluindo doenças zoonóticas, aumentando o risco para a equipe de um laboratório de infecção adquirida. Para reduzir esses riscos, foram implementadas técnicas que diminuem o manuseio e a manipulação de espécimes.
Os métodos demonstrados representam um evento de necropsia para remover os tecidos desejados de um único animal. Mais comumente, vários espécimes são processados em um turno e cuidados são necessários para garantir nenhuma contaminação cruzada entre as amostras. Uma superfície de trabalho limpa (papel Kraft descartável ou almofadas), um novo conjunto de instrumentos limpos, desinfectados e mudanças de luva são obrigatórios. Uma vez que os tecidos são obtidos, o protocolo do laboratório individual para o processamento pode ser seguido, incluindo fazer corrediças para a microscopia ou a extração do RNA para métodos moleculars.
Existem vários pré-requisitos essenciais para a implementação bem-sucedida dessas técnicas no laboratório ou no campo. A vacinação prévia contra a raiva e o PPE são críticos para qualquer um que necropsying um animal suspeito da raiva. Os indivíduos que trabalham em laboratórios de raiva devem ter seu soro testado a cada seis meses para garantir um nível adequado de anticorpos antirrábica estão presentes10. É importante lembrar que outras doenças zoonóticas, como eeev, WNV e encefalopatia espongiforme bovina (BSE), apresentam sinais semelhantes como raiva e também podem ocorrer em animais suspeitos de raiva11,12.
Os instrumentos bem conservados apropriados são essenciais para executar com segurança o Necropsy. Uma vez que um espécime foi removido de seu saco do Biohazard, deve somente ser manipulado com os instrumentos, não as mãos, para diminuir o potencial para acidentes. Antes da necropsia animal pequena, o técnico deve avaliar a condição do espécime para determinar se uma aproximação ventral preferida através da base do crânio é possível. Com animais grandes pode ser demasiado complicado avaliar inteiramente a condição do espécime como as vértebras adicionais podem precisar de ser removidas antes de recuperar o tecido através do Magnum do forâmen.
As limitações apresentam-se em todas as técnicas do necropsia que incluem a condição do espécime, a qualidade do tecido e a quantidade de vértebras cervicais permanecendo. As vértebras cervicais não afetarão os resultados da análise da raiva, mas o tecido severamente decomposto pode resultar em resultados insatisfatórios. Métodos moleculares mais sensíveis no diagnóstico de raiva podem permitir testes bem-sucedidos em determinadas amostras incapazes de ser testadas por ensaio de anticorpo fluorescente direto (DFA), incluindo espécimes severamente decompostos13. Entretanto, nenhuma quantidade de sensibilidade pode substituir a necessidade para a amostragem apropriada do tecido.
Um problema comum no laboratório da raiva está recebendo o tecido cerebral inadequado ou inadequado para o teste quando grandes necropsias animais são executados no campo. Sem o tecido necessário, e se os tecidos adicionais não estão disponíveis para reenvio, o nosso laboratório de raiva irá realizar testes no tecido disponível, mas é incapaz de verificar o espécime negativo, em vez disso, é insatisfatório para o teste. Existem outros métodos publicados para coleções de tecidos de campo, como o método de palha ou a rota orbital retro14. Ambos os métodos coletam o tecido cerebral sem a necessidade de abrir o crânio. Uma palha ou pipeta descartável é introduzida através do Magnum do forâmen ou de um furo criado no soquete do olho e empurrado através do cérebro, tomando essencialmente uma amostra do núcleo e não necessariamente provando a seção transversal cheia da haste de cérebro. Como esses métodos de campo não coletam amostras de forma a serem consideradas satisfatórias para testes em nosso laboratório, esses processos não são demonstrados ou explorados neste artigo.
