Summary
提出了一种从分散的人类胰岛细胞中产生基因修饰的人类伪胰岛的函数,这种细胞由携带短发核糖核酸(shRNA)的慢病毒转导。该协议利用现成的酶和培养容器,易于执行,并产生适合功能和形态学研究的转基因人类假岛。
Abstract
各种基因工具可用于调节啮齿动物胰腺胰岛的基因,以解剖胰岛基因的功能,用于糖尿病研究。然而,由于物种之间在胰岛结构和功能方面众所周知的差异,从啮齿动物胰岛获得的数据往往不能完全复制或适用于人类胰岛。目前,可用于操纵人类胰岛基因表达的技术非常有限。腺病毒、质粒和寡核苷酸将转基因引入完整胰岛,往往效率低、毒性高。低效率在完整小岛的基因调控研究中尤其成问题,需要高效率。众所周知,酶分散的胰岛细胞在培养中重新聚合,形成称为伪胰岛的球状体。大小控制的人类胰岛细胞的再聚合产生伪胰岛,在长期培养后维持动态第一阶段胰岛素分泌,并提供一个窗口,以有效引入低毒性的慢病毒短发针RNA(shRNA)。这里,描述了使用两个市售的多孔板在慢病毒转导后创建人类伪小岛的详细方案。该协议可以很容易地执行,并允许有效地降低基因和评估使用人类小岛细胞的胰岛素分泌活力。因此,具有慢病毒介导基因调制的人类伪胰岛为评估人类胰岛细胞内的基因功能提供了一个强大而通用的模型。
Introduction
功能β细胞质量的丧失是1型和2型糖尿病1的中心病理学。虽然β细胞是胰腺胰岛胰岛素的产生者,但β细胞和非β细胞之间的通信在调节胰岛素分泌2方面起着至关重要的作用。此外,胰高血糖素分泌不良导致糖尿病高血糖3。因此,对胰腺胰岛内细胞的基因表达进行调节,以解决糖尿病胰岛功能障碍发展背后的机制有着浓厚的兴趣。包括转基因小鼠在内的各种方法可用于调节小鼠胰岛的基因表达。然而,人类和小鼠胰岛表现出明显的内向、细胞分布、β与α细胞的比例以及对分泌细胞4的响应。因此,直接评估人类胰岛的基因功能对于理解人类胰腺胰岛的病理生理学具有极其重要的作用。
腺病毒载体是体外转胰腺胰岛应用最广泛的病毒载体,因为非分裂细胞的转导效率很高。然而,腺病毒不能有效地渗透到胰岛的核心,特别是在人类胰岛5,并且在高剂量6细胞毒性。相比之下,慢病毒载体的细胞毒性较小,将外源基因永久地输送到后线细胞的染色体中,使其成为基因治疗7的广泛测试载体。然而,扁豆病毒穿透完整人类胰岛核心的能力也有限,因此需要通过酶消化进行部分分散,以提高转导效率8。完整人类胰岛分散的注意事项是细胞-细胞和细胞基质通信的中断,这损害了胰岛素分泌的动态调节,这对维持人类葡萄糖平衡至关重要9。因此,在人类胰岛模型中评估基因调制对胰岛功能动态调节的影响一直具有挑战性。
众所周知,人类和啮齿类小岛的分散胰岛细胞可自主地重新聚合成称为"伪胰岛"的胰岛状结构。伪胰岛显示β和非β细胞分布类似于原生小岛10,11。此外,经过长期培养后,原生胰岛逐渐失去强大的第一期胰岛素分泌5,10,11,12。然而,与同一文化期5之后的本地小岛相比,伪胰岛在葡萄糖反应下,第一阶段胰岛素分泌的保存效果更好。除了更好地保存胰岛素分泌外,在低附着板11中控制人体小岛细胞的重新聚集,为在将扁病毒载体重新聚集到其中提供了一个机会之窗伪小岛。几项研究已经证明了伪胰岛结合扁病毒介导转导的效用。Caton等人13日报告说,与未感染对照相比,引入表达慢病毒的绿色荧光蛋白(GFP)对胰岛素分泌作用甚微,同时实现大鼠伪胰岛体内GFP的同质表达。他们还通过慢病毒13过度表达康奈辛32、36和43,证明了不同康奈辛对胰岛素分泌的具体作用。用市售的96孔超低附着板制备的人类伪胰岛证明,经慢病毒介导的转录因子SIX3的过度表达可改善静态孵育评估的胰岛素分泌。最近,用96孔超低附着板制备的人类伪胰岛通过慢病毒短发针RNA(shRNA)降低调节葡萄糖素酶,以证明其原理,表明葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少,同时KCl刺激胰岛素分泌保存5。研究还表明,人类伪胰岛在基因表达和分泌谱方面与原生胰岛相似,进一步支持了人类伪胰岛对胰岛功能5的调节的效用。虽然没有进行围产,但最近上市的生物工程微孔培养板也报告与慢病毒转导相容,并产生了具有优秀胰岛素的人类假小岛移植后体外和体内分泌11。总体而言,人类假岛的形成与慢病毒转导相结合是研究人类胰岛病理生理学的一种简单而有效的方法,为在人类胰岛中进行机械研究提供了宝贵的工具。
