Summary
En protokol til oprettelse af genetisk modificerede humane pseudoisletter fra spredte humane ø-celler, der er transduceret af lentivirus med kort hårnål RNA (shRNA), er præsenteret. Denne protokol udnytter let tilgængelige enzym og kultur fartøjer, kan udføres nemt, og producerer genetisk modificerede humane pseudoisletter egnet til funktionelle og morfologiske undersøgelser.
Abstract
Forskellige genetiske værktøjer er tilgængelige til at moduere gener i bugspytkirtlen Holme af gnavere at dissekere funktion af ø gener for diabetes forskning. Imidlertid er de data, der er indhentet fra gnaver Holme, ofte ikke helt gengivet i eller gældende for menneskelige øer på grund af velkendte forskelle i øens struktur og funktion mellem arterne. I øjeblikket er teknikker, der er tilgængelige til at manipulere genekspression af menneskelige Holme, meget begrænsede. Indførelse af transgene i intakt Holme af adenovirus, plasmid, og oligonukleotider ofte lider af lav effektivitet og høj toksicitet. Lav effektivitet er især problematisk i gene downregulation undersøgelser i intakt Holme, som kræver høj effektivitet. Det har været kendt, at enzymatisk spredte ø-celler reaggregate i kultur danner sfæroider betegnes pseudoislets. Størrelses kontrolleret reaggregation af menneskelige ø-celler skaber pseudoisletter, der opretholder dynamisk første fase insulinsekretion efter langvarig kultur og giver et vindue til effektivt at introducere lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) med lav toksicitet. Her beskrives en detaljeret protokol til oprettelse af humane pseudoisletter efter lentiviral transduktion ved hjælp af to kommercielt tilgængelige multiwell-plader. Protokollen kan let udføres og giver mulighed for effektiv downregulation af gener og vurdering af dynamikken i insulinsekretionen ved hjælp af humane ø-celler. Således, humane pseudoisletter med lentiviral medieret gen modulation giver en kraftfuld og alsidig model til at vurdere genfunktion inden for menneskelige ø-celler.
Introduction
Tabet af funktionel beta cellemasse er den centrale patologi for både type 1-og type 2-diabetes1. Mens beta celler er producenter af insulin i bugspytkirtlen Holme, kommunikation mellem beta celler og ikke-beta celler spiller en afgørende rolle i reguleringen af insulinsekretion2. Desuden, dysregulering af Glucagon sekretion bidrager til hyperglykæmi i diabetes3. Således er der stor interesse for at moduere genekspression af celler inden for pancreas-Holme for at løse mekanismen bag udviklingen af ø-dysfunktion i diabetes. En række forskellige tilgange, herunder Transgene mus er tilgængelige til at moduere genekspression af mus Holme. Men, menneskelige og mus Holme viser særskilte innervation, celle fordeling, forholdet mellem Beta til Alpha celler, og respons på secretagogues4. Derfor er direkte vurdering af gen funktion i menneskelige Holme er yderst vigtigt for forståelsen af Patofysiologi af humane pancreas Holme.
Adenoviral vektor er den mest udbredte virale vektor til transduce pancreas Holme in vitro på grund af den høje effektivitet af transduktion i ikke-dividere celler. Men, adenovirus ikke trænge ind i kernen af Holme effektivt, især i humane Holme5, og er cytotoksisk ved høje doser6. Forholdsvis, lentiviral vektor er mindre cytotoksisk og leverer eksogene gener permanent i kromosom af post-mitotiske celler, hvilket gør det til et bredt afprøvet køretøj til genterapi7. Men, evnen af lentivirus at trænge ind i kernen af intakt humane Holme er også begrænset, hvilket kræver delvis dispersion ved enzymatisk fordøjelse at øge transduktiviteten8. Den advarsel med spredningen af intakt menneskelige Holme er afbrydelse af celle-celle og celle-matrix kommunikation, som kompromitterer den dynamiske regulering af insulinsekretion kritisk for opretholdelse af glucosehomøostase i mennesker9. Derfor har det været udfordrende at vurdere virkningen af genmodulering på den dynamiske regulering af ø-funktionen i en model af menneskelige Holme.
