Summary
Hier presenteren we een gemakkelijk toepasbare protocol om de opslag stabiliteit van de extracellulaire blaasjes te beoordelen, een groep van nature voorkomende nanodeeltjes geproduceerd door cellen. De blaasjes worden geladen met glucuronidase als model enzym en in verschillende omstandigheden opgeslagen. Na opslag worden de fysisch-chemische parameters en de activiteit van het ingekapseld enzym geëvalueerd.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn veelbelovende doelen in het huidige onderzoek, om te worden gebruikt als drugs, drug-carriers, en biomarkers. Voor hun klinische ontwikkeling, niet alleen hun farmaceutische activiteit is belangrijk, maar ook hun productie moet worden geëvalueerd. In dit verband richt het onderzoek zich op het isoleren van EVs, hun karakterisering en hun opslag. Het huidige manuscript beoogt een gemakkelijke procedure te bieden voor de beoordeling van het effect van verschillende opslagomstandigheden op EVs, zonder genetische manipulatie of specifieke functionele analyses. Dit maakt het mogelijk om snel een eerste indruk van de stabiliteit van EVs te krijgen onder een bepaalde opslag conditie, en EVs afgeleid van verschillende bronnen van de cel kan gemakkelijk worden vergeleken. De stabiliteits meting is gebaseerd op de fysisch-chemische parameters van de EVs (grootte, DEELTJESCONCENTRATIE en morfologie) en het behoud van de activiteit van hun lading. De laatste wordt beoordeeld door de saponine-gemedieerde inkapseling van het enzym Beta-glucuronidase in de EVs. Glucuronidase fungeert als een surrogaat en zorgt voor een eenvoudige kwantificering via de splitsing van een fluorescerende reporter molecuul. Het huidige protocol kan een hulpmiddel voor onderzoekers in het zoeken naar opslagomstandigheden die optimaal te behouden EV eigenschappen om EV onderzoek naar klinische toepassing vooraf.
Introduction
EVs zijn membraan gebonden nanodeeltjes geproduceerd door bijna alle soorten cellen. Voor zoogdiercellen kan EVS worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen met verschillende productie trajecten1,2. Membraan blaasjes, met een grootte variëren van ongeveer 100-1000 nm, worden geproduceerd door directe ontluikende uit het celmembraan. Exosomes, sized 30-200 nm, zijn afgeleid van multivesiculaire lichamen gevormd door innerlijke ontluiken in endosomes die vervolgens fuseren met de celmembraan om meerdere Exosomes in een keer vrij te geven. De belangrijkste functie van deze blaasjes is het vervoer van informatie tussen cellen3. Voor dit doel, worden de ladingen zoals RNA, DNA, en proteïnen actief gesorteerd in hen. EVs kan brengen een verscheidenheid van effecten op hun doelstellingen, met implicaties voor zowel gezondheid en ziekte staat. Aan de ene kant, ze bemiddelen positieve effecten, zoals weefselregeneratie, antigeen presentatie, of antibiotica-effecten, waardoor ze veelbelovende doelen voor hun ontwikkeling als therapeutische4,5. Aan de andere kant, EVs kan bevorderen tumor vascularisatie6, omstanders effecten induceren in stressreacties7, en kan een rol spelen bij auto-immuunziekten8 en inflammatoire ziekten9. Aldus, zouden zij een zeer belangrijke component aan een beter begrip van vele pathologische gevolgen kunnen zijn. Echter, de aanwezigheid van veranderde EVS in diverse ziekten, zoals kanker10,11,12 en cardiovasculaire aandoeningen13, en hun gemakkelijke bereikbaarheid in bloed en urine maakt ze ideaal Biomarkers. Ten slotte, hun goede biocompatibiliteit14 en hun inherente targeting vermogen maken EVS ook interessant voor drug delivery15. In dit manuscript beschrijven we een protocol voor de evaluatie van de opslag stabiliteit van EVs afkomstig van zoogdiercellen, een belangrijke eigenschap die nog weinig wordt onderzocht.
Voor de klinische ontwikkeling van EVs, zijn er nog vele hindernissen om16te overwinnen, met inbegrip van de evaluatie van hun therapeutische gevolgen, productie, reiniging, en opslag17. Terwijl-80 °C op grote schaal wordt gezien als de gouden standaard voor EV opslag18, de vereiste diepvriezers zijn duur, en het handhaven van de vereiste koude keten van de productie naar de patiënt kan worden uitdagend. Bovendien, sommige rapporten geven aan dat de opslag bij-80 °c nog steeds niet optimaal EVS behoudt en induceert een verlies in EV functionaliteit19,20. Andere methoden, zoals vriesdrogen21,22 of spray-droging23, zijn voorgesteld als mogelijke alternatieven voor de bevroren opslag van EVS.