在本报告中,提出了一种利用两个市售平台——96孔超低附着板和微孔培养板——与慢病毒转导的人类伪小岛形成方案。两者都实现了基因表达的有效调制,并创造了与下游评估(包括静态孵育和围气又液)相容的人类伪岛。
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Protocol
在开始研究之前,爱荷华大学机构审查委员会作出了人类主题研究的决定,该委员会确定该研究不符合人类学科研究的标准。在开始研究之前,请咨询当地审查委员会,以确定胰岛的来源和计划的研究是否需要事先批准。
注:通常,在96孔超低附着板中形成192个伪胰岛(IEQ)时,需要1,200~1,400个当量(IEQ)的假胰岛,或1,200个伪胰岛大小为500个细胞/伪胰岛。微井文化板。所需的胰岛IEQ因人类胰岛的不同制剂而异,因为供体因素(年龄、健康、体重)、隔离效率和培养条件会影响单细胞悬浮液的产量。在此协议中,使用含有shRNA的慢病毒,以感兴趣的基因为目标。据报道,基于慢病毒载体的巨细胞病毒(CMV)和人磷酸甘油激酶(hPGK)促进剂在人类伪胰岛5、15中有效调节基因。使用慢病毒需要作为生物危害16的预防措施。在开始使用慢病毒之前,请联系当地的生物安全委员会。
1. 人类胰岛在装运后恢复的隔夜文化
- 制备康诺特医学研究实验室 1066 (CMRL-1066) 介质,在生物中结合 50 mL CMRL-1066、0.5 g HSA、0.5 mL 青霉素-链霉素和 0.5 mL 100 mg/mL 谷氨酰胺 (1% HSA RL CM) 的介质安全柜 (BSC)并通过 0.2 μm 过滤器进行灭菌。
- 轻轻旋转装运瓶,使小岛保持悬浮状态。将含有胰岛的运输介质转移到 50 mL 锥形离心管上。让管子在 BSC 中坐 15 分钟,使胰岛稳定在管的底部。
- 使用 10 mL 移液器轻轻去除运输介质,而不会干扰小岛颗粒。将小岛颗粒重新悬浮在 1% HSA CMRL 中,浓度为 400 IEQ/mL。
- 将胰岛转移到非组织培养处理的盘中。如果胰岛被分割成多个菜,在分裂前轻轻旋转,使胰岛均匀地悬浮在介质中。在5%CO2培养箱中,在37°C下培养胰岛过夜。
注:需要使用非组织培养处理的培养皿,以防止胰岛附着在盘子上。
2. 从人类胰岛制备单细胞悬浮液
- 准备以下:CMRL-1066介质,10%热灭活胎儿牛血清(HiFBS)、青霉素-链霉素和谷氨酰胺(10%HiFBS CRML),在室温(RT)下,40μm过滤器,35毫米培养皿,1 mL结核菌注射器和血细胞计。
- 在隔夜培养后将人类胰岛转移到15 mL锥形离心管中。在回转桶转子中,在 190 x g下离心 5 分钟。吸气介质,带 5 mL 移液器,不会干扰小岛颗粒。
- 将10 mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入管中,轻轻混合,在190 x g下离心5分钟。吸气PBS,不干扰小岛颗粒。
- 使用P1000移液器将胰岛颗粒重新悬浮在预加热蛋白解和胶原蛋白解酶混合物的0.5 mL中,移液器5x混合小岛。在37°C下孵育5分钟,轻轻上下移液1~5次。
注:积极的移液会增加细胞损失。 - 检查云度(单个细胞)和片数(未消化的小岛)。根据云量和片数判断的消化程度,在37°C中加入2~3分钟孵育。当薄片减少到消化不良的±10%时停止消化,溶液是多云的。