Det har været kendt, at spredte ø-celler fra menneskelige og gnavere Holme selvstændigt reaggregate i Islet-lignende strukturer kaldet "pseudoislets". Pseudoislets viser beta-og ikke-beta-celle distribution svarende til native Holme10,11. Desuden, efter langsigtet kultur, indfødte Holme gradvist miste robust første fase insulinsekretion5,10,11,12. Endnu, pseudoislets demonstreret bedre bevaring af første fase insulinsekretion som reaktion på glukose sammenlignet med indfødte Holme efter den samme kultur periode5. Ud over at have bedre bevarelse af insulinsekretionen, størrelses kontrolleret reaggregation af menneskelige ø-celler i lave vedhæftnings plader11 giver et vindue af muligheder for at introducere lentivirus vektorer før deres reaggregation i pseudoislets. Flere undersøgelser har påvist nytten af pseudoisletter kombineret med lentiviral medieret transduktion. Caton et al.13 rapporterede, at indførelsen af det grønne fluorescerende protein (gfp), der udtrykker lentivirus, havde ringe effekt på insulinsekretionen, samtidig med at man opnåede homogen ekspression af gfp i rotte pseudoisletter sammenlignet med ikke-inficeret kontrol. De viste også den specifikke virkning af forskellige connexiner på insulinsekretionen ved at overtale connexins 32, 36 og 43 via lentivirus13. Humane pseudoisletter fremstillet med en kommercielt tilgængelig 96-brønd ultra-lav vedhæftnings plade viste, at lentiviral-mediated overekspression af transkriptionsfaktor SIX3 forbedrer insulinsekretionen vurderet ved statisk inkubation14. For nylig blev humane pseudoisletter tilberedt med en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade brugt til at nedregulere glucokinase via lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) som et bevis på princippet for at vise, at glukose-stimuleret insulinsekretion er reduceret, mens KCl-stimuleret insulinsekretion blev bevaret5. Undersøgelsen viste også, at humane pseudoisletter ligner indfødte Holme i genekspression og sekretoriske profiler, yderligere støtte nytten af humane pseudoislets at dissekere reguleringen af ø funktion5. Selvom perifusion ikke blev udført, blev en biokonstrueret mikrobrønd kultur plade, der for nylig blev kommercielt tilgængelig, også rapporteret at være kompatibel for lentiviral transduktion og producerede humane pseudoislets, der udviste fremragende insulin sekretion in vitro og in vivo efter transplantation11. Kollektivt er menneskelig pseudo-ø dannelse kombineret med lentiviral transduktion en enkel og effektiv tilgang til at undersøge den menneskelige ø Patofysiologi, hvilket giver et værdifuldt værktøj til at udføre Mekanistiske undersøgelser i humane Holme.
I den nuværende rapport, en protokol til at danne humane pseudoislets transduceret med lentivirus ved hjælp af to kommercielt tilgængelige platforme, en 96-godt ultra-lav fastgørelse plade og en strips med mikrobrønde kultur plade er præsenteret. Begge opnår effektiv graduering af genekspression og skaber humane pseudoisletter, der er kompatible til downstream-vurderinger, herunder statisk inkubation og perifusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forud for påbegyndelse af undersøgelser, en menneskelig forskning beslutsomhed blev foretaget af University of Iowa institutionel revision bestyrelsen, der fastslået, at undersøgelsen ikke opfyldte kriterierne for human forskning. Konsultér den lokale revisions bestyrelse, før undersøgelsen påbegyndes, for at afgøre, om kilden til Holme og planlagt undersøgelse kræver forudgående godkendelse.
Bemærk: Typisk er der behov for 1200 − 1400-øgenækvivalenter (iEQ) af humane Holme til dannelsen af 192 pseudoislets på størrelse med 3.000 celler/pseudoisletter i en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade eller 1.200 pseudoisletter på størrelse med 500 celler/pseudoisletter i en mikrobrønd kultur plade. IEQ af Holme kræves varierer mellem forskellige præparater af humane Holme som donor faktorer (alder, sundhed, vægt), isolation effektivitet, og kulturforhold påvirker udbyttet af enkelt cellesuspension. I denne protokol anvendes lentivirus, der indeholder shRNA, og som er målrettet mod et gen af interesse. Den Cytomegalovirus (CMV) og human fosfoglyceratkinase (hpgk) promotor baseret lentiviral vektorer er rapporteret til at ned-regulere genet effektivt i humane pseudoislets5,15. Brug af lentivirus kræver forsigtighed som Biohazard16. Kontakt det lokale udvalg for Biosikkerhed inden initiering af brugen af lentivirus.
1. overnight kultur af menneskelige Holme til nyttiggørelse efter afsendelse
- Forbered Connaught medicinske forskningslaboratorier 1066 (CMRL-1066) medium suppleret med 1% humant serumalbumin (HSA) ved at kombinere 50 mL CMRL-1066, 0,5 g HSA, 0,5 mL penicillin-streptomycin og 0,5 mL af 100 mg/mL glutamin (1% HSA CMRL) i biologisk sikkerhedskabinet (BSC) og passerer gennem et 0,2 μm filter til sterilisering.
