Summary
En protokoll for å skape gen modifiserte menneskelige pseudoislets fra spredte transduced-celler som er blitt presentert av lentivirus som bærer korte hæler RNA (shRNA) presenteres. Denne protokollen utnytter lett tilgjengelig enzym-og kultur fartøy, kan utføres enkelt, og produserer genmodifiserte menneskelige pseudoislets egnet for funksjonelle og morfologiske studier.
Abstract
Ulike genetiske verktøy er tilgjengelige for å modulere gener i bukspyttkjertelen holmer gnagere å analysere funksjon av Holme gener for diabetes forskning. Data innhentet fra gnagere holmer er imidlertid ofte ikke fullt ut gjengitt i eller gjelder for menneskelige holmer på grunn av velkjente forskjeller i Holme struktur og funksjon mellom artene. Foreløpig teknikker som er tilgjengelige for å manipulere genuttrykk for menneskelige holmer er svært begrenset. Innføring av transgene i intakte holmer av adenovirus, plasmider, og oligonukleotider ofte lider av lav effektivitet og høy toksisitet. Lav effektivitet er spesielt problematisk i gen downregulation studier i intakte holmer, som krever høy effektivitet. Det har vært kjent at enzymatisk-spredte Holme celler reaggregate i kultur forming spheroids kalt pseudoislets. Størrelses kontrollert reaggregasjon av menneskelig Holme celler skaper pseudoislets som opprettholder dynamisk første fase insulin sekresjon etter langvarig kultur og gir et vindu for å effektivt innføre lentiviral korte hæler RNA (shRNA) med lav toksisitet. Her beskrives en detaljert protokoll for etablering av menneskelig pseudoislets etter lentiviral Transduction med to kommersielt tilgjengelige multiwell plater. Protokollen kan enkelt utføres og gir mulighet for effektiv downregulation av gener og vurdering av dynamikken i insulin sekresjon ved hjelp av menneskelig Holme celler. Således, menneskelig pseudoislets med lentiviral mediert gen moduleringshjul gir en kraftig og allsidig modell for å vurdere gen funksjon innenfor menneskelig Holme celler.
Introduction
Tap av funksjonell beta celle massen er den sentrale patologi for både type 1 og type 2 diabetes1. Mens beta celler er produsentene av insulin i bukspyttkjertelen holmer, kommunikasjon mellom beta celler og ikke-beta-celler spiller en avgjørende rolle i regulering av insulin sekresjon2. I tillegg feilregulering av glukagon sekresjon bidrar til hyperglykemi i diabetes3. Dermed er det sterk interesse for modulere genuttrykk av celler innenfor bukspyttkjertelen holmer å ta opp mekanismen bak utviklingen av Holme dysfunksjon i diabetes. En rekke tilnærminger inkludert transgene mus er tilgjengelig for modulere genuttrykk av mus holmer. Men menneskelige og mus holmer viser distinkte innervasjon, celle distribusjon, ratio av beta til alfa celler, og respons på secretagogues4. Derfor er direkte vurdering av gen funksjon i menneskelige holmer svært viktig for å forstå patofysiologi av menneskelige bukspyttkjertel holmer.
Adenoviral vektor er den mest brukte viral vektor til overfører bukspyttkjertelen holmer in vitro på grunn av den høye effektiviteten av Transduction i ikke-deler celler. Men adenovirus ikke inn i kjernen av holmer effektivt, spesielt i menneskelige holmer5, og er cytotoksisk ved høye doser6. Relativt, er lentiviral vektor mindre cytotoksisk og leverer eksogene gener permanent inn i kromosom av post-mitotisk celler, noe som gjør det til et allment testet kjøretøy for genterapi7. Imidlertid er lentivirus evne til å trenge inn i kjernen av intakt menneskelige holmer også begrenset, og dermed krever delvis spredning av enzymatisk fordøyelsen å øke Transduction effektivitet8. Den påminnelse med spredning av intakt menneskelige holmer er avbrudd av celle-celle og celle-matrise kommunikasjon, som kompromisser den dynamiske reguleringen av insulin sekresjon kritisk for vedlikehold av glukose homeostase hos mennesker9. Dermed har det vært utfordrende å vurdere effekten av gen modulering på den dynamiske reguleringen av Holme funksjon i en modell av menneskelige holmer.