注:消化所需的时间因每个人类小岛制剂的岛大小分布而异。 - 将 40 μm 滤网放入 35 mm 培养皿中,加入 1mL 10% HiFBS CMRL 并按压 1 mL 注射器柱塞,将滤网弄湿。转移滤网顶部的所有细胞悬架,并在新鲜的 15 mL 管中收集通过。
- 用0.5 mL的新鲜CMRL培养基清洗用于小岛消化的管子,以收集剩余细胞并通过滤网进行洗涤。将直通在 15 mL 管中。重复一次。
- 接下来,通过按下放置在 35 mm 盘中的滤网,用 1 mL 注射器柱塞分离残留在滤网上的未消化胰岛。再次收集通过,用新鲜的 CMRL-1066 清洗滤网,从滤网和盘子中取出所有剩余的消化胰岛。单细胞悬浮液的总 ±3 mL 将在 15 mL 管中。
- 记录细胞悬浮液的总体积,并采用10μL等分的细胞计数细胞数在血细胞仪上。
- 在200 x g下将细胞悬浮液离心5分钟。取出介质,不要干扰颗粒。如果使用 96 孔超低附着板或步骤 3.2.1,如果使用 24 孔微孔培养板重新聚合细胞,则继续执行步骤 3.1.1。
3. 伦蒂病毒的伪岛形成和转导
- 使用 96 孔超低附件板的协议
- 确定每个伪岛所需的单元格数和要创建的伪小岛数。通常,对于 96 孔超低附着板的每个伪电池,使用 1,000-3,000 个单元。对于每个伪岛3,000个细胞,通过将小岛颗粒从步骤2.10重新悬浮到10%HiFBS CMRL中的1x10 5细胞/mL,将细胞悬浮液调整到1×105细胞/mL,使30μL的细胞悬浮液具有3,000个细胞。使用以下公式计算所需的单细胞悬浮液 (mL) 的 1 x 105细胞/mL 的总体积:
单细胞悬浮液(mL)的1 x105细胞/mL的总体积=(每个伪胰岛的细胞数)x(正在制造的伪小岛数)/1 x 105。
注:根据每个伪islet所需的细胞数量调整细胞悬浮液的浓度,使30μL的细胞悬浮液产生一个伪islet。 - 将单细胞悬浮液所需的体积(30 μL x 正伪小岛数)转移到新鲜的15 mL管中。添加250个转导单元(TU)/含有shRNA的慢病毒细胞,以感兴趣的或对照的基因为目标。
警告:Lenti病毒被归类为生物安全2级,可以集成到受感染细胞的DNA中。
注:使用浓缩扁豆病毒,使添加的慢透病毒量最小。根据慢病毒结构的不同,每个细胞所需的提特用于有效的基因沉默可能有所不同。 - 通过用P1000移液器轻轻移液5x将细胞悬浮液与病毒混合。如果使用 8 通道移液器,将混合电池转移到 50 mL 无菌试剂罐中。
- 根据孔数,使用 8 通道移液器或 P200 移液器将每孔与慢病毒混合的单细胞悬浮液每孔分配 30 μL。
- 在RT处以270 x g将96孔板在270 x g下离心7分钟。检查每个孔的中心是否聚集细胞。如果不是,离心机再次作为收集所有细胞在井的中心是至关重要的伪岛的形成。在37°C的加湿5%CO2培养箱中过夜。
- 第二天早上,每口井加入100μL的预加热10%HiFBS CMRL,以避免在随后的培养过程中使细胞干燥。在270 x g,RT下离心7分钟,在37°C下培养5%的CO2培养箱。伪岛将在5~7天内完成形成。
- 收获伪胰岛时,预热所需的10%HiFBS CMRL(每小岛100 μL)所需体积,准备一个50 mL无菌储液罐、一个无菌10厘米培养皿和一个BSC中的8通道移液器。
- 从培养箱中取出 96 孔板,放入 BSC 中。移液器 100 μL 每小岛 10% HiFBS CMRL 进入储液罐。
- 移液器 100 μL 每孔 10% HiFBS CMRL 从储液罐到伪水池,移液器在井中轻轻上下 2⁄3 次,将胰岛抬起。然后,吸气介质在井中含有一个伪小气,并弹出到10厘米的培养皿。使用 8 通道移液器可一次传输 8 个伪小岛。
- 在光学显微镜下检查板,以确保完全去除所有伪小岛。伪岛形成坚定的聚合体,并在提升后保持聚合。伪岛现在已经为下游实验做好了准备。