No campo grande necropsia animal pode ser desafiador para indivíduos que não são treinados para remover o tecido correto para o teste de raiva. Em vez disso, toda a cabeça do animal, que pode pesar entre 20-45 kg, é submetida a criação de um transporte pesado para o veterinário de campo e técnicos de laboratório de raiva. Os pedidos freqüentes para o treinamento na grande técnica animal do necropsia foram feitos a nosso laboratório. O objetivo deste manuscrito é distribuir essas informações a indivíduos e grupos cujo trabalho possa se beneficiar dessas técnicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Estamos gratos ao departamento de estado de saúde de Nova Iorque Wadsworth Center para apoiar este projeto. Nós também gostaríamos de reconhecer o apoio de Amy Willsey e Frank Blaisdell do departamento de saúde Wadsworth Center, e LL Ranch, Altamont, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemistry spoon | Any | ||
| Curved, sharp-blunt mayo scissors | Sklar | 14-2055 | Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt |
| Large sharp restaurant-quality carving knife | Dexter | P94848 | 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Locking tumor-tenacula | Diamond Scientific and Surgicals | N/A | Czerny Tenaculum Forcep |
| Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) | Dexter | P94848 | Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Orthopedic mallet-hammer | Mortech | N/A | Postmortem hammer with hook |
| Sharp councilman orthopedic bone chisel | Shandon | 60-5 | Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in |
| Sharpened tablespoon or other long handled spoon | Any | ||
| Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth | Shandon | 63-03 | Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps |
| Powder-free non-latex gloves | Any | ||
| Safety glasses, goggles, or faceshield | Any | ||
| Surgery or N-95 mask | Any | ||
| Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc | Any |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). West Nile virus activity - United States, 2009. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 59 (25), 769-772 (2010).
- McDaniel, C. J., Cardwell, D. M., Moeller, R. B. Jr, Gray, G. C. Humans and cattle: A review of bovine zoonoses. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 14 (1), 1-19 (2014).
- Spickler, A. R. Zoonotic diseases. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/public-health/zoonoses/zoonotic-diseases (2019).
- Wenner, L., Pauli, U., Summermatter, K., Gantenbein, H., Vidondo, B., Posthaus, H. Aerosol generation during bone-sawing procedures in veterinary autopsies. Veterinary Pathology. 54 (3), 425-436 (2017).
- Green, F. H. Y., Yoshida, K. Characteristics of aerosols generated during autopsy procedures and their potential role as carriers of infectious agents. Applied Occupational and Environmental Hygiene. 5 (12), 853-858 (1990).
- Barrat, J. Simple technique for the collection and shipment of brain specimens for rabies diagnosis. Laboratory techniques in Rabies 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , World Health Organization. 425-427 (1996).
- Ness, S. L., Bain, F. T. How to perform an equine field necropsy. American Association of Equine Practitioners. 55, 313-316 (2009).
- Animal & Plant Health Agency. Sample requirements for TSE testing and confirmation – EURL guidance. , Available from: https://protect2.fireeye.com/url?k=09f00f8d-55d40ec4-09f2f6b8-0cc47aa8d394-3f805f032cc98df8&u=https://science.vla.gov.uk/tse-lab-net/documents/tse-oie-rl-samp.pdf (2019).
- New York State Department of Health, Wadsworth Center. Rabies reports. , Available from: https://www.wadsworth.org/programs/id/rabies/reports (2019).
- CDC. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing: A minimum standard for rabies diagnosis in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Miller, L. D., Davis, A. J., Jenny, A. L., Fekadu, M., Whitfield, S. G. Surveillance for lesions of bovine spongiform encephalopathy in U.S. cattle. Developments in Biological Standardizations. 80, 119-121 (1993).
- Andrews, C., Gerdin, J., Patterson, J., Buckles, E. L., Fitzgerald, S. D. Eastern equine encephalitis in puppies in Michigan and New York states. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 30 (4), 633-636 (2018).
- Appler, K., Brunt, S., Jarvis, J. A., Davis, A. D. Clarifying indeterminate results on the rabies direct fluorescent antibody test using real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Public Health Reports. 134 (1), 57-62 (2019).
- Chapter 7. Brain removal. Laboratory techniques in Rabies 5th Edition. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. , World Health Organization. 67-72 (2018).