De optimale manier om de opslag stabiliteit te beoordelen zou zijn om de EVs te testen in functionele assays of door de evaluatie van een specifieke marker, bijvoorbeeld, hun antibacteriële activiteit19. Dit is mogelijk wanneer het gewenste effect van de blaasjes bekend is en wanneer een afzonderlijke groep van EVs moet worden bestudeerd. Als EVs uit verschillende cel bronnen moet worden vergeleken (bijv. voor drug inkapseling) of als er geen bekende functionele uitlezing is, is het niet langer mogelijk om wijzigingen als gevolg van opslag op een directe manier te beoordelen.
Aan de andere kant, gewoon de evaluatie van veranderingen in hun fysisch-chemische parameters, zoals grootte, deeltjes herstel, en eiwitconcentratie, niet altijd voorspellen veranderingen in EV activiteit, zoals is aangetoond in een recent patent20.
Hier bieden wij een gemakkelijk toepasbare protocol voor het meten van de opslag stabiliteit van EVs door de beoordeling van hun fysisch-chemische parameters in combinatie met de activiteit van een ingekapseld Beta-glucuronidase enzym als een surrogaat voor de lading van de EVs. De lading van het enzym wordt gedaan door saponine incubatie, een milde methode die met EVS van verschillende bronnen21,24,25wordt gevestigd. Saponine vormen voorbijgaande poriën in de EV membraan, die het mogelijk maakt enzym opname in de blaasje. Als enzymen zijn geneigd om hun activiteit te verliezen als onderworpen aan ongunstige opslagomstandigheden, ze zijn een ideale surrogaat voor de evaluatie van het behoud van functionele ladingen van de EVs.
We hebben aangetoond dat de toepassing van dit protocol op EVs afgeleid van menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs), menselijke navelstreng endothelial cellen (HUVECs), en de menselijke adenocarcinoom alveolaire epitheelcellen (A549) inderdaad resulteren in grote verschillen in de stabiliteit van de opslag tussen verschillende cel lijnen, die in overweging zouden moeten worden genomen wanneer het kiezen van EV bron21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de cultuur van de cel en de productie van cel-geconditioneerd middel
- In het algemeen, cultiveren cellen onder de individuele voorwaarden die nodig zijn voor de desbetreffende cel lijn.
- Kweek de cellen voor 24-72 h in serum vrije voorwaarden of in medium met EV-verarmd foetale boviene serum (FBS).
Opmerking: als EV-uitgeput FBS wordt gebruikt, gebruik maken van een methode bewezen om efficiënt afbreken van het serum, om verontreiniging te voorkomen met runderen serum-afgeleide EVs26. - Verzamel het medium uit de kolven. Centrifugeer bij 300 x g voor 10 min om de cellen te pelleten. Verzamel zorgvuldig het cel-geconditioneerde middel (CCM), zonder de gekorrelde cellen te storen. Bij voorkeur, gebruik dan de CCM direct, of op te slaan 's nachts bij 4 ° c.
Nota: het is altijd verkieslijk om vers geproduceerde CCM te gebruiken. Indien opslag voor langere perioden niet kan worden omzeild, moeten alle relevante parameters worden geregistreerd in overeenstemming met MISEV2018 richtlijnen26, en de potentiële vooroordelen van de verkregen resultaten moeten in aanmerking worden genomen. - Voorbeeld protocol voor HUVECs
- Cultiveren HUVEC cellen voor 120 h in BAVA-2 medium met FBS en andere supplementen.
- Cultiveren HUVEC cellen voor 48 h in EBM-2 basale medium vrij van eventuele extra supplementen.
- Verzamel het medium uit de kolven en voer de Centrifugeer stap uit zoals hierboven aangegeven (stap 1,3). Gebruik meestal 100 mL medium voor één EV-isolatie.
2. Ultracentrifugation van CCM
- Onmiddellijk vóór ultracentrifugation (UC), centrifugeer CCM 15 min bij 3.000 x g en 4 °c om cel puin en grote agglomeraten te verwijderen.
- Breng de bovendrijvende voorzichtig over naar de UC-buizen. Bij gebruik van een vaste hoek rotor, Markeer de oriëntatie van de buizen in de centrifuge om het ophalen van de EV pellet te vergemakkelijken na de UC. Centrifugeer voor 2 h bij 120.000 x g, met een k-factor van 259,4.
- Na UC, voorzichtig ontdoen van de bovendrijvende met behulp van een serologische Pipet, om de verstoring van de pellets EVs te voorkomen.
Opmerking: de pellet kan onzichtbaar zijn. - Voeg 200 µ L van 0,2 µm-gefiltreerd fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de eerste buis toe en gebruik PBS en het resterende bovendrijvende om de korrel opnieuw op te schorten door op en neer te pipetteren. Breng de resulterende EV schorsing naar de volgende buis van het desbetreffende monster en gebruik het voor de hersuspensie. Ga op deze manier om alle EVs van het monster opnieuw op te schorten in een laatste volume van ongeveer 300-350 µ L.