- Drej forsigtigt forsendelses flasken for at holde Holme i suspension. Overfør det forsendelses medium, der indeholder Holme, til et 50 ml konisk centrifugeglas. Lad røret sidde i BSC i 15 min, så Holme bosætte sig i bunden af røret.
- Fjern forsigtigt transportmediet uden at forstyrre den ø-pellet, der bruger en 10 mL pipette. Igen suspendere den ø-pellet i 1% HSA CMRL til en koncentration på 400 IEQ/mL.
- Overfør Holme til en ikke-vævskultur behandlet fad. Hvis Holme er opdelt i flere retter, holde Holme jævnt suspenderet i medium ved forsigtigt hvirvlende før opdeling. Dyrknings Holme ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator natten over.
Bemærk: Brugen af en ikke-vævskultur behandlet fad er nødvendig for at forhindre fastgørelse af Holme til pladen.
2. klargøring af enkelt celle suspension fra humane Holme
- Forbered følgende: CMRL-1066 medium med 10% varme inaktiveret føtal bovint serum (HiFBS), penicillin-streptomycin og glutamin (10% HiFBS CRML) ved stuetemperatur (RT), en 40 μm-Strainer, en 35 mm Petri skål, en 1 mL tuberkulin sprøjte og et hemocytometer.
- Overfør menneskelige Holme efter overnight kultur til et 15 mL konisk centrifugeglas. Centrifugeres ved 190 x g i 5 minutter i en sving skovl rotor. Aspirér medium med en 5 mL pipette uden at forstyrre ø-pellet.
- Pelleten vaskes ved at tilsætte 10 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS) i røret, blandes forsigtigt og centrifugeres ved 190 x g i 5 min. aspirat PBS uden at forstyrre den ø-pellet.
- Re-suspendere den ø-pellet i 0,5 mL af en præ-opvarmet proteolytisk og kollagenolytisk enzym blanding og pipetter 5x ved hjælp af en P1000 pipette til at blande Holme. Inkuber ved 37 °C i 5 min. Bland ved pipettering op og ned forsigtigt 1 − 5 gange.
Bemærk: Aggressiv pipettering vil øge cellernes tab. - Kontroller, om uklarhed (enkeltceller) og antallet af flager (ufordøjet Holme). Tilsæt 2 − 3 min til 37 °C inkubation afhængigt af omfanget af fordøjelsen bedømt af uklarhed og antallet af flager. Stop fordøjelsen, når flager er reduceret til ~ 10% af forfordøjelsen og opløsningen er uklar.
Bemærk: Tid, der kræves til fordøjelsen varierer afhængigt af den ø størrelsesfordeling af hver menneskelige ø forberedelse. - Placer en 40 μm-si i en 35 mm Petri skål, og våd sien ved at tilsætte 1 ml 10% hifbs cmrl og presning med 1 ml sprøjte stempel. Overfør alle cellesuspensionen på toppen af sien og saml pass-through i et frisk 15 mL rør.
- Vask røret anvendes til ø fordøjelse med 0,5 mL frisk CMRL medium til at indsamle rester celler og passere vask gennem Strainer. Kombiner pass-through i et 15 mL rør. Gentag en gang.
- Dernæst adskilles ufordøjet Holme på straineren ved at trykke på si placeret i en 35 mm skål med 1 ml sprøjte stempel. Saml pass-through igen og vask si med frisk cmrl-1066 at fjerne alle resterende fordøjet Holme fra sien og skålen. I alt ~ 3 mL enkelt cellesuspension vil nu være i 15 mL røret.
- Optag det totale volumen af cellesuspensionen og tag 10 μL alikvot celler for at tælle celle nummeret på et hemocytometer.
- Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 200 x g. Fjern mediet uden at forstyrre pellet. Fortsæt til trin 3.1.1, hvis du bruger en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade eller trin 3.2.1, hvis du bruger en 24 Well strips med mikrobrønde-kultur plade til at reaggregere cellerne.
3. pseudo-ø dannelse og transduktion af lentivirus
- Protokol ved hjælp af en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade
- Bestem det ønskede antal celler pr. pseudoø og det antal pseudoisletter, du vil oprette. Typisk bruges 1000 − 3000 celler til hver pseudoø til en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade. For 3.000 celler pr. pseudoø skal cellesuspensionen justeres til 1 x 105 celler/ml ved at opgøre den ø-pellet fra trin 2,10 i 10% HiFBS cmrl, således at 30 μl cellesuspension har 3.000 celler. Beregn det totale volumen på 1 x 105 celler/ml enkelt cellesuspension (ml), der kræves ved hjælp af følgende ligning:
Det totale volumen på 1 x 105 celler/ml enkelt cellesuspension (ml) = (antal celler pr. pseudoø) x (antal pseudoisletter fremstillet)/1 x 105.
