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Bioengineering

Évaluation de la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires

Published: May 22, 2019 doi: 10.3791/59584
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Biogenic Nanotherapeutics group (BION), 2Department of Pharmacy, Saarland University

Summary

Nous présentons ici un protocole facilement applicable pour évaluer la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires, un groupe de nanoparticules naturelles produites par les cellules. Les vésicules sont chargées de glucuronidase en tant qu’enzyme modèle et stockées dans des conditions différentes. Après le stockage, leurs paramètres physicochimiques et l’activité de l’enzyme encapsulée sont évalués.

Abstract

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des cibles prometteuses dans la recherche actuelle, à utiliser comme médicaments, porteurs de médicaments et biomarqueurs. Pour leur développement clinique, non seulement leur activité pharmaceutique est importante, mais aussi leur production doit être évaluée. Dans ce contexte, la recherche se concentre sur l’isolement des véhicules électriques, leur caractérisation et leur stockage. Le présent manuscrit vise à fournir une procédure facile pour l’évaluation de l’effet des différentes conditions de stockage sur les véhicules électriques, sans manipulation génétique ou essais fonctionnels spécifiques. Cela permet d’obtenir rapidement une première impression de la stabilité des véhicules électriques sous une condition de stockage donnée, et les EVs dérivées de différentes sources de cellules peuvent être comparées facilement. La mesure de stabilité est basée sur les paramètres physicochimiques des EVs (taille, concentration des particules et morphologie) et la préservation de l’activité de leur cargaison. Ce dernier est évalué par l’encapsulation médiée par la saponine de l’enzyme bêta-glucuronidase dans les EVs. La glucuronidase agit comme un substitut et permet une quantification facile par le clivage d’une molécule de reporter fluorescente. Le présent protocole pourrait être un outil pour les chercheurs dans la recherche de conditions de stockage qui conservent de manière optimale les propriétés EV pour faire progresser la recherche EV vers l’application clinique.

Introduction

Les EVs sont des nanoparticules liées à la membrane produites par presque tous les types de cellules. Pour les cellules de mammifères, EVS peut être subdivisé en deux groupes principaux avec des voies de production distinctes1,2. Les vésicules membranaires, d’une taille allant d’environ 100 à 1000 nm, sont produites par le bourgeonnement direct de la membrane cellulaire. Les exosomes, de taille 30-200 nm, sont dérivés de corps multivésiculaires formés par le bourgeonnement vers l’intérieur en endosomes qui fusionnent ensuite avec la membrane cellulaire pour libérer plusieurs exosomes à la fois. La fonction principale de ces vésicules est le transport de l’information entre les cellules3. À cette fin, les cargaisons tels que l’ARN, l’ADN et les protéines sont activement triés en eux. EVs peut transmettre une variété d’effets sur leurs cibles, avec des implications pour la santé et l’état de la maladie. D’un côté, ils médient des effets positifs tels que la régénération tissulaire, la présentation de l’antigène ou les effets antibiotiques, ce qui en fait des cibles propices à leur développement en tant que thérapeutique4,5. De l’autre côté, EVs peut favoriser la vascularisation tumorale6, induire des effets de spectateur dans les réponses de stress7, et pourrait jouer un rôle dans les maladies auto-immunes8 et les maladies inflammatoires9. Ainsi, ils pourraient être un élément clé pour une meilleure compréhension de nombreux effets pathologiques. Cependant, la présence de EVS altérés dans les maladies multiples, comme le cancer10,11,12 et les troubles cardiovasculaires13, et leur accessibilité facile dans le sang et l’urine les rend idéales Biomarqueurs. Enfin, leur bonne biocompatibilité14 et leur capacité de ciblage intrinsèque rendent les EVS aussi intéressants pour la livraison de médicaments15. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole pour l’évaluation de la stabilité de stockage des EVs dérivées de cellules de mammifères, une propriété importante qui est encore peu étudiée.