- Na herschorsing, bevestig de aanwezigheid van deeltjes door nanodeeltjes Tracking Analysis (transatlantische). Gebruik de instellingen geoptimaliseerd voor de gegeven EV type, zoals de onderstaande instellingen (stap 2.5.1).
Opmerking: de kranten van Gardiner et al.27 en vestad et al.28 bevatten waardevolle informatie over hoe de parameters voor het meten van EVS te optimaliseren.- Om de hieronder beschreven resultaten te reproduceren, gebruik instrumenten (bijv. NanoSight LM14) uitgerust met een groene laser. Neem drie Video's van 30 s met een het scherm aanwinst van 1,0 en een camera niveau van 13 op. Voor analyse, gebruik een het scherm aanwinst van 1,0 en een opsporings drempel van 5.
- Gebruik de pellet onmiddellijk, indien mogelijk; anders, bewaar het bij 4 °C 's nachts.
3. glucuronidase inkapseling in EVs
- Aan de opnieuw gesuspendeerde pellet, voeg bèta-glucuronidase (10 mg/mL in PBS) toe aan een eindconcentratie van 1,5 mg/mL en saponine (10 mg/mL in H2O) tot een eindconcentratie van 0,1 mg/ml. Meng goed door vortexen voor 3 s.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met vermenging door zachtjes flicking de buis. Na incubatie, direct zuiveren door grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) (zie punt 5).
Opmerking: niet opnieuw bevriezen glucuronidase monsters eenmaal ontdooid, om te voorkomen dat enzym degradatie als gevolg van bevriezing.
4. liposoom productie
- Om liposomen voor te bereiden voor vergelijking met EVs, los 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-FOSFOCHOLINE (DMPC) en 1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC) op in een 2:3 maal rantsoen in chloroform tot een eindconcentratie van 5 mm. Bereid 1 mL hoeveelheid in hoge prestaties vloeibare chromatografie (HPLC) flacons en laat ze drogen 's nachts om een lipide film te vormen.
Let op: chloroform is giftig en vermoedelijk kankerverwekkende. Neem de juiste voorzorgsmaatregelen bij het hanteren. - Rehydrateer de lipide-film met 1 mL PBS met 1,5 mg/mL glucuronidase. Verhit het tot 42 ° c en Vortex voor 1 min. Verhit de extruder assemblage tot 42 ° c en extruderen de lipide suspensie 11x door middel van een 200 nm polycarbonaat membraan. Zuiver door SEC (zie hoofdstuk 5).
5. reiniging door SEC
- Bereid de SEC kolom met behulp van de volgende protocol.
- Gebruik alleen vers gezuiverd water en vers bereide buffers. Filter alle buffers door middel van een 0,2 µm membraanfilter en Degas hen om de vorming van luchtbellen in de kolom te voorkomen.
- Voor de voorbereiding van een kolom SEC, gebruik agarose gel filtratie-gebaseerde matrix (bijv., Sepharose cl-2b) of een andere SEC medium geschikt om EVs en liposomen scheiden van eiwit onzuiverheden en overtollige enzym. Eerste, verwijder de 20% EtOH oplossing het medium is opgeslagen in, om luchtbellen vorming in de kolom te voorkomen. Voor dit doel, centrifugeer de SEC medium op 3.000 x g voor 10 min, verwijder de EtOH, en vervang deze met ontgassd water.
- Vul een glazen kolom (met een inwendige diameter van 10 mm) met de SEC medium tot de 15 mL merk.
Nota: de volumes zullen voor kolommen met verschillende afmetingen verschillen. Zorg ervoor dat de gel te laten regelen volledig. - Voordat een punt wordt uitgevoerd, equilibrate de kolom met ten minste twee kolom volumes van PBS. Voor het opslaan van de kolom, eerst wassen met een kolom volume van het water, gevolgd door ten minste twee kolom volumes van 20% EtOH. Na opslag, was eerst de kolom met één kolom volume van water vóór equilibrating met PBS.
- Gebruik tot 400 µ L van EV of liposoom suspensie in een scheiding. Verzamel fracties van 1 mL. Na SEC slaat u de gezuiverde EVs op (zie sectie 7) of onderwerpt u deze aan een glucuronidase assay (zie punt 6).
- Bevestig de scheiding van EVs en liposomen van besmet proteïnen en vrije glucuronidase. Te dit doel, correleren de deeltjes concentraties van de verzamelde fracties met de eiwitconcentratie en de glucuronidase activiteit.
- Evalueer de deeltjesconcentratie door de transatlantische (zie 2,5)
- Evalueer het eiwitgehalte door bicinchoninic acid (de) assay of een andere geschikte eiwit kwantificatie assay. Voer de test uit volgens het Protocol van de fabrikant.
- Evalueer de glucuronidase activiteit door glucuronidase assay (zie hoofdstuk 6).
- Optioneel, beoordelen van de EV morfologie door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en scanning elektronenmicroscopie (SEM).