Bemærk: Juster koncentrationen af cellesuspensionen baseret på det ønskede antal celler pr. pseudoø, så 30 μL cellesuspension gør én pseudoø. - Den påkrævede volumen (30 μL x antal pseudoisletter fremstilles) af en enkelt cellesuspension til et frisk 15 mL rør. Tilsæt 250 transduktionsenheder (TU)/celleaf lentivirus indeholdende shRNA rettet mod et gen af interesse eller kontrol.
Forsigtig: Lentivirus er klassificeret som biosikkerhedsniveau 2 og kan integreres i DNA af inficerede celler.
Bemærk: Brug koncentreret lentivirus, så mængden af lentivirus tilsat er minimal. Titer, der kræves pr. celle for effektiv genhæmning, kan variere afhængigt af den lentivirale konstruktion. - Bland cellesuspension med virus ved pipettering forsigtigt 5x med en P1000-pipette. Overfør blandede celler til et 50 mL sterilt reagens reservoir, hvis der anvendes en 8-kanals pipette.
- Der dispenserer 30 μL pr. brønd af enkelt cellesuspension blandet med lentivirus i hver brønd ved hjælp af en 8-kanals pipette eller en P200 pipette afhængigt af antallet af brønde.
- Centrifuger 96-brønd pladen i en sving-skovl plade centrifuge ved 270 x g ved rt i 7 min. Kontroller, om cellerne er samlet i midten af hver brønd. Hvis ikke, centrifugeres igen, da indsamling af alle celler i midten af brønden er kritisk for pseudo-ø dannelse. Kultur ved 37 °C i en befugret 5% CO2 inkubator natten over.
- Tilsæt 100 μL præ-varmet 10% HiFBS CMRL pr. godt næste morgen for at undgå tørring af celler under efterfølgende kultur. Centrifugeres ved 270 x g, rt i 7 min. kultur ved 37 °c i en 5% Co2 -inkubator. Pseudoislets vil fuldføre dannelsen i 5 − 7 dage.
- Ved høst af pseudoisletter, pre-Warm den ønskede volumen på 10% HiFBS CMRL (100 μL per ø), forberede 1 50 mL sterile reservoir, en steril 10 cm Petri skål, og en 8-kanals pipette i BSC.
- Fjern 96-brønd pladen fra inkubator og sted i BSC. Pipetten 100 μL pr. ø med 10% HiFBS CMRL i et reservoir.
- Pipette 100 μl pr. brønd på 10% hifbs cmrl fra et reservoir til pseudoislets og pipetten op og ned 2 − 3 gange forsigtigt i brønden for at løfte Holme op. Derefter aspirere medium i brønden indeholdende en pseudoislet og skubbe ind i en 10 cm Petri skål. Brug af en 8-kanals pipette giver mulighed for overførsel af 8 pseudoislets på én gang.
- Kontroller pladen under et let mikroskop for at sikre fuldstændig fjernelse af alle pseudoislets. Pseudoislets danner faste aggregater og forbliver aggregeret efter løft. Pseudoislets er nu klar til downstream eksperimenter.
- Bestem det ønskede antal celler pr. pseudoø og det antal pseudoisletter, du vil oprette. Typisk bruges 1000 − 3000 celler til hver pseudoø til en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade. For 3.000 celler pr. pseudoø skal cellesuspensionen justeres til 1 x 105 celler/ml ved at opgøre den ø-pellet fra trin 2,10 i 10% HiFBS cmrl, således at 30 μl cellesuspension har 3.000 celler. Beregn det totale volumen på 1 x 105 celler/ml enkelt cellesuspension (ml), der kræves ved hjælp af følgende ligning:
- Protokol ved hjælp af en 24-brønd mikrobrønd kultur plade
- Opvarmer den anti-overholdelse skylleopløsning (tabel over materialer) til rt for effektiv sfæide dannelse. Også, præ-varm almindelig CMRL-1066 og 10% HiFBS CMRL.
- Tilsæt 500 μL pr. brønd af den anti-overholdelse skylleopløsning til hver brønd af 24-brønd mikrobrønd kultur plade, der skal anvendes til pseudoislets. Der centrifugeres ved 1.300 x g i 5 minutter i en sving-skovl plade centrifuge.
- Overhold pladen under et mikroskop for at sikre, at luftbobler fjernes fra mikrobrønde. Hvis luftbobler er fanget i mikrobrønde, centrifugeres ved 1.300 x g i 5 min igen.