- 确定每个伪岛所需的单元格数和要创建的伪小岛数。通常,对于 96 孔超低附着板的每个伪电池,使用 1,000-3,000 个单元。对于每个伪岛3,000个细胞,通过将小岛颗粒从步骤2.10重新悬浮到10%HiFBS CMRL中的1x10 5细胞/mL,将细胞悬浮液调整到1×105细胞/mL,使30μL的细胞悬浮液具有3,000个细胞。使用以下公式计算所需的单细胞悬浮液 (mL) 的 1 x 105细胞/mL 的总体积:
- 使用24孔微孔培养板的协议
- 将防粘附冲洗溶液(材料表)预热至RT,以有效形成球形。此外,预暖平原 CMRL-1066 和 10% HiFBS CMRL。
- 将每孔500μL的抗粘附浸合溶液添加到24孔微孔培养板的每口孔中,用于伪小孔。在回转桶板离心机中,以 1,300 x g进行 5 分钟的离心机。
- 在显微镜下观察板,以确保从微孔中去除气泡。如果气泡被困在微井中,则再次以 1,300 x g离心 5 分钟。
- 从 BSC 中的井中吸出抗粘附性洗涤溶液。用 2 mL 的暖平原 CMRL-1066 冲洗每口井一次。吸气 CMRL-1066。在每个精心规划的使用中添加 0.5 mL/井的暖 10% HiFBS CMRL。井现在已准备好装载步骤 2.10 中准备的分散的人类小岛细胞。
- 确定每个井所需的细胞总数。一口24孔微孔培养板含有1,200个微孔,形成1,200个伪小孔。每个伪islet x 1200微井 = 6 x 105个细胞 500 个细胞。在无菌 1.5 mL 管中,在 0.8 mL 的 10% HiFBS CMRL 中重新悬浮单个细胞,步骤 2.10 至 6 x 105细胞。
注:每口井的最大体积为 2 mL。细胞悬浮量不应超过1.5 mL。该协议描述了创建由慢病毒转导的伪islet井的步骤。根据每种扁豆病毒的井数进行扩展。 - 对于病毒转导,在单细胞悬浮液中添加125 TU/细胞。将病毒的体积保持在 0.2 mL 以下。在37°C下孵育细胞和病毒混合物,偶尔温和混合1小时,以便在步骤3.2.8中细胞凝结之前与病毒接触。
注:使用浓缩扁豆病毒,使添加的慢透病毒的体积最小。与协议 1 相比,协议 2 使用每个单元的 TU 数量较少,因为每个单元数介质的总体积较少。然而,每个细胞所需的皮托进行有效的基因沉默可能因慢病毒构造和需求优化而异。
警告:Lenti病毒被归类为生物安全2级,可以集成到受感染细胞的DNA中。 - 1小时后,通过加入10%HiFBS CMRL,将小岛细胞和病毒混合物的总体积调整到1 mL。如果细胞在孵育1小时后形成团块,通过温和而快速的移液2⁄3次分散成单细胞悬浮液。移液对于在微井中均匀分布细胞非常重要。将细胞悬浮液转移到24孔微孔培养板的一口井上。
- 移液后,在RT处以100 x g离心3分钟,将细胞捕获到所有微井中。在显微镜下观察,以验证细胞在所有微井中均匀分布。
- 在5%CO2培养箱中,在37°C下培养微孔培养板。伪岛将在24-48小时形成。伪岛可以在不进行介质变化的情况下进行培养,最多7天。
- 更改培养基超过 7 天时,为每个介质变化更换 50%-75% 的介质,如下所示。使用 P1000 移液器从每个井中缓慢去除 0.5⁄1 mL 的介质。将 0.5⁄1 mL 的新鲜 10% HiFBS CMRL 缓慢地添加到井壁上,以避免将伪小孔从微孔培养板上移开。
- 要准备收获伪小岛,请预热 10% HiFBS CMRL 介质。伪小岛倾向于漂浮在无血清CMRL-1066中,因此很难采摘它们。
- 使用 1 mL 移液器从井中吸出 0.5 mL 的介质,并将介质强制分配回板表面,以从微孔培养板中提升伪孔。
- 使用 1 mL 移液器轻轻吸出的伪胰岛,并将胰岛转移到经过处理的 6 孔板的非组织培养液中。穿过放置在 15 mL 锥形管上的 37 μm 可逆滤网。伪小岛将保留在过滤器上;任何未合并的单细胞将流过。