Det har vært kjent at spredte Holmen celler fra menneske og gnager holmer selvstendig reaggregate i Holme-lignende strukturer kalt "pseudoislets". Pseudoislets Vis beta og ikke-beta celle distribusjon lik native holmer10,11. I tillegg, etter lang tids kultur, innfødte holmer gradvis miste robust første fase insulin sekresjon5,10,11,12. Likevel viste pseudoislets bedre bevaring av første fase insulin sekresjon som respons på glukose sammenlignet med innfødte etter samme kultur periode5. I tillegg til å ha bedre bevaring av insulin sekresjon, størrelse-kontrollerte reaggregasjon av menneskelig Holme celler i lav festeplater11 gir et vindu av muligheter til å innføre lentivirus vektorer før deres reaggregasjon i pseudoislets. Flere studier har vist nytten av pseudoislets kombinert med lentiviral mediert Transduction. Caton et al.13 rapporterte at innføringen av den grønne fluorescerende PROTEIN (GFP) uttrykker lentivirus hadde liten effekt på insulin sekresjon mens oppnå homogen uttrykk for GFP i rotte pseudoislets sammenlignet med ikke-infiserte kontroll. De viste også den spesifikke effekten av ulike connexins på insulin sekresjon av overexpressing connexins 32, 36, og 43 via lentivirus13. Human pseudoislets fremstilt med en kommersielt anvendelig 96-frisk ultra-lav festeplate bevist det lentiviral-mediert overuttrykte av transkripsjon faktoren SIX3 gjøre bedre insulin sekresjon vurdert av statisk inkubasjons14. Nylig, Human pseudoislets fremstilt med en 96-brønn ultra-lav festeplate ble brukt til å downregulate glucokinase via lentiviral kort hår RNA (shRNA) som et bevis på prinsippet å vise at glukose-stimulert insulin sekresjon er redusert, mens KCl-stimulert insulin sekresjon ble bevart5. Studien viste også at menneskets pseudoislets er lik innfødte holmer i genuttrykk og sekretoriske profiler, ytterligere støtte nytten av menneskelig pseudoislets å analysere regulering av Holme funksjon5. Selv om perifusion ikke ble utført, en bioengineered mikrotiterplateleser kultur plate som nylig ble kommersielt tilgjengelig, ble også rapportert å være kompatibel for lentiviral Transduction og produsert menneskelig pseudoislets som utstilt utmerket insulin sekresjon in vitro og in vivo etter transplantasjon11. Kollektivt, menneskelig pseudoislet formasjon kombinert med lentiviral Transduction er en enkel og effektiv tilnærming til å etterforske menneskelig Holme patofysiologi, som gir et verdifullt verktøy for å utføre mekanistisk studier i menneskelige holmer.
I den gjeldende rapporten, en protokoll for å danne menneskelige pseudoislets transduced med lentivirus ved hjelp av to kommersielt tilgjengelige plattformer, en 96-brønn ultra-lav festeplate og en mikrotiterplateleser kultur plate presenteres. Både oppnå effektiv modulering av genuttrykk og skape menneskelige pseudoislets som er kompatible for nedstrøms vurderinger inkludert statiske inkubasjons og perifusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før oppstart av studier, en menneskelig forskning bestemmelse ble gjort av University of Iowa institusjonelle Review Board, som fastslått at studien ikke oppfyller kriteriene for menneskelige forskning. Rådfør deg med den lokale gjennomgangen før studien innledes for å finne ut om kilden til holmer og planlagt studie krever forhåndsgodkjenning.
Merk: Vanligvis kreves 1200 − 1400 Holme ekvivalent (IEQ) av menneskelige holmer for dannelsen av 192 pseudoislets på størrelse med 3 000 celler/pseudoislets i en 96-brønn ultra-lav festeplate eller 1 200 pseudoislets på størrelsen av 500 celler/pseudoislets i en mikrotiterplateleser kultur plate. IEQ av holmer som kreves varierer mellom ulike preparater av menneskelige holmer som giver faktorer (alder, helse, vekt), isolasjons effektivitet, og kultur forhold påvirker utbyttet av enkelt celle suspensjon. I denne protokollen brukes lentivirus som inneholder shRNA som målretter mot et gen av interesse. Den Cytomegalovirus (CMV) og Human phosphoglycerate kinase (hPGK) promoter basert lentiviral vektorer rapporteres til Down-regulere genet effektivt i Human pseudoislets5,15. Bruk av lentivirus krever forholdsregler som Biohazard16. Kontakt den lokale biosafety komiteen før oppstart av bruk av lentivirus.
1. overnight kultur av Human holmer for gjenvinning etter forsendelse
- Forbered Connaught Medical Research Laboratories 1066 (CMRL-1066) medium supplert med 1% humant serum albumin (HSA) ved å kombinere 50 mL CMRL-1066, 0,5 g av HSA, 0,5 mL av penicillin-Streptomycin, og 0,5 mL av 100 mg/mL glutamin (1% HSA CMRL) i biologisk sikkerhetskabinett (BSC) og passerer gjennom et 0,2 μm filter for sterilisering.