- Aspirer den anti-overholdelse skyllevæske fra brøndene i en BSC. Skyl hver brønd med 2 mL varm almindelig CMRL-1066 en gang. Aspirat CMRL-1066. Tilsæt 0,5 mL/brønd af varm 10% HiFBS CMRL til hver brønd planlagt til brug. Wells er nu klar til at indlæse spredte menneskelige ø-celler udarbejdet i trin 2,10.
- Bestem det samlede antal celler, der er nødvendige for hver brønd. En brønd af 24-brønd mikrobrønd kultur plade indeholder 1.200 mikrobrønde og former 1.200 pseudoislets. 500 celler pr. pseudoø x 1200 mikrobrønde = 6 x 105 celler. Resuspendér enkeltceller fra trin 2,10 til 6 x 105 celler i 0,8 ml 10% HiFBS cmrl i et sterilt 1,5 ml rør.
Bemærk: Den maksimale lydstyrke pr. brønd er 2 mL. Volumen af cellesuspension bør ikke overstige 1,5 mL. Protokollen beskriver trin til oprettelse af en brønd af pseudoislet transduceret af lentivirus. Skala op afhængigt af antallet af brønde, der skal foretages for hver lentivirus. - For viral transduktion tilsættes 125 TU/celle til enkelt cellesuspensionen. Hold mængden af virus under 0,2 mL. Cellen og virus blandingen inkubates ved 37 °C med lejlighedsvis blid blanding i 1 time for at tillade kontakt med celler med virus før kondensation af cellerne i trin 3.2.8.
Bemærk: Brug koncentreret lentivirus, så mængden af lentivirus tilsat er minimal. Lavere antal TU pr. celle bruges til protokol 2 sammenlignet med protokol 1, da det samlede volumen af medium pr. celle nummer er mindre. Men titer kræves per celle for effektiv genhæmning kan variere afhængigt af lentiviral konstruktion og behov optimering.
Forsigtig: Lentivirus er klassificeret som biosikkerhedsniveau 2 og kan integreres i DNA af inficerede celler. - Efter 1 time justeres den totale mængde af ø-cellen og virus blandingen til 1 mL ved tilsætning af 10% HiFBS CMRL. Hvis cellerne danner klump efter 1 h inkubation, disperserer i enkelt cellesuspension ved blid og hurtig pipettering 2 − 3 gange. Pipettering er meget vigtig for jævn fordeling af celler på tværs af mikrobrønde. Overfør celle affjedring til en brønd af 24-brønden mikrobrønd kultur plade.
- Umiddelbart efter pipettering centrifugeres ved 100 x g i 3 minutter ved rt for at opfange celler i alle mikrobrønde. Overhold under et mikroskop for at kontrollere, at cellerne er jævnt fordelt i alle mikrobrønde.
- Kulturen mikrobrøndens kultur plade ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator. Pseudoislets vil danne i 24 − 48 h. Pseudoislets kan dyrkes uden medium ændring i op til 7 dage.
- Når du skifter medium for kultur efter 7 dage, skal du udskifte 50% − 75% af mediet for hver medium ændring som følger. Fjern langsomt 0,5 − 1 mL medium ved hjælp af en P1000-pipette fra hver brønd. Tilsæt 0,5 − 1 mL frisk 10% HiFBS CMRL langsomt ved at anbringe et tip på brøndens væg for at undgå, at der ikke indgives pseudoisletter fra mikrobrønd kultur pladen.
- For at forberede høst pseudoislets, varme op 10% HiFBS CMRL medium. Pseudoislets tendens til at flyde op i serum gratis CMRL-1066 gør det svært at plukke dem.
- Aspirér 0,5 mL medium fra brønd ved hjælp af en 1 mL pipette og lad medierne kraftigt tilbage til pladens overflade for at løfte pseudoislets ud af mikrobrøndens kultur plade.
- Indsug forsigtigt pseudoisletter ved hjælp af 1 ml pipetten og Overfør Holme til en ikke-vævskultur behandlet 6-brønd plade. Passere gennem en lille 37 μm reversibel si placeret på en 15 ml konisk rør. Pseudoislets vil forblive på filteret; alle uinkorporerede enkeltceller vil flyde igennem.
Bemærk: For at undgå tab af mindre størrelse pseudoislets gennem sien, kan sien udelades. - 1 mL af 10% HiFBS CMRL dispenserer på tværs af hele brøndens overflade for at opløse eventuelle resterende pseudoisletter, aspirere afleverede pseudoisletter og passere gennem sien. Gentag 3x for at sikre komplet samling af alle pseudoisletter fra brønde.
- Overhold mikrobrønd kultur pladen under et invertermikroskop for at sikre, at alle pseudoisletter opsamles. Gentag vask som i trin 3.2.14, hvis pseudoislets forbliver.