注:为了避免通过滤网丢失较小的小尺寸伪岛,可以省略滤网。 - 在油井的整个表面分配 1 mL 的 10% HiFBS CMRL,以清除任何剩余的伪小岛,吸气去除的伪小岛,并通过滤网。重复 3 倍以确保从井中完整收集所有伪小岛。
- 在反光显微镜下观察微孔培养板,以确保收集所有伪小岛。如果伪小岛仍然存在,请重复步骤 3.2.14 中的洗涤。
4. RNA提取用于评价基因沉默效率
- 在1.5 mL微离心管中将伪胰岛放入无RNasePBS中,在300 x g下在4°C下进行3分钟的离心机。去除PBS,不干扰小岛颗粒,用PBS洗涤一次,随后在300 x g下离心3分钟,在4°C下。
- 使用 P1000 移液器吸气大部分 PBS。然后,更换为 P10 移液器,以去除 PBS 的其余部分,而不会干扰小岛颗粒。
- 每管添加0.5 mL的二恶亚酸盐RNA萃取试剂(材料表)。使用电机驱动的虫子对伪岛进行均匀化 2⁄3 次。三氟化酸RNA萃取试剂中的均质性现在可以储存在-80°C或加工用于RNA纯化。
注:在96孔板中形成的3,000个细胞伪胰岛中,有24个在微孔培养板中形成,或500个细胞伪胰岛中的48个足以获得0.5±1 μg的RNA。
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Representative Results
图 1显示了使用 96 孔超低附着板和微孔培养板生产伪岛的关键步骤。图2a显示了在96孔超低附着板中3 x 103人类胰岛细胞形成伪胰岛期间形态的连续变化。在第1天观察到的单层或松散的细胞团体在第5天至第7天变成具有平滑的圆形边界的固体聚集体(图2a)。在微孔培养板中,固体伪岛的形成通常在4天内可见(图2b)。当600个细胞/微孔在微孔培养板中镀层时,人类小岛细胞被浓缩成均匀大小的球体。据观察,与96孔超低附着板相比,微孔培养板能够成功地从少量细胞中形成伪胰岛。通常,96孔超低附着板需要超过1,500个细胞/伪小板,而500个细胞/伪小板足以用于24孔微孔培养板。从96个超低附着板或微孔培养板中回收后,成功形成的伪岛体仍作为球形体,适用于下游应用,包括静态孵育(图3a)和围液(图)3b.伪岛的均匀大小减少测试组内的变异,并允许每次测量使用5个伪小岛进行静态孵化(图3a)。此外,人类伪胰岛维持强大的第一阶段胰岛素分泌,以响应葡萄糖后7天的培养,当原始人类胰岛培养在类似的时间显示钝化第一阶段葡萄糖刺激胰岛素分泌(图 3b)5.将慢病毒引入单个细胞悬浮液可确保小岛细胞的高效和均质转导,并实现如图3c所示的高效基因向下调控。所有显示的结果都是使用非糖尿病捐赠者的人类胰岛获得的。
图1:人类伪化制剂的过程。(a) 含有4,000 IEQ的人类胰岛悬浮液在消化后,由蛋白解物和胶原酶混合物及轻度移液而变得浑浊。(b) 分散后的人类胰岛通过滤网。剩余的滤网顶部未消化的小岛使用 1 mL 注射器柱塞分散。(c,d)在96孔超低附着板中,在(c)和之后(d)离心,单细胞悬浮液的显微镜图像包含3,000个细胞/孔。(e,f)在离心前 (e) 和之后,在 24 孔微孔培养板中包含 500 个细胞/微孔的单细胞悬浮液的显微镜图像。比例尺 = 250 μm.请点击此处查看此图的较大版本。
图2:人类伪小岛形态。人类伪胰岛形态的连续变化(a)在96孔超低附着板中从3,000个细胞和(b)在24孔微孔培养板从500个细胞创建(a)。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:示例使用人类伪小岛进行功能测定。(a) 代表静态孵育使用在微孔培养板中产生的人类伪胰岛,从单个供体以每个伪胰岛大小500人胰岛细胞大小进行。四组5个假岛在克雷布斯环碳酸氢盐缓冲液中孵育1小时,补充2 mM或16.8 mM葡萄糖。每个符号表示一组 5 个假小岛的胰岛素分泌。