Pour le développement clinique des EVs, il y a encore beaucoup d’obstacles à surmonter16, y compris l’évaluation de leurs effets thérapeutiques, la production, la purification, et le stockage17. Alors que-80 ° c est largement considéré comme la norme d’or pour le stockage EV18, les congélateurs requis sont coûteux, et le maintien de la chaîne de froid requis de la production au patient peut être difficile. De plus, certains rapports indiquent que le stockage à-80 ° c ne préserve pas encore de manière optimale EVS et induit une perte dans la fonctionnalité ev19,20. D’autres méthodes, comme le lyophilisation21,22 ou le séchage par pulvérisation23, ont été proposées comme alternatives potentielles au stockage congelé des véhicules électriques.

La meilleure façon d’évaluer la stabilité du stockage serait de tester les EVs dans les essais fonctionnels ou par l’évaluation d’un marqueur spécifique, par exemple, leur activité antibactérienne19. Ceci est possible lorsque l’effet désiré des vésicules est connu et quand un groupe distinct d’EVs doit être étudié. Si des EVs provenant de différentes sources cellulaires doivent être comparées (p. ex. pour l’encapsulation de médicaments) ou s’il n’y a pas de lecture fonctionnelle connue, il n’est plus possible d’évaluer les changements dus au stockage de manière directe.

D’autre part, l’évaluation simple des changements dans leurs paramètres physicochimiques, tels que la taille, la récupération des particules et la concentration des protéines, ne prédit pas toujours les changements dans l’activité EV, comme cela a été démontré dans un brevet récent20.

Ici, nous fournissons un protocole facilement applicable pour mesurer la stabilité de stockage des EVs en évaluant leurs paramètres physicochimiques combinés avec l’activité d’une enzyme bêta-glucuronidase encapsulée comme substitut pour la cargaison du EVs. Le chargement de l’enzyme se fait par incubation de saponine, une méthode légère établie avec des EVS provenant de différentes sources21,24,25. La saponine forme des pores transitoires dans la membrane EV, ce qui permet l’absorption enzymatique dans la vésicule. Comme les enzymes sont sujettes à perdre leur activité si elles sont soumises à des conditions de stockage défavorables, elles constituent un substitut idéal pour l’évaluation de la préservation des cargaisons fonctionnelles des véhicules électriques.

Nous avons démontré que l’application de ce protocole à des EVs dérivées de cellules souches métréchymateuses humaines (MSCs), de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et d’adénocarcinome des cellules épithéliales alvéolaires (A549), en effet, entraîne de grandes différences dans stabilité de stockage entre les différentes lignées cellulaires, qui doivent être prises en considération lors du choix de la source EV21.

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Protocol

1. culture cellulaire et production de milieu cellulaire

  1. En général, cultiver des cellules dans les conditions individuelles requises pour la lignée cellulaire respective.
  2. Cultiver les cellules pendant 24-72 h dans des conditions exemptes de sérum ou dans un milieu contenant du sérum bovin foetal (FBS) appauvri en EV.
    Remarque: si le FBS appauvri en EV est utilisé, utiliser une méthode éprouvée pour épuiser efficacement le sérum, afin de prévenir la contamination par des EVs de bovins dérivés du sérum26.
  3. Recueillir le support des flacons. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min pour pellets les cellules. Recueillir soigneusement le milieu cellulaire (CCM), sans déranger les cellules granulées. De préférence, utilisez le CCM directement ou rangez-le une nuit à 4 ° c.
    Remarque: il est toujours préférable d’utiliser des CCM fraîchement produites. Si le stockage pour des périodes plus longues ne peut pas être contourné, tous les paramètres pertinents doivent être consignés conformément aux directives MISEV201826, et les biais potentiels des résultats obtenus doivent être pris en considération.
  4. Exemple de protocole pour HUVECs
    1. Cultiver des cellules HUVEC pour 120 h dans le milieu EGM-2 contenant FBS et d’autres suppléments.
    2. Cultiver les cellules HUVEC pour 48 h dans le milieu de base EBM-2 exempt de suppléments supplémentaires.
    3. Prélever le support des flacons et effectuer l’étape de centrifugation comme indiqué ci-dessus (étape 1,3). En général, utilisez 100 mL de milieu pour une isolation EV.