4. RNA-ekstraktion til evaluering af genhæmnings effektivitet
- Vælg pseudoislets i RNase Free PBS i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, og centrifugeres ved 300 x g i 3 minutter ved 4 °c. Fjern PBS uden at forstyrre øen pellet og vask en gang med PBS efterfulgt af centrifugering ved 300 x g i 3 min ved 4 °c.
- Aspirér det meste af PBS ved hjælp af en P1000-pipette. Skift derefter til en P10-pipette for at fjerne resten af PBS uden at forstyrre øen pellet.
- Tilsæt 0,5 mL guanidinium thiocyanatrna-ekstraktions reagens (tabel over materialer) pr. tube. Pseudoislets homogeniseres ved hjælp af et motordrevet Pestle i 2 − 3 gange. Homogeni i guanidinium thiocyanat RNA-ekstraktions reagens kan nu opbevares ved-80 °C eller forarbejdes til RNA-rensning.
Bemærk: 24 af de 3.000-celle-pseudoisletter dannet i en 96 brønd plade eller 48 af 500-celle-pseudoislets dannet i en mikrobrønd kultur plade er tilstrækkelige til at opnå 0,5 − 1 μg RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer de vigtigste trin i produktionen af pseudoislets ved hjælp af en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade og en strips med mikrobrønde kultur plade. Figur 2a viser sekventielle ændringer i morfologi under dannelsen af pseudoislets fra 3 x 103 menneskelige ø-celler i en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade. Monolayer eller løse klumper af celler observeret i dag 1 skiftede til solide aggregater med en glat, rund grænse ved dag 5 til 7 (figur 2a). I en mikrobrønd kultur plade er dannelsen af solide pseudoisletter normalt synlig inden for 4 dage (figur 2b). Når 600 celler/strips med mikrobrønde blev belagt i strips med mikrobrønde Culture Plate, blev humane ø-celler kondenseret i sfæroider af ensartet størrelse. Det bemærkes, at en mikrobrønd kultur plade giver mulighed for en vellykket dannelse af pseudoislets fra et lille antal celler sammenlignet med en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade. Typisk er der brug for mere end 1.500 celler/pseudoislet til en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade, mens 500 celler/pseudoislet er tilstrækkelige til en 24-brønd mikrobrønd kultur plade. Med succes dannet pseudoislets forblive som sfæroider efter genvinding fra en 96 ultra-lav fastgørelse plade eller en strips med mikrobrønde kultur plade og er kompatible til downstream-applikationer, herunder statisk inkubation (figur 3a) og perifusion (figur 3b). den ensartede størrelse af pseudoisletter reducerer variationen i en testgruppe og muliggør statisk inkubation med så lidt som 5 pseudoislets pr. måling (figur 3a). Også, humane pseudoisletter vedligeholdt robust første fase insulinsekretion som reaktion på glucose efter 7 dage af kultur, når den oprindelige menneske Holme dyrkes i en lignende periode viste afrundede første fase glukose-stimuleret insulinsekretion ( Figur 3b)5. Indførelsen af lentivirus i en enkelt cellesuspension sikrer en effektiv og homogen transduktion af ø-celler og opnår en yderst effektiv nedregulering af gener som vist i figur 3c. Alle viste resultater blev opnået ved hjælp af humane Holme fra ikke-diabetiske donorer.
Figur 1: proces af human pseudoislet forberedelse. a) suspensionen indeholdende 4.000 iEQ af humane Holme bliver uklar efter fordøjelsen med en proteolytisk og kollagenolytisk enzym blanding og mild pipettering. (b) humane Holme efter dispersion passerer gennem en si. Ufordøjet Holme forbliver på toppen af si er spredt ved hjælp af en 1 ml sprøjte stempel. (c, d) Mikroskop billeder af enkelt cellesuspensionen indeholdende 3.000 celler/brønd i en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade før (c) og efter (d) centrifugering. (e, f) Mikroskop billeder af en enkelt cellesuspension indeholdende 500 celler/mikrobrønd i en 24-brønd mikrobrønd kultur plade før (e) og efter (f) centrifugering. Scale bar = 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: morfologi af humane pseudoislets. Sekventielle ændringer i morfologi af humane pseudoisletter skabt (a) i en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade fra 3.000 celler og (b) i en 24-brønd mikrobrønd kultur plade fra 500 celler. Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempler på funktionelle assays ved hjælp af humane pseudoisletter. a) repræsentativ statisk inkubation udført ved hjælp af humane pseudoisletter skabt i en mikrobrønd kultur plade fra en enkelt donor på størrelse med 500 humane ø-celler pr. pseudoø. Fire sæt af 5 pseudoisletter blev inkuberet i 1 time i Krebs-ringer bicarbonat buffer suppleret med enten 2 mM eller 16,8 mM glucose. Hvert symbol repræsenterer insulinsekretionen fra et sæt af 5 pseudoisletter. Middelværdien ± standardfejl af middelværdien (SEM) er vist. *, p < 0,05 ved student's t test. Repræsentative resultater fra tre donorer. b) repræsentativ perifusions test insulinsekretion fra humane pseudoisletter skabt i en mikrobrønd kultur plade som respons på 16,7 mm glucose og 30 mm KCl. metoden for perifusion blev tidligere offentliggjort5. Gennemsnitlig ± SEM af insulinsekretionen fra to sæt 40 pseudoisletter skabt i en mikrobrønd kultur plade fra en enkelt donor på størrelse med 500 humane ø-celler pr. pseudo-ø-plade vises. Repræsentative data fra seks donorer. (c) pseudoislets blev skabt med lentivirus transporterer shrna rettet mod human ATGL (målretning CCTGCCACTCTATGAGCTTAA, venstre) eller PLIN5 (målretning GACAAGCTGGAAGAGAAGCTT, højre). Kontrol pseudoislets blev transduceret med lentivirus, der udtrykker forvrænget sekvens (SCR) tidligere udgivet5. MRNA-ekspression for hvert gen blev bestemt af realtids polymerasekædereaktion (PCR) som tidligere offentliggjort5. Data blev udtrykt ved hjælp af 2-DDCT tager peptidylprolyl isomerase B (ppib) som en intern kontrol17. Hver prik repræsenterer data fra hver donor for en angivet primer, og et datasæt fra den samme donor er forbundet med en linje. N = 3 donorer. *; p < 0,05 af elevens t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenteres en detaljeret protokol til at generere humane pseudoisletter, der er transduceret af lentivirus ved hjælp af en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade eller en strips med mikrobrønde kultur plade. Pseudoislets er blevet rapporteret til at demonstrere morfologi og sekretoriske funktioner svarende til indfødte menneskelige Holme og kan dyrkes i længere tid in vitro5,11,18. I modsætning til indfødte menneskelige Holme, der viser en bred variation i størrelse, pseudoislets er relativt ensartet i størrelse, reducere variation mellem donorer og eksperimentelle replikater5,11. Downregulation af gener, der kræver høj effektivitet af transduktion kan udføres let før dannelsen af pseudoislets i enkelt cellesuspension. Denne metode undgår vanskeligheden af viral penetration gennem lag af celler i intakt Holme. Således, denne enkle, højeffektive, og reproducerbare protokol til skabelsen af humane pseudoislets har brede applikationer.
Mens flere forskellige platforme er blevet rapporteret for dannelsen af pseudoislets12,14,19,20, både en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade og en strips med mikrobrønde kultur plade er kommercielt tilgængelige, så denne teknik kan vedtages af ethvert laboratorium. Selv om hængende drop metode12 også tillader dannelsen af humane pseudoislets ved hjælp af almindeligt labware, potentielle begrænsninger omfatter vanskeligheden i at kontrollere størrelse og reaggregation varighed af pseudoislets. Disse begrænsninger skyldtes den begrænsede mængde pr. dråbe pseudo-ø og igangværende fordampning i løbet af den 5 − 7-dages kultur, der krævedes for pseudo-ø dannelse. Desuden, det er lettere at indeholde lentivirus med brug af en 96 godt ultra-lav fastgørelse plade eller en strips med mikrobrønde kultur plade sammenlignet med hængende-drop metode.
Flere trin i protokollen kræver nøje opmærksomhed. Optimering af fordøjelsen af intakte Holme med den proteolytiske og kollagenolytiske enzym blanding er kritisk, da både under-og over-fordøjelse vil reducere udbyttet af enkelt cellesuspension og efterfølgende påvirke aggregeringen af pseudoislets. Under fordøjelsen er det vigtigt nøje at overvåge Holme for forsvinden af klumper og stigningen i uklarhed som Holme dissocierer i enkeltceller. Det er vigtigt at bemærke, at det optimale tidspunkt for fordøjelsen varierer mellem Holme fra forskellige donorer. Den optimale tid er afhængig af flere faktorer, herunder sygehistorie og alder af hver donor, længden af iskæmi tid, den ø isolation procedure, der anvendes, ø størrelse, ø renhed, ø levedygtighed, og shipping betingelser. Typisk anvendes humane Holme med levedygtighed og renhed højere end 80% og inden for 5 dage efter isolation. Omhyggelig og blid pipettering under dispersion er også vigtigt at opretholde cellelevedygtighed og nyttiggørelse, der i sidste ende vil påvirke celle aggregering og den endelige størrelse af pseudoislets dannes. Ved udlevering af ø-cellesuspension til brønde (trin 3.1.4 og 3.2.7) er blid og grundig blanding af celler vigtigt for at opnå en jævn fordeling af enkeltceller i mikrobrønde. Hvis cellerne danner klumper efter 1 h inkubation med lentivirus, kræver det en blid pipettering for at bryde klumper i en enkelt cellesuspension inden den endelige Centrifugerings indstilling.