- Snurr frakt flasken forsiktig for å holde holmer i suspensjon. Overfør frakt mediet som inneholder holmer til et 50 mL konisk sentrifugerør. La røret sitte i BSC i 15 min slik at holmer bosette til bunnen av røret.
- Fjern frakt medium forsiktig uten å forstyrre Holmen pellet ved hjelp av en 10 mL pipette. Re-suspendere Holmen pellet i 1% HSA CMRL til en konsentrasjon av 400 IEQ/mL.
- Overføring holmer til en ikke-vev kultur behandlet parabolen. Hvis holmer er delt i flere retter, hold holmer jevnt suspendert i medium ved å virvler forsiktig før splitting. Kultur holmer ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator over natten.
Merk: Bruk av en ikke-vev kultur behandlet parabolen er nødvendig for å hindre feste av holmer til platen.
2. utarbeidelse av single Cell suspensjon fra Human holmer
- Forbered følgende: CMRL-1066 medium med 10% varme-deaktivert fosterets storfe serum (HiFBS), penicillin-Streptomycin, og glutamin (10% HiFBS CRML) ved romtemperatur (RT), en 40 μm sil, en 35 mm Petri parabol, en 1 mL tuberkulin sprøyte, og en hemocytometer.
- Overfør menneskelige holmer etter overnatting kultur til et 15 mL konisk sentrifugerør. Sentrifuger på 190 x g i 5 min i en svingende-bøtte rotor. Aspirer medium med en 5 mL pipette uten å forstyrre Holmen pellet.
- Vask pellet ved å legge 10 mL av fosfat-bufret saltvann (PBS) i røret, bland forsiktig, og sentrifuger på 190 x g for 5 min. aspirer PBS uten å forstyrre Holmen pellet.
- Re-suspendere Holmen pellet i 0,5 mL av en pre-varmet proteolytiske og collagenolytic enzym blanding og Pipetter 5x bruke en P1000 pipette å blande holmer. Ruge ved 37 ° c i 5 min. bland med pipettering opp og ned forsiktig 1 − 5 ganger.
Merk: Aggressive pipettering vil øke celle tap. - Se etter skydekke (enkeltceller) og antall flak (ufordøyd holmer). Tilsett 2 − 3 min til 37 ° c inkubasjons avhengig av omfanget av fordøyelsen bedømt av skydekke og antall flak. Stopp fordøyelsen når flak er redusert til ~ 10% av predigestion og løsningen er skyet.
Merk: Tiden som kreves for fordøyelsen varierer avhengig av Holmen størrelsesfordeling av hver menneskelig Holme forberedelse. - Plasser en 40 μm sil i en 35 mm Petri parabol og fukt sil ved å legge 1 mL 10% HiFBS CMRL og trykke med 1 mL sprøyte stempel. Overfør alle celle oppheng på toppen av sil og samle pass-through i en fersk 15 mL tube.
- Vask røret brukes til Holme fordøyelsen med 0,5 mL frisk CMRL medium for å samle leftover celler og passerer vaske gjennom sil. Kombiner pass-through i et 15 mL rør. Gjenta én gang.
- Deretter distansere ufordøyd holmer igjen på sil ved å trykke på sil plassert i en 35 mm rett med 1 mL sprøyte stempel. Samle pass-through igjen og vask sil med friskt CMRL-1066 for å fjerne alle gjenværende fordøyd holmer fra sil og parabolen. Totalt ~ 3 mL enkelt celle fjæring vil nå være i 15 mL røret.
- Registrere det totale volumet av celle suspensjonen og ta 10 μL alikvot av celler for å telle celle tallet på en hemocytometer.
- Sentrifuger celle fjæringen i 5 minutter ved 200 x g. Fjern medium uten å forstyrre pellet. Fortsett til trinn 3.1.1 Hvis du bruker en 96-brønn ultra-lav festeplate eller trinn 3.2.1 Hvis du bruker en 24 godt mikrotiterplateleser kultur plate å reaggregate cellene.
3. Pseudoislet formasjon og Transduction av lentivirus
- Protokoll som bruker en 96-brønn med svært lav
- Bestem ønsket antall celler per pseudoislet og antall pseudoislets som skal opprettes. Vanligvis brukes 1000 − 3000 celler for hver pseudoislet for en 96-brønn ultra-lav festeplate. For 3 000 celler per pseudoislet, Juster celle fjæringen til 1 x 105 celler/ml ved å blanding Holmen pellet fra trinn 2,10 i 10% HiFBS CMRL slik at 30 μL av celle suspensjon har 3 000 celler. Beregn det totale volumet på 1 x 105 celler/ml av en enkelt celle suspensjon (ml) som kreves ved hjelp av følgende ligning:
Det totale volumet av 1 x 105 celler/ml enkelt celle suspensjon (ml) = (antall celler per pseudoislet) x (antall pseudoislets gjøres)/1 x 105.