显示均值 = 均值 (SEM) 的标准误差。*,p < 0.05 通过学生不考试。三个捐助者的代表成果。(b) 代表围输液测试胰岛素分泌从人类伪胰岛在微孔培养板中产生,以响应16.7 mM葡萄糖和30 mM KCl.包液的方法先前发表5。平均 = 从两组40个伪胰岛中产生的胰岛素分泌SEM,从单个供体在单个供体中产生,每个伪胰岛板的大小为500人胰岛细胞。来自六个捐助者的代表性数据。(c) 假病毒是用携带 shRNA 的慢病毒创建的,该病毒以人类ATGL(针对 CCTGCCATATAGGATGATA,左)或PLIN5(针对 GACAAGCTAGAGAGAAGAGCTT,右)。对照假岛与扁豆病毒转导,表达杂乱序列(Scr)之前发表5。每个基因的mRNA表达是由实时聚合酶链反应(PCR)决定的,如之前发表的5。数据用2-DDCT作为内部控制17表示。每个点表示来自每个捐赠者的数据,用于指示的引注,来自同一捐赠者的数据集由一行连接。N = 3个捐助者。*;p < 0.05 由学生不考试。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这里给出了一种使用96孔超低附着板或微孔培养板生成由慢病毒转导的人类伪小岛的详细方案。据报道,伪小岛已显示出形态和分泌功能类似于本地人类胰岛,可以在体外进行长时间的体外培养。与在大小上表现出巨大差异的本地人类小岛不同,伪小岛在大小上相对均匀,减少了捐赠者和实验复制体5,11之间的变异。在单细胞悬浮液形成伪胰岛之前,可以轻松对需要高转导效率的基因进行降序。该方法避免了病毒通过完整胰岛细胞层渗透的困难。因此,这种简单、高效、可重复的创建人类伪胰岛的协议有着广泛的应用。
虽然有几个不同的平台已经报告形成伪岛12,14,19,20,一个96孔超低附件板和一个微孔培养板商用,允许任何实验室采用这种技术。虽然悬挂放置方法12还允许使用普通实验室软件形成人类伪小岛,但潜在的限制包括难以控制伪小岛的大小和重新聚合持续时间。这些限制是由于伪小岛形成所需的5-7天培养期间,伪岛每滴的体积有限,并且持续蒸发。此外,与悬垂法相比,使用96孔超低附着板或微孔培养板更容易控制慢病毒。
协议中的几个步骤需要密切关注。利用蛋白解物和胶原蛋白解酶混合物优化完整胰岛的消化至关重要,因为消化不足和过度消化都会降低单细胞悬浮液的产量,进而影响伪胰岛的聚集。在消化过程中,必须密切监测胰岛是否消失成团块和云量增加,因为胰岛分离成单个细胞。需要注意的是,不同捐赠者的小岛之间消化的最佳时间各不相同。最佳时间取决于几个因素,包括病史和每个捐赠者的年龄、缺血时间的长度、使用的岛隔离程序、小岛大小、小岛纯度、小岛生存能力和装运条件。通常,使用生存能力和纯度高于 80% 且在隔离后的 5 天内使用的人类胰岛。分散过程中的仔细和温和的移液对于维持细胞活力和恢复也很重要,这将最终影响细胞聚集和假岛的最终大小。在将小岛细胞悬浮液分给井(步骤3.1.4和3.2.7)时,温和彻底地混合细胞对于实现单个细胞均匀分布到微孔中非常重要。如果细胞在1小时孵育后与慢病毒形成团块,它需要温和的移液,以在最后离心之前将团块分解成单个细胞悬浮液。
在利用96孔板和微孔培养板进行慢病毒转导后,我们同样成功地制造了人类伪小岛。两个平台之间的选择取决于所需的伪胰岛的大小和数量。与 96 孔圆底板相比,微孔培养板具有较小的金字塔形底部,允许冷凝数量较少的细胞。因此,对于微孔培养板,每个伪小孔的细胞数量可以减少。此外,单个离心步骤在微孔培养板中同时创建所有伪小岛,同时在 96 孔板中创建伪小孔需要多个移液。因此,在微孔培养板中,扩大伪小岛的产生更容易。然而,目前可用的微孔培养板在所创建的伪小岛数量方面没有灵活性。目前,使用微孔培养板创建的伪小岛最小数量为1,200个,只能增加1,200倍。因此,我们通常使用 96 孔板进行小规模试验和实验,其中少量样品足够,如胰岛素分泌测定和RNA提取,用于基因表达。我们使用微孔培养板中的伪小岛进行检测,这些细胞需要大量细胞,如西印体、代谢分析仪的耗氧率测定以及甘油三酯提取。