Vi har haft lignende succes med at skabe humane pseudoislets efter lentiviral transduktion ved hjælp af både en 96-brønd plade og strips med mikrobrønde Culture Plate. Valget mellem de to platforme afhænger af størrelsen og antallet af pseudoislets ønskes. En mikrobrønd kultur plade har små, pyramideformede bunde, der tillader kondensation af et mindre antal celler sammenlignet med en 96 godt rundt bundplade. Således kan antallet af celler pr. pseudoø reduceres for en mikrobrønd kultur plade. Desuden skaber et enkelt Centrifugerings trin alle pseudoislets samtidigt i en mikrobrønd kultur plade, mens der kræves flere pipettering for at skabe pseudoislets i en 96-brønd plade. Således er opskalering af dannelsen af pseudoislets lettere i en mikrobrønd kultur plade. Men den aktuelt tilgængelige mikrobrønd kultur plade giver ikke fleksibilitet i antallet af pseudo islets, der oprettes. I øjeblikket er det mindste antal af pseudoislets oprettet ved hjælp af en strips med mikrobrønde kultur plade 1.200 og kan kun øges med faktoren 1.200. Således bruger vi typisk en 96-brønd plade til pilotforsøg i mindre målestok og til et eksperiment, hvor små mængder prøver er tilstrækkelige, såsom en insulin sekretions analyse og RNA-ekstraktion for genekspression. Vi har brugt pseudoisletter fra en mikrobrønd kultur plade til assays, der kræver et stort antal celler som Western blot, iltforbrug sats bestemmelse af en metabolisk analysator, og triglycerid ekstraktion.
Den vigtigste begrænsning faktor for generering af humane pseudoislets er tabet af celler under forberedelsen af enkelt cellesuspension. Mens 1 IEQ af human Islet anses for at indeholde omkring 2.000 celler, inddrivelse af enkelt cellesuspension er typisk 30% eller lavere på grund af flere vask og passerer gennem en Strainer. Heterogenitet af ø størrelse gør det også vanskeligt at adskille alle Holme samtidigt. Mens blid pipettering og brugen af den proteolytiske og kollagenolytiske enzym blanding i protokollen er bestræbelser på at kombinere mekaniske og enzymatiske kræfter for maksimal genopretning af enkeltceller, der er stadig et uundgåeligt tab af celler. Anvendelsen af pseudoislets kræver således en klar begrundelse for at studere intakte humane Holme. Det skal også erindres, at insulinsekretionen fra pseudoislets er mere robust end Holme dyrket i samme periode af tiden, men har tendens til at være lavere sammenlignet med frisk isolerede Holme5,11.
Selv om der findes begrænsninger, kan stabil og højeffektiv genhæmning kombineret med bedre bevaring af glukose stimuleret insulinsekretion i længere tid i kulturen gøre det muligt at vurdere genfunktionen i humane ø-celler. Desuden, den komplekse intercellulære kommunikation mellem beta-beta og beta-non beta-celler foreslås at have en regulerende rolle i Islet funktion. Men, der er i øjeblikket begrænset information om intercellulære kommunikation inden for humane Holme. Med øget tilgængelighed af celle specifikke markører21, er det muligt at skabe humane pseudoislets med defineret celle sammensætning, som for nylig rapporteret i mus ø-celler22, som vil lette en bedre forståelse af cellen celle kommunikation mellem menneskelige ø-celler. Den seneste udvikling af billeddannelse af tredimensionale væv også potentielt øger nytten af humane pseudoislets som en model til at afsløre, hvordan cellulære polaritet og intercellulære kommunikation er reguleret i menneskelige Holme. Således, humane pseudoislets give en nyttig model til dissekere funktioner af gener af interesse og andre spørgsmål inden for ø-biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansielt støttet af National Institutes of Health til Y.I. (R01-DK090490) og American diabetes Association til Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. og Y.I. understøttes af den broderlige orden af Eagles Diabetes Research Center. A.B. støttes af et nationalt Institut for sundhedsuddannelse (T32NS45549). Forfattere udnyttet menneskelige pancreas Holme leveres af NIDDK-finansierede integreret Islet distribution program (IIDP) på City of Hope (2UC4DK098085).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| Cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| Inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| Motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| Non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| Pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| Pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| Pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| Pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| Pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| Pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| Reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| Swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| Ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