Merk: Juster konsentrasjonen av celle fjæringen basert på ønsket antall celler per pseudoislet, slik at 30 μL av celle oppheng gjør en pseudoislet. - Overfør det nødvendige volumet (30 μL x antall pseudoislets) av enkelt celle oppheng til et friskt 15 mL rør. Legg 250 Transduction enheter (TU)/Cell av lentivirus som inneholder shRNA rettet mot et gen av interesse eller kontroll.
Forsiktig: Lentivirus er klassifisert som biosafety nivå 2 og kan integreres i DNA av infiserte celler.
Merk: Bruk konsentrert lentivirus slik at volumet av lentivirus lagt til er minimal. Titer som kreves per celle for effektiv gendeaktivering kan variere avhengig av lentiviral konstruksjon. - Bland celle suspensjon med virus ved pipettering forsiktig 5x med en P1000 pipette. Overfør blandede celler til et 50 mL sterilt reagens reservoar hvis du bruker en 8-kanals pipette.
- Dispensere 30 μL per brønn av enkelt celle oppheng blandet med lentivirus i hver brønn ved hjelp av en 8-kanals pipette eller en P200 pipette avhengig av antall brønner.
- Sentrifuger den 96-brønn plate i en svingende-bøtte plate sentrifuge ved 270 x g ved RT for 7 min. Sjekk om cellene er samlet i midten av hver brønn. Hvis ikke, sentrifuger igjen som innsamling av alle celler i sentrum av brønnen er avgjørende for pseudoislet formasjon. Kultur ved 37 ° c i en fuktet 5% CO2 inkubator over natten.
- Tilsett 100 μL av pre-varmet 10% HiFBS CMRL per brønn neste morgen for å unngå tørking av celler under påfølgende kultur. Sentrifuger på 270 x g, RT for 7 min. kultur ved 37 ° c i en 5% co2 inkubator. Pseudoislets vil fullføre formasjonen i 5 − 7 dager.
- Når høsting pseudoislets, pre-varme ønsket volum på 10% HiFBS CMRL (100 μL per Holme), forberede 1 50 mL sterilt reservoar, en steril 10 cm Petri parabol, og en 8-kanals pipette i BSC.
- Fjern 96-brønn platen fra inkubator og plasser i BSC. Pipetter 100 μL per Holme på 10% HiFBS CMRL inn i et reservoar.
- Pipetter 100 μL per brønn på 10% HiFBS CMRL fra et reservoar for å pseudoislets og pipette opp og ned 2 − 3 ganger forsiktig i brønnen for å løfte holmer opp. Deretter aspirer medium i brønnen inneholder en pseudoislet og kaste ut i en 10 cm Petri parabolen. Bruk av en 8-kanals pipette tillater overføring av 8 pseudoislets på en gang.
- Kontroller platen under et lett mikroskop for å sikre fullstendig fjerning av alle pseudoislets. Pseudoislets danner faste aggregater og forblir aggregert etter løfting. Pseudoislets er nå klare for nedstrøms eksperimenter.
- Bestem ønsket antall celler per pseudoislet og antall pseudoislets som skal opprettes. Vanligvis brukes 1000 − 3000 celler for hver pseudoislet for en 96-brønn ultra-lav festeplate. For 3 000 celler per pseudoislet, Juster celle fjæringen til 1 x 105 celler/ml ved å blanding Holmen pellet fra trinn 2,10 i 10% HiFBS CMRL slik at 30 μL av celle suspensjon har 3 000 celler. Beregn det totale volumet på 1 x 105 celler/ml av en enkelt celle suspensjon (ml) som kreves ved hjelp av følgende ligning:
- Protokoll som bruker en 24-brønn mikrotiterplateleser kultur plate
- Varm opp skylle løsning for anti-tilslutning (materialfortegnelsen) til RT for effektiv spheroid dannelse. Også, pre-varm vanlig CMRL-1066 og 10% HiFBS CMRL.
- Tilsett 500 μL per brønn av den anti-overholdelse skylle løsningen til hver brønn av 24-brønn mikrotiterplateleser kultur plate som skal brukes til pseudoislets. Sentrifuger på 1 300 x g i 5 min i en svingende-bøtte plate sentrifuger.
- Legg merke til platen under et mikroskop for å sikre at luftbobler fjernes fra microwells. Hvis luftbobler er fanget i microwells, sentrifuger på 1 300 x g for 5 min igjen.
- Aspirer den anti-overholdelse skylle løsning fra brønnene i en BSC. Skyll hver brønn med 2 mL varm vanlig CMRL-1066 en gang. Aspirer CMRL-1066. Tilsett 0,5 mL/vel av varm 10% HiFBS CMRL til hver godt planlagt for bruk. Wells er nå klar for lasting spredt menneskelige Holme celler utarbeidet i trinn 2,10.