产生人类伪胰岛的主要限制因素是在单细胞悬浮液制备过程中细胞的丧失。虽然人类小岛的1 IEQ被认为含有大约2,000个细胞,但单细胞悬浮液的恢复率通常为30%或更低,原因是多次洗涤和通过滤网。小岛大小的异质性也使得很难同时分离所有胰岛。虽然温和的移液和在协议中使用蛋白解液和胶原酶混合物是努力结合机械和酶力,以最大限度地恢复单个细胞,仍然存在不可避免的细胞损失。因此,伪小岛的应用需要明确的理由来研究完整的人类胰岛。还需要提醒的是,来自伪胰岛的胰岛素分泌比同一时期培养的胰岛更健壮,但与新鲜分离的小岛5,11相比,往往较低。
尽管存在局限性,但稳定和高效的基因沉默,加上在培养中长时间更好地保存葡萄糖刺激胰岛素分泌,有助于评估人类小岛细胞的基因功能。此外,建议β-β细胞和非β-非β细胞之间的复杂细胞间通信在小岛功能中具有调节作用。然而,目前关于人类胰岛内细胞间通信的信息有限。随着细胞特异性标记21的可用性增加,可以创建具有定义细胞成分的人类伪胰岛,正如最近报告在小鼠胰岛细胞22中所报道的,这将有助于更好地理解细胞人类小岛细胞之间的通信。三维组织成像的最新进展也有可能增加人类伪小岛作为模型的效用,以揭开细胞极性和细胞间通信在人类胰岛中如何被调节的模型。因此,人类伪胰岛为剖析感兴趣的基因的功能和胰岛生物学领域的其他问题提供了一个有用的模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家卫生研究院(R01-DK090490)和美国糖尿病协会对Y.I.(1-17-IBS-132)的财政支持。J.A.和Y.I.由鹰糖尿病研究中心兄弟会支持。A.B. 得到国家卫生研究院培训补助金(T32NS45549)的支持。作者利用了由NIDDK资助的希望之城综合胰岛分配方案(IIDP)提供的人类胰腺胰岛(2UC4DK098085)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| Cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| Inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| Motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| Non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| Pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| Pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| Pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| Pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| Pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| Pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| Reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| Swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| Ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