- Voor de bereiding van TEM monsters, voeg 10 µ L van EV schorsing aan een TEM grid, incubeer voor 10 min, en dan Blot weg overtollige vloeistof met behulp van een filtreerpapier. Voer de fixatie voor 10 min met 10 µ L van 4% Paraformaldehyde en Blot weg een overmaat. Was 3x met water. Vlek de blaasjes door 20 s incubatie met 30 µ L van 1% fosfor-tungstic zuur hydraat. Na het wegvloeien van het overtollige, droog de blaasjes 's nachts. Visualiseer door TEM.
Let op: Phospho-tungstic zuur is zeer bijtend; Bescherm dus de huid en de ogen. - Voor SEM, bevestig de eerder geprepareerde TEM monsters op Carbon schijven en sputter ze met een 50 nm dikke gouden laag. Visualiseer door SEM.
- Voor de bereiding van TEM monsters, voeg 10 µ L van EV schorsing aan een TEM grid, incubeer voor 10 min, en dan Blot weg overtollige vloeistof met behulp van een filtreerpapier. Voer de fixatie voor 10 min met 10 µ L van 4% Paraformaldehyde en Blot weg een overmaat. Was 3x met water. Vlek de blaasjes door 20 s incubatie met 30 µ L van 1% fosfor-tungstic zuur hydraat. Na het wegvloeien van het overtollige, droog de blaasjes 's nachts. Visualiseer door TEM.
6. glucuronidase assay
- Om een vergelijking tussen verschillende monsters en opslagomstandigheden mogelijk te maken door het aantal deeltjes en de enzymactiviteit te correleren, meet eerst de deeltjesconcentratie van het monster door de transatlantische (zie stap 2,5).
- Bereid een werkende oplossing van fluoresceïne di-β-D-glucuronide door 1 µ L van de verbinding (10 mg/mL in H2O) aan 199 µ l van PBS toe te voegen. Voeg 25 µ L van deze oplossing aan 125 µ L van gezuiverd EVs toe om een definitieve concentratie van 8,3 µ g/mL te krijgen. Pipet het monster in een zwarte 96-well plaat. Meettijd punt 0 h met een plaat lezer, gebruikend 480 nm als opwinding en 516 nm als emissie golflengte.
- Bedek de plaat stevig (bijv., met transparante plastic folie gebruikt voor PCR-platen) om de verdamping te minimaliseren en incubeer in het donker voor 18 uur bij 37 ° c. Meet de fluoresceïne productie met behulp van de plaat lezer parameters vermeld in stap 6,2.
7. opslag van EVs en liposomen
Opmerking: voor alle opslag doeleinden, is het raadzaam om lage-bindende buizen te gebruiken om EV verlies als gevolg van adsorptie te verminderen.
- Volg de parameters in dit gedeelte om de representatieve resultaten hieronder weer te geven. Gebruik monsters bestaande uit 400 µ L van EV schorsing.
- Store bij 4 °C of-80 °C of ga verder met onderstaande stappen.
- Lyophilize de EVs.
- Voeg trehalose (40 mg/mL in H2O) toe tot een eindconcentratie van 4 mg/ml op het gezuiverde EVS. Bevriezen van de monsters bij-80 °C voor ten minste 1 uur.
- Lyophilize de monsters met behulp van de volgende parameters. Voor het hoofd drogen, stel de plank temperatuur tot 15 ° c en de druk tot 0,180 mbar en laat de monsters te drogen voor 46 h. Voor de laatste droging, zet de plank temperatuur tot 25 ° c en de druk tot 0,0035 mbar en laat de monsters te drogen voor 2 h. Bewaar de gelyofiliseerde monsters bij 4 °C.
- Om de monsters te hydrateren, voeg H2O, gelijk aan het bedrag van EV schorsing aanwezig in het begin (typisch, 400 µ l). Gebruik geen buffer voor rehydratie.
8. analyse na opslag
- Om de enzymactiviteit te beoordelen, Verwijder eerst de vrije glucuronidase, die uit het EVs tijdens opslag kunnen gelekt hebben. Dit te bereiken door een extra stap van zuivering die wordt uitgevoerd, hetzij door SEC (zie stap 5) of asymmetrische flow veld-flow fractionering (AF4) (zie stap 8.1.2).
Opmerking: Houd er rekening mee dat beide methoden leiden tot een verdunning van het EV-monster; Dus, gebruik voldoende EV concentraties voor opslag om te voorkomen dat zich onder de transatlantische kwantificering te beperken. Verwacht een 1:10 verdunning van de deeltjes als gevolg van SEC of AF4.- Voor SEC-zuivering volgt u het hierboven beschreven Protocol (zie paragraaf 5).
- Voer AF4 zuivering uit.