2. ultracentrifugation de CCM

  1. Immédiatement avant l’ultracentrifugation (UC), Centrifugez le CCM pendant 15 min à 3 000 x g et 4 ° c pour éliminer les débris cellulaires et les grands agglomérats.
  2. Transférez délicatement le surnageant aux tubes UC. Si vous utilisez un rotor à angle fixe, marquez l’orientation des tubes dans la centrifugeuse pour faciliter la récupération du pellet EV après l’UC. Centrifuger pendant 2 h à 120 000 x g, avec un facteur k de 259,4.
  3. Après UC, jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’un pipetage sérologique, pour éviter la perturbation des EVs pelletés.
    Remarque: le culot peut être invisible.
  4. Ajouter 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) filtrée à 0,2 μm dans le premier tube et utiliser le PBS et le surnageant résiduel pour Resuspendre le culot en pipetant de haut en bas. Transférer la suspension EV résultante au tube suivant de l’échantillon respectif et l’utiliser pour la remise en suspension. Procédez de cette façon pour resuspendre tous les véhicules électriques de l’échantillon dans un volume final d’environ 300-350 μL.
  5. Après la remise en suspension, confirmer la présence de particules par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Utilisez les paramètres optimisés pour le type EV donné, tels que les paramètres ci-dessous (étape 2.5.1).
    NOTE: les documents de Gardiner et coll.27 et vestad et al.28 contiennent des informations précieuses sur la façon d’optimiser les paramètres de mesure des véhicules électriques.
    1. Pour reproduire les résultats décrits ci-dessous, utilisez des instruments (par exemple, NanoSight LM14) équipés d’un laser vert. Enregistrez trois vidéos de 30 s avec un gain d’écran de 1,0 et un niveau de caméra de 13. Pour l’analyse, utilisez un gain d’écran de 1,0 et un seuil de détection de 5.
  6. Utilisez le pellet immédiatement, si possible; Sinon, rangez-le à 4 ° c pendant la nuit.

3. encapsulation de glucuronidase en EVs

  1. À la granule resuspendue, ajouter la bêta-glucuronidase (10 mg/mL dans le PBS) à une concentration finale de 1,5 mg/mL et de saponine (10 mg/mL en H2O) à une concentration finale de 0,1 mg/ml. Mélangez bien par vortex pour 3 s.
  2. Incuber pendant 10 min à température ambiante avec un mélange interadmis en faisant doucement clignoter le tube. Après incubation, purifier directement par chromatographie d’exclusion de la taille (SEC) (voir rubrique 5).
    Remarque: ne pas recongeler les échantillons de glucuronidase une fois décongelés, afin de prévenir la dégradation des enzymes due au gel.

4. production de liposomes

  1. Pour préparer des liposomes pour comparaison avec EVs, dissoudre la 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) et la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC) dans une ration molaire 2:3 dans le chloroforme jusqu’à une concentration finale de 5 mm. Préparer des aliquotes de 1 mL dans des flacons de chromatographie liquide haute performance (HPLC) et les laisser sécher pendant la nuit pour former un film lipidique.
    ATTENTION: le chloroforme est toxique et soupçonné d’être cancéreux. Prenez les précautions appropriées lors de la manipulation.
  2. Réhydrater le film lipidique avec 1 mL de PBS contenant 1,5 mg/mL de glucuronidase. Chauffer à 42 ° c et faire tourbillonner pendant 1 min. chauffer l’ensemble de l’extrudeuse à 42 ° c et extrudeuse la suspension lipidique 11x à travers une membrane en polycarbonate de 200 nm. Purifier directement par SEC (voir rubrique 5).

5. purification par SEC

  1. Préparez la colonne SEC à l’aide du protocole suivant.
    1. N’utilisez que de l’eau fraîche purifiée et des tampons fraîchement préparés. Filtrer tous les tampons à travers un filtre à membrane de 0,2 μm et les dégazer pour empêcher la formation de bulles d’air dans la colonne.
    2. Pour la préparation d’une colonne SEC, utiliser la matrice de filtration à base de gel d’d’agarose (par exemple, Sepharose CL-2b) ou un autre milieu SEC approprié pour séparer les EVs et les liposomes des impuretés protéiques et de l’excès d’enzyme. Tout d’abord, retirez la solution de 20% EtOH le milieu est stocké dans, pour empêcher la formation de bulles d’air dans la colonne. À cette fin, Centrifugez le milieu SEC à 3 000 x g pendant 10 min, enlevez l’EtOH et remplacez-le par de l’eau dégazée