- Bestem det totale antallet celler som trengs for hver brønn. En brønn av 24-brønn mikrotiterplateleser kultur plate inneholder 1 200 microwells og danner 1 200 pseudoislets. 500 celler per pseudoislet x 1200 microwells = 6 x 105 celler. Resuspend enkeltceller fra trinn 2,10 til 6 x 105 celler i 0,8 ml på 10% HiFBS CMRL i et sterilt 1,5 ml rør.
Merk: Maksimalt volum per brønn er 2 mL. Volum av celle suspensjon bør ikke overstige 1,5 mL. Protokollen beskriver fremgangsmåten for å opprette en brønn av pseudoislet transduced ved lentivirus. Skaler opp avhengig av antall brønner som skal gjøres for hver lentivirus. - For viral Transduction, tilsett 125 TU/Cell til den enkle celle fjæringen. Hold volumet av viruset under 0,2 mL. Ruge cellen og virus blandingen ved 37 ° c med sporadisk skånsom miksing for 1 t for å tillate kontakt med celler med virus før kondens av celler i trinn 3.2.8.
Merk: Bruk konsentrert lentivirus slik at volumet av lentivirus lagt til er minimum. Lavere antall TU per celle brukes for protokoll 2 sammenlignet med protokoll 1 som det totale volumet av medium per celle tall er mindre. Titer som kreves per celle for effektiv gendeaktivering kan imidlertid variere avhengig av lentiviral konstruksjon og behov for optimalisering.
Forsiktig: Lentivirus er klassifisert som biosafety nivå 2 og kan integreres i DNA av infiserte celler. - Etter 1 time, Juster det totale volumet av holmen celle og virus blandingen til 1 mL ved å legge 10% HiFBS CMRL. Hvis celler danner klump etter 1 h inkubasjons, spre seg til enkelt celle suspensjon av milde og raske pipettering 2 − 3 ganger. Pipettering er svært viktig for jevn fordeling av celler på tvers av microwells. Overfør celle suspensjon til en brønn av 24-brønn mikrotiterplateleser kultur plate.
- Umiddelbart etter pipettering, sentrifuger på 100 x g for 3 min ved RT å Capture celler i alle microwells. Observer under et mikroskop for å kontrollere at cellene er jevnt fordelt i alle microwells.
- Kultur mikrotiterplateleser kultur plate ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator. Pseudoislets vil danne i 24 − 48 h. Pseudoislets kan bli kultivert uten medium endring i opptil 7 dager.
- Ved endring av medium for kultur utover 7 dager, Erstatt 50% − 75% av medium for hver medium endring som følger. Fjern langsomt 0,5 − 1 mL medium ved hjelp av en P1000 pipette fra hver brønn. Tilsett 0,5 − 1 mL fersk 10% HiFBS CMRL langsomt ved å plassere et tips på veggen av brønnen for å unngå dislodging pseudoislets fra mikrotiterplateleser kultur plate.
- For å forberede for høsting pseudoislets, varme opp 10% HiFBS CMRL medium. Pseudoislets tendens til å flyte opp i serum gratis CMRL-1066 gjør det vanskelig å plukke dem.
- Aspirer 0,5 mL medium fra brønn ved hjelp av en 1 mL pipette og dispensere Media kraftig tilbake til plateoverflaten for å løfte opp pseudoislets fra mikrotiterplateleser kultur plate.
- Forsiktig aspirer forskyves pseudoislets ved hjelp av 1 mL pipette og overføre holmer til en ikke-vev kultur behandlet 6-brønn plate. Passere gjennom en liten 37 μm reversibel sil plassert på en 15 mL konisk rør. Pseudoislets vil forbli på filteret; eventuelle kommunefritt enkeltceller vil strømme gjennom.
Merk: For å unngå tap av mindre størrelse pseudoislets gjennom sil, kan sil utelates. - Dispensere 1 mL 10% HiFBS CMRL over hele overflaten av brønnen for å løsne eventuelle gjenværende pseudoislets, aspirer forskyves pseudoislets, og passerer gjennom sil. Gjenta 3x for å sikre fullstendig samling av alle pseudoislets fra brønnene.
- Observer den mikrotiterplateleser kultur platen under et Inverter mikroskop for å sikre at alle pseudoislets er samlet. Gjenta vasken som i trinn 3.2.14 hvis pseudoislets gjenstår.
4. RNA-ekstraksjon for evaluering av effektivitet i Gene-demping
- Pick pseudoislets inn i RNase gratis PBS i en 1,5 mL mikrosentrifugen tube og sentrifuger på 300 x g i 3 min ved 4 ° c. Fjern PBS uten å forstyrre Holmen pellet og vask en gang med PBS etterfulgt av sentrifugering ved 300 x g i 3 min ved 4 ° c.