- Stel het instrument in met behulp van een klein kanaal met een 350 µm spacer en een 30 kD molecuulgewicht cut-off cellulose membraan. Plaats een 0,1 µm poriegrootte filter tussen de HPLC pomp en het AF4 kanaal. Gebruik vers bereide 0,1 µm-gefiltreerde PBS als mobiele fase om de deeltjes lading en het lawaai in de licht-verstrooiende detectors te verminderen.
- Detecteren eiwitten met behulp van een UV-detector ingesteld op 280 nm. Voor het detecteren van deeltjes, het gebruik Multiangle lichtverstrooiing met de laser ingesteld op 658 nm.
- Gebruik de volgende methode van de looppas. Pre-focus voor 1 min met een focus stroom van 1 mL/min; dan, injecteren 300 µ L van het monster met een snelheid van 0,2 mL/min en houden de focus stroom voor 10 min. Na de injectie, elueer de steekproef bij 1 mL/min terwijl het toepassen van een dwarsstroom die van 2 mL/min tot 0,1 mL/min in de loop van 8 min. Elueer voor nog eens 10 min zonder dwarsstroom vermindert. Verzamel fracties van 1 mL, beginnend na 12,5 min en verder tot 27 min.
- Voer de glucuronidase assay uit zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 6).
- Om de grootte en concentratie te beoordelen, gebruik de hierboven beschreven transatlantische (zie stap 2,5).
- Optioneel, uitvoeren TEM en SEM om de morfologie van de EVs na opslag te beoordelen (zie 5,3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de opslag karakteristieken van EVS geïsoleerd van HUVECs. EVs werden geïsoleerd door UC, glucuronidase werd ingekapseld, en na SEC, de gezuiverde EVs werden geëvalueerd voor hun fysisch-chemische eigenschappen door de transatlantische. Een steekproef van de blaasjes werd later onderworpen aan AF4 reiniging en de glucuronidase activiteit werd gemeten.
De blaasjes werden dan opgeslagen voor 7 d bij 4 °C of-80 °C en bij 4 °C in gelyofiliseerde vorm, in het laatstgenoemde geval met de toevoeging van 4% trehalose. Na opslag, werden de blaasjes opnieuw gemeten door de transatlantische, en na AF4, de resterende glucuronidase activiteit per deeltje werd beoordeeld.
Het werkingsprincipe van AF4 is gebaseerd op de combinatie van laminaire stroming en een orthogonale Cross Flow door het poreuze membraan aan de onderzijde van het AF4 kanaal, dat deeltjes differentieert naargelang hun grootte (Figuur 2). De grotere deeltjes neigen dichter aan het membraan worden gevestigd terwijl de kleinere deeltjes verder omhoog in het kanaal worden gevestigd. Wegens het parabolische stroom Profiel van de laminaire stroom, deeltjes verder vanaf de membraan reis sneller naar de detector, die tot een deeltjes-scheiding door grootte leidt. In een typisch AF4 experiment, worden de ingespoten deeltjes eerst geconcentreerd op het membraan, door een dwarsstroom zonder een longitudinale stroom door het kanaal toe te passen (Figuur 2a). Na injectie en focus, de elutie begint door gelijktijdig toepassen van een cross flow en een longitudinale stroom naar fractionate en elueer de verschillende deelverzamelingen van deeltjes (Figuur 2B), die in ons geval, waren EVS en vrije glucuronidase.
Figuur 3 illustreert de scheiding van nanodeeltjes (EVS of liposomen) van besmette eiwitten en niet-ingekapseld glucuronidase. De SEC elutie Profiel van liposomen (Figuur 3a) gezuiverd na hun voorbereiding (zie paragraaf 4 van het Protocol) toonde de scheiding van de deeltjes met ingekapseld glucuronidase van het vrije enzym, gedetecteerd zowel door middel van de test en enzymactiviteit. In het huidige voorbeeld zouden de fracties 6 en 7 worden gekozen voor verdere experimenten, aangezien zij de hoogste concentraties van deeltjes bevatten en mogelijke verontreinigingen met vrije glucuronidase te voorkomen. AF4 was ook succesvol in het scheiden van EVs van vrije glucuronidase zoals aangetoond in Figuur 3B, met een hogere graad van scheiding dan sec, makend verontreiniging van de fracties die blaasjes bevatten minder waarschijnlijk.
In Figuur 4, werd een controle-experiment uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de enzymactiviteit gemeten voor de blaasjes was inderdaad gekoppeld aan de inkapseling van glucuronidase in EVS en niet veroorzaakt door enzym aggregaten. Deze aggregaten zouden kunnen zijn gevormd als gevolg van de incubatie van glucuronidase met saponine en leiden tot valse positieve resultaten. Om te verifiëren van de fracties waar blaasjes zou Elueer, gezuiverd EVs zonder ingekapseld glucuronidase werden onderworpen aan SEC op dezelfde kolom als het monster alleen met saponine en het enzym.
Toen glucuronidase werd uitgebroed met saponine en vervolgens gezuiverd door SEC, geen enzymactiviteit werd gevonden in de fracties meestal met EVs. Terwijl kleine hoeveelheden deeltjes bleken te Elueer op hetzelfde moment als EVs (het maken van < 0,1% van de deeltjes hersteld van een typische EV pellet), was er geen correleren enzymactiviteit. Deze resultaten wijzen erop dat het actieve enzym dat in de fracties wordt teruggekregen die blaasjes bevatten in hen werd ingekapseld.
Figuur 5 vergelijkt het herstel van het actieve enzym na opslag met of zonder extra AF4 zuivering om niet-ingekapseld kleurstof te verwijderen. Met AF4 zuivering, is er over het algemeen een lager herstel van enzym per deeltje, met het hoogste effect voor opslag bij 4 °C, waar terugwinnings dalingen door tweederde. Aldus, kan het weglaten van deze extra reinigingsstap tot verkeerde veronderstellingen over de enzym stabiliteit leiden.
Figuur 6 toont het effect van lyofilisatie zonder cryoprotectant op blaasjes afgeleid van MSCs, A549 cellen en liposomen, vergeleken met bevriezing bij-80 °c. De deeltjes werden afgebeeld door TEM en SEM zoals hierboven beschreven (zie stap 5,3 van het Protocol). De MSCs en A549 EVs vertoonden geen grote verschillen in vorm in TEM beelden, waarbij de twee opslagcondities werden vergeleken. In de SEM Foto's, echter, de gelyofiliseerde monsters weergegeven aggregaten niet gevonden in de-80 °C monsters. Liposomen ook weergegeven aggregaten in de SEM beeld, terwijl in TEM, lyofilisatie leek te induceren een grootte stijging van liposomen. Lyofilisatie zonder cryoprotectants verminderde ook het herstel van intacte glucuronidase na opslag (Figuur 7). De toevoeging van trehalose als cryoprotectant verhoogde de terugwinning van het actieve enzym op een dosis-afhankelijke manier.
Figuur 8 toont de omzetting van fluoresceïne di-β-D-glucuronide aan vrije fluoresceïne, die in de glucuronidase assay plaatsvindt. Terwijl de educt was niet-fluorescerende op 516 nm, fluoresceïne is zeer fluorescerende op deze golflengte. Dit toegestaan voor een eenvoudige enzymactiviteit assay met een hoge gevoeligheid.
Figuur 1 : Opslag stabiliteit van HUVEC EVS. (A) deeltjes herstel ten opzichte van voor opslag, (B) gemiddelde grootte, en (C) de genormaliseerde glucuronidase activiteit per deeltje van EVS geïsoleerd van HUVECs. De blaasjes werden opgeslagen voor 7 d bij 4 °C en-80 °C en bij 4 °C na lyofilisatie met 4% trehalose. De gemiddelde grootte en de deeltjes terugwinning werden gemeten door de transatlantische; de glucuronidase activiteit per deeltje werd berekend met de combinatie van de transatlantische gegevens en de resultaten van de glucuronidase assay en genormaliseerd vóór opslag. Gemiddelde ± SD, n = 3, *p < 0,05 (one-way ANOVA gevolgd door Tukey post hoc test). Gewijzigd van Frank et al.21. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Werkingsprincipe van de AF4. (A) EVS en vrije glucuronidase worden geconcentreerd na injectie door een dwarsstroom toe te passen. (B) daarna, EVS en vrij enzym worden geëlueerd afzonderlijk door het combineren van de stroom door het kanaal met een cross flow. Gewijzigd van Frank et al.21. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Scheiding van EVS en liposomen van vrije glucuronidase. (A) representatieve SEC scheiding van glucuronidase-loaded liposomen, vrije glucuronidase, en eiwit contaminanten. De grafiek toont de deeltjesconcentratie (rood), eiwitconcentratie (blauw), en glucuronidase activiteit (groen). (B) demonstratie van de scheiding van EVS van vrije glucuronidase. Onbehandeld EVs, EVs spiked met 0,05 mg/mL glucuronidase, gratis glucuronidase (0,5 mg/mL), en EVs geladen met glucuronidase en gezuiverd door SEC (EV glucuronidase) werden geïnjecteerd en geanalyseerd door UV op 280 nm en 90 ° lichtverstrooiing. Gratis enzym geëlueerd gescheiden van EVs. Gewijzigd van Frank et al.21. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Controle experimenten voor de zuivering van EVS van vrije glucuronidase. 400 µ L van native EVs of 400 µ L van 1,5 mg/mL glucuronidase in PBS uitgebroed gedurende 10 min met 0,1 mg/mL saponine werden gezuiverd door SEC.adeeltjes concentraties van de verzamelde fracties van blaasjes en glucuronidase, respectievelijk, en de enzymactiviteit van de gezuiverde glucuronidase. (B) UV-absorptie bij 280 nm gemeten in hetzelfde experiment. De eerste kleine piek voor glucuronidase correspondeert met de grijze lijn in paneel A. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Het effect van extra zuiveringsstappen na EV-opslag. Resterende glucuronidase activiteit per deeltje in vergelijking met D0 met of zonder een extra AF4 zuivering stap na opslag. HUVEC EVs werden opgeslagen voor 7 d bij 4 °C of-80 °C en gelyofiliseerde met 4% trehalose. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : TEM en SEM foto's van EVS. TEM en SEM foto's van EVs uit (a) MSCs en (B) A549 cellen en (C) liposomen. De steekproeven werden opgeslagen voor 14 d bij-80 °C of gelyofiliseerde zonder de toevoeging van trehalose. Pijlen geven de aanwezigheid van morfologisch veranderde deeltjes in de TEM Foto's en aggregaten in de SEM foto's. Gewijzigd van Frank et al.21. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7 : Het effect van trehalose op enzym herstel na lyofilisatie. Vergelijking van de enzymactiviteit na lyofilisatie voor 14 dagen, met 0%, 1%, en 4% trehalose met de steekproef vóór opslag (0 dagen). Gewijzigd van Frank et al.21. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8 : De enzymatische splitsing van fluoresceïne di-β-D-glucuronide door glucuronidase. In de regeling, de reactie ten grondslag liggen aan de opsporing van glucuronidase wordt toegelicht. Niet-fluorescente fluoresceïne di-β-D-glucuronide wordt gekloofd door glucuronidase. Door de verwijdering van de suiker residuen, fluoresceïne herwint zijn fluorescerende eigenschappen. De fluorescentie gemeten na de incubatietijd correleert met de hoeveelheid actief enzym aanwezig en is de uitlezing van de glucuronidase assay. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript presenteren we een uitgebreid protocol om de stabiliteit van EVs onder verschillende opslagomstandigheden te bestuderen. Met de combinatie van ingekapseld glucuronidase als een functionele uitlezing en de evaluatie van de fysisch-chemische parameters van het EVs, het protocol zorgt voor een eenvoudige opslag stabiliteit evaluatie van EVs en de vergelijking van EVs uit verschillende cel Lijnen. SEM en TEM als complementaire methoden maken een inzicht in de veranderingen van de EVs op de single-particle niveau. De hier gepresenteerde resultaten toonden een tendens van de EVs en liposomen tot aggregaat als gevolg van lyofilisatie zonder een cryoprotectant (Figuur 6). Dit werd echter alleen waargenomen in de SEM experimenten. Terwijl EM Imaging niet werd uitgevoerd met monsters die werden bewaard met trehalose, de literatuur suggereert dat dit cryoprotectant inderdaad zou de aggregatie van EVs29te verminderen. Het is ook mogelijk om te beoordelen, als een bepaalde opslag voorwaarde verschilt EV grootte, de Recovery rate en ingekapseld moleculen. Een dergelijk effect wordt geïllustreerd door de resultaten behaald voor HUVEC EVs (Figuur 1). Terwijl de deeltjes terugwinning voor 4 °C en-80 °C beter was dan voor de gelyofiliseerde steekproeven, was de terugwinning van actieve ingekapseld glucuronidase het best voor de gelyofiliseerde steekproeven. Lyofilisatie van EVs kan de meer gunstige opslag voorwaarde, bijvoorbeeld bij het analyseren van EV biomarkers, waar de focus is meer op het verkrijgen en het behoud van intacte lading in plaats van op intact blaasjes.
In hun recente paper over de lyofilisatie van EVs22, Charoenviriyakul et al. volgde een vergelijkbare aanpak. Betreffende de fysisch-chemische parameters, concentreerden zij zich op de polydispersie index (PDI) en het Zeta potentieel, aangezien de veranderingen in Zeta potentieel met verminderde colloïdale stabiliteit kunnen correleren. Nochtans, kan het Zeta potentieel niet alleen verklaren waargenomen veranderingen in stabiliteit30, die ook in hun resultaten werd weerspiegeld. Zij vergeleek ook de proteïne en de inhoud van RNA van opgeslagen EVs door Polyacrylamide de Elektroforese van het gel. Deze techniek kan zeer goed wijzen op wezenlijke veranderingen in de proteïne of de inhoud van RNA van de blaasjes. Het vergt echter veel grotere hoeveelheden materiaal dan de hier gepresenteerde methode. Ter beoordeling van het effect van de opslag op de EV lading, Charoenviriyakul et al. heterologously uitgedrukt een enzym en DNA-soorten elk in hun EV producent cel lijn en bewaakt hun activiteit en integriteit in het EVs. Nochtans, is dergelijke heterologe uitdrukking niet geschikt als EVs van verschillende bronnen moet worden vergeleken, aangezien het een aanzienlijke hoeveelheid tijd voor elke nieuwe cel lijn vereist, terwijl de eenvoudige saponine-gemedieerde inkapseling gemakkelijk kan worden toegepast.