- Aspirer de fleste av PBS bruker en P1000 pipette. Deretter bytter du til en P10 pipette for å fjerne resten av PBS uten å forstyrre Holmen pellet.
- Tilsett 0,5 mL guanidiniumklorid ammoniumthiocyanat RNA-avsugs reagens (materialfortegnelsen) per rør. Homogenisere pseudoislets ved hjelp av en motor drevet morter for 2 − 3 ganger. Homogenate i guanidiniumklorid ammoniumthiocyanat RNA-avsugs reagens kan nå oppbevares ved-80 ° c eller bearbeides for RNA-rensing.
Merk: 24 av de 3 000 celle pseudoislets som dannes i en 96 brønn plate eller 48 av den 500 celle-pseudoislets som dannes i en mikrotiterplateleser kultur plate, er tilstrekkelig til å oppnå 0,5 − 1 mikrogram RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer viktige trinn i produksjonen av pseudoislets ved hjelp av en 96-brønn ultra-lav festeplate og en mikrotiterplateleser kultur plate. Figur 2a viser sekvensielle endringer i morfologi under dannelsen av pseudoislets fra 3 x 103 Human islet celler i en 96-brønn ultra-lav festeplate. Monolag eller løse klumper av celler observert i dag 1 endret til solide aggregater med en jevn, rund kantlinje etter dag 5 til 7 (figur 2a). I en mikrotiterplateleser kultur plate er dannelsen av solide pseudoislets vanligvis synlig innen 4 dager (fig.2b). Når 600 celler/mikrotiterplateleser ble belagt i mikrotiterplateleser kultur plate, ble menneske Holme celler kondensert i spheroids av uniform størrelse. Det er observert at en mikrotiterplateleser kultur plate gjør at en vellykket dannelse av pseudoislets fra et lite antall celler sammenlignet med en 96-brønn ultra-lav festeplate. Vanligvis er over 1 500 celler/pseudoislet nødvendig for en 96-vel ultra-lav festeplate, mens 500 celler/pseudoislet er tilstrekkelig for en 24-brønn mikrotiterplateleser kultur plate. Vellykket dannet pseudoislets forbli som spheroids etter utvinning fra en 96 ultra-lav festeplate eller en mikrotiterplateleser kultur plate og er kompatible for nedstrøms applikasjoner, inkludert statiske inkubasjons (figur 3a) og Perifusion (figur 3b). den enhetlige størrelsen på pseudoislets reduserer variasjonen i en testgruppe og tillater statisk inkubasjons med så lite som 5 pseudoislets per måling (figur 3a). Også menneskelige pseudoislets opprettholdt robust første fase insulin sekresjon som svar på glukose etter 7 dager med kultur når den opprinnelige menneskelige holmer kultivert for en lignende periode viste avstumpet første fase glukose-stimulert insulin sekresjon ( Figur 3b)5. Innføringen av lentivirus i en enkelt celle suspensjon sikrer effektiv og homogen Transduction av Holme celler og oppnår svært effektiv ned-regulering av gener som vist i figur 3c. Alle resultatene som vises ble innhentet ved hjelp av menneskelige holmer fra ikke-diabetiker donorer.
Figur 1: prosessen med menneskelig pseudoislet forberedelse. (a) suspensjonen inneholder 4 000 IEQ av menneskelige holmer blir skyet etter fordøyelsen av en proteolytiske og collagenolytic enzym blanding og mild pipettering. (b) menneskelige holmer etter spredning er passert gjennom en sil. Ufordøyd holmer på toppen av sil spres ved hjelp av en 1 mL sprøyte stempel. (c, d) Mikroskop bilder av en enkelt celle suspensjon inneholder 3 000 celler/brønn i en 96-brønn ultra-lav festeplate før (c) og etter (d) sentrifugering. (e, f) Mikroskop bilder av en enkelt celle suspensjon inneholder 500 celler/mikrotiterplateleser i en 24-brønn mikrotiterplateleser kultur plate før (e) og etter (f) sentrifugering. Scale bar = 250 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: morfologi av menneskelig pseudoislets. Sekvensielle endringer i morfologi av menneskelig pseudoislets opprettet (a) i en 96-brønn ultra-lav festeplate fra 3 000 celler og (b) i en 24-brønn mikrotiterplateleser kultur plate fra 500 celler. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksempler på funksjonelle analyser ved hjelp av humant pseudoislets. (a) representative statiske inkubasjons utført ved hjelp av menneskelige pseudoislets opprettet i en mikrotiterplateleser kultur plate fra en enkelt donor på størrelse med 500 menneskelig Holme celler per pseudoislet. Fire sett med 5 pseudoislets ble inkubert for 1 t i Krebs-ringer bikarbonat buffer supplert med enten 2 mM eller 16,8 mM glukose. Hvert symbol representerer insulin sekresjon fra ett sett av 5 pseudoislets. Mean ± standard feil av gjennomsnittet (SEM) vises. *, p < 0,05 av studentens t test. Representative resultater fra tre donorer. (b) representative perifusion tester insulin sekresjon fra humant pseudoislets opprettet i en mikrotiterplateleser kultur plate som respons på 16,7 mm glukose og 30 mm KCl. metode for perifusion ble tidligere utgitt5. Gjennomsnittlig ± SEM av insulin sekresjon fra to sett med 40 pseudoislets opprettet i en mikrotiterplateleser kultur plate fra en enkelt donor på størrelse med 500 menneskelig Holme celler per pseudoislet plate er vist. Representative data fra seks donorer. (c) Pseudoislets ble opprettet med lentivirus bære shRNA målretting menneskelig ATGL (målretting CCTGCCACTCTATGAGCTTAA, venstre) eller PLIN5 (målretting GACAAGCTGGAAGAGAAGCTT, høyre). Kontroll pseudoislets ble transduced med lentivirus uttrykke kryptert sekvens (scr) tidligere utgitt5. MRNA uttrykk for hvert gen ble bestemt av sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR) som tidligere utgitt5. Data ble uttrykt med 2-DDCT tar peptidylprolyl Isomerase B (PPIB) som en intern kontroll17. Hver prikk representerer data fra hver giver for en angitt primer og et datasett fra samme donor er koblet sammen med en linje. N = 3 donorer. *; p < 0,05 av studentens t test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, en detaljert protokoll for å generere menneskelige pseudoislets som er transduced av lentivirus bruker en 96-brønn ultra-lav festeplate eller en mikrotiterplateleser kultur plate er presentert. Pseudoislets har blitt rapportert å demonstrere morfologi og sekretoriske funksjoner som ligner på innfødte menneskelige holmer og kan være kultivert for lengre tid in vitro5,11,18. I motsetning til innfødte menneskelige holmer som viser en stor variasjon i størrelse, pseudoislets er relativt ensartet i størrelse, redusere variasjon mellom givere og eksperimentelle replikerer5,11. Downregulation av gener som krever høy effektivitet av Transduction kan utføres lett før dannelsen av pseudoislets i enkelt celle suspensjon. Denne metoden unngår vanskelighetene med viral penetrasjon gjennom lag av celler i intakte holmer. Således, denne enkel, høylig effektiv, og reproduserbar protokollen for det kreasjon av Human pseudoislets har bred søknadene.
Mens flere forskjellige plattformer har blitt rapportert for dannelsen av pseudoislets12,14,19,20, både en 96-brønn ultra-lav festeplate og en mikrotiterplateleser kultur plate er kommersielt tilgjengelig, slik at denne teknikken skal vedtas av ethvert laboratorium. Selv om den hengende dråpe metoden12 også tillater dannelsen av menneskelige pseudoislets bruker felles utstyr, potensielle begrensninger inkluderer vanskeligheter med å kontrollere størrelsen og reaggregasjon varighet av pseudoislets. Disse begrensningene skyldtes det begrensede volumet per dråpe pseudoislet og pågående fordampning i løpet av 5 − 7 dagers kulturen som kreves for pseudoislet formasjon. I tillegg er det lettere å inneholde lentivirus med bruk av en 96 vel ultra-lav festeplate eller en mikrotiterplateleser kultur plate sammenlignet med hengende-drop-metoden.
Flere trinn i protokollen krever nær oppmerksomhet. Optimalisere fordøyelsen av intakte holmer med proteolytiske og collagenolytic enzym blandingen er kritisk siden både under-og over-fordøyelsen vil redusere utbyttet av enkelt celle suspensjon og senere påvirke aggregering av pseudoislets. Under fordøyelsen er det viktig å nøye overvåke holmer for forsvinningen av klumper og økningen i skydekke som holmer distansere i enkeltceller. Det er viktig å merke seg at den optimale tiden for fordøyelsen varierer mellom holmer fra ulike givere. Den optimale tiden er avhengig av flere faktorer, inkludert medisinsk historie og alder av hver donor, lengden av iskemi tid, Holmen isolasjons prosedyre brukt, Holme størrelse, Holme renhet, Holme levedyktighet, og shipping forhold. Vanligvis brukes menneskelige holmer med levedyktighet og renhet høyere enn 80% og innen 5 dager med isolasjon. Forsiktig og skånsom pipettering under dispersjon er også viktig å opprettholde celle levedyktighet og utvinning som til slutt vil påvirke celle aggregering og den endelige størrelsen på pseudoislets dannes. Ved dispenser Holme celle suspensjon til brønner (trinn 3.1.4 og 3.2.7), skånsom og grundig blanding av celler er viktig å oppnå en jevn fordeling av enkeltceller i microwells. Hvis cellene danner klumper etter 1 h inkubasjons med lentivirus, det krever milde pipettering å bryte klumper i enkelt celle suspensjon før den endelige sentrifugering.
Vi har hatt lignende suksess i å skape menneskelige pseudoislets etter lentiviral Transduction bruker både en 96-brønn plate og mikrotiterplateleser kultur plate. Valget mellom de to plattformene avhenger av størrelsen og antall pseudoislets ønsket. En mikrotiterplateleser kultur plate har liten, pyramide formet bunner slik kondens av et mindre antall celler sammenlignet med en 96 godt runde bunnplate. Dermed kan antall celler per pseudoislet reduseres for en mikrotiterplateleser kultur plate. Et enkelt sentrifugering trinn oppretter også alle pseudoislets samtidig i en mikrotiterplateleser kultur plate, mens flere pipettering kreves for å lage pseudoislets i en 96 brønn plate. Således, skalering opp opprettelsen av pseudoislets er lettere inne en mikrotiterplateleser kulturen tallerken. Imidlertid, det aktuelle anvendelig mikrotiterplateleser kulturen plate er ikke tilbud fleksibiliteten inne antallet av pseudoislets tilværelse skapt. Foreløpig minimum antall pseudoislets opprettet ved hjelp av en mikrotiterplateleser kultur plate er 1 200 og kan økes bare ved faktor på 1 200. Derfor bruker vi vanligvis en 96 brønn plate for forsøks eksperimenter i liten skala og for et eksperiment der små mengder prøver er tilstrekkelig, for eksempel en insulin sekresjon analyse og RNA-ekstraksjon for genuttrykk. Vi har brukt pseudoislets fra en mikrotiterplateleser kultur plate for analyser som krever et stort antall celler som Western Blot, oksygenforbruk rate fastsettelse av en metabolsk analysator, og triglyserider utvinning.
De viktigste begrensende faktor for generering av menneskelig pseudoislets er tap av celler under utarbeidelse av enkelt celle suspensjon. Mens 1 IEQ av menneskelig Holme anses å inneholde rundt 2 000 celler, utvinning av enkelt celle suspensjon er vanligvis 30% eller lavere på grunn av flere vasking og passerer gjennom en sil. Heterogenitet av Holme gjør det også vanskelig å distansere alle holmer samtidig. Mens milde pipettering og bruk av proteolytiske og collagenolytic enzym blandingen i protokollen er arbeidet med å kombinere mekaniske og enzymatisk krefter for maksimal utvinning av enkeltceller, er det fortsatt en uunngåelig tap av celler. Dermed krever anvendelsen av pseudoislets klar begrunnelse over å studere intakt menneskelige holmer. Det må også bli minnet om at insulin sekresjon fra pseudoislets er mer robust enn holmer kultivert for samme periode av tiden, men har en tendens til å bli lavere sammenlignet med friske isolerte holmer5,11.
Selv om det foreligger begrensninger, vil stabil og svært effektiv gendeaktivering kombinert med bedre bevaring av glukose stimulert insulin sekresjon for lengre tid i kulturen muliggjøre vurdering av gen funksjonen i menneske Holme celler. I tillegg er den komplekse intercellulære kommunikasjonen mellom beta-beta og beta-ikke beta celler foreslått å ha en regulerende rolle i Holme funksjon. Det er imidlertid for tiden begrenset informasjon om intercellulære kommunikasjon innenfor menneske holmer. Med økt tilgjengelighet av celle spesifikke markører21, er det mulig å skape menneskelige pseudoislets med definert celle sammensetning, som nylig rapportert i mus Holme celler22, som vil legge til rette for bedre forståelse av celle-celle kommunikasjon mellom menneskelige Holme celler. Den nylige fremme av Imaging av tre-dimensjonale vev også potensielt øker nytten av menneskelig pseudoislets som en modell for å avsløre hvordan mobilnettet polaritet og intercellulære kommunikasjon er regulert i menneskelige holmer. Således, Human pseudoislets skaffe en nyttig modell å analysere funksjonene av gener av begrave og annet spørsmål inne feltet av Holme Biology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) og American Diabetes Association til Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. og Y.I. støttes av broderlig Order of Eagles diabetes Research Center. A.B. er støttet av en National Institutes of Health Training Grant (T32NS45549). Forfattere benyttet menneskelige bukspyttkjertelen holmer levert av NIDDK-finansiert Integrated Islet Distribution program (IIDP) på City of Hope (2UC4DK098085).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| Cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| Inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| Motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| Non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| Pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| Pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| Pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| Pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| Pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| Pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| Reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| Swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| Ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