Het is van cruciaal belang om een niet-ingekapseld enzym te verwijderen, zoals weergegeven in Figuur 3. EV-ingekapseld glucuronidase reageert veel langzamer met zijn substraat dan gratis enzym in oplossing, wat leidt tot een overschatting van de inkapseling efficiëntie. Schone scheiding is vooral belangrijk voor de analyse na opslag, omdat de opslagomstandigheden van invloed kunnen zijn op de activiteit van vrije glucuronidase in het monster anders en kan leiden tot lekkage van beschadigde EVs. Dit was duidelijk in onze experimenten (Figuur 5), als de toepassing van AF4 voordat de glucuronidase assay in geslaagd om kleurstof niet ingekapseld in de blaasjes te verwijderen. Zo maakte het het mogelijk om duidelijke resultaten te krijgen over het effect van de hier besproken opslagmethoden, terwijl zonder AF4, de activiteit verlies als gevolg van opslag zou zijn onderschat.
Een andere belangrijke overweging is de isolatie en karakterisering van de EVs te worden getest op hun stabiliteit. Hoewel de beschreven techniek kan de vergelijking van EVS uit verschillende bronnen, dit is alleen mogelijk als ze allemaal worden bereid door dezelfde isolatie methode, zodat de resultaten niet worden vervalst18,31,32. In dit verband moeten de voorwaarden van de cel cultuur ook in aanmerking worden genomen, omdat zij de hoeveelheid en de bioactiviteit van de geïsoleerde EVs33kunnen beïnvloeden. Voor het verkrijgen van resultaten die kunnen worden vergeleken met andere gepubliceerde resultaten, is het raadzaam om de onlangs geactualiseerde "minimale informatie voor studies van extracellulaire blaasjes", dat richtlijnen bevat voor de harmonisatie van EV onderzoek26te raadplegen.
In het protocol hier gepresenteerd, gebruikten we SEC of AF4 voor het verwijderen van het vrije enzym na opslag. Andere methoden kunnen worden toegepast, zoals Gradient ultracentrifugation, UC of filtratie34. In vergelijking met centrifugale methoden, SEC en AF4 zijn minder tijdrovend (bijvoorbeeld, ongeveer 1,5 h voor SEC met inbegrip van kolom evenwicht versus tot 16 h of meer voor gradiënt UC) en ze kunnen volledig gescheiden vrije eiwitten uit de EVs in vergelijking met de normale UC, waar Er blijft altijd rest bovendrijvende met de pellet. Bovendien, SEC15 en AF435 zijn milde methoden, die veroorzaken minder shear stress op de EVS. In vergelijking, zouden de krachten die op EVS tijdens UC worden opgelegd tot veranderingen van de deeltjes, zoals samenvoeging en veranderingen in grootte34,36kunnen leiden.
Een nadeel van SEC en AF4 is de verdunning van de monsters. Zo is het nodig om voldoende hoeveelheden EVs te isoleren om de concentraties die nodig zijn voor de metingen na meerdere zuiveringsstappen te handhaven. EV fracties kunnen worden geconcentreerd met behulp van centrifugale filters, maar afhankelijk van het filtermateriaal en het Protocol, kan er een verlies van blaasjes37.
De beperking van het protocol hier besproken is dat het alleen de enzymactiviteit van exogeen ingekapseld glucuronidase monitoren, noch rekening houdend met Encapsulated RNA en DNA, noch de EV oppervlak eiwitten die belangrijk kunnen zijn voor de functionaliteit18 . Voor het onderzoek van nieuwe EV therapeuten, deze techniek niet kan vervangen assays op functionaliteit, maar complimenteren en geven een indicatie over blaasje stabiliteit. Het kan van groot nut zijn als bijvoorbeeld EVs afkomstig van biovloeistoffen worden opgeslagen voor latere analyse van hun blaasje inhoud.
In de toekomst kan de reikwijdte van dit protocol worden uitgebreid tot ook EVs afkomstig van andere organismen, bijvoorbeeld, bacteriële buitenste membraan blaasjes. Een andere interessante volgende stap zou zijn de inkapseling van Nucleic zuren door saponine incubatie te testen en ook de stabiliteit van de ladingen van DNA of van RNA te onderzoeken.
Tot slot, deze procedure biedt een eenvoudige methode voor de beoordeling van de opslag stabiliteit van EVs uit verschillende zoogdiercellen bronnen door de integratie van zowel een fysisch-chemische en een functionele uitlezing. Dit gedetailleerde protocol zal EV onderzoekers een eenvoudige bepaling van geschikte opslagomstandigheden voor hun blaasjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het NanoMatFutur Junior research programma van het Federaal Ministerie van onderwijs en onderzoek, Duitsland (Grant Number 13XP5029A) steunde dit werk. Maximilian Richter werd gesteund door Studienstiftung des deutschen Volkes (Duitse academische beurs Stichting) door middel van een Ph.D. Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Processes for producing stable exosome formulations. US patent. Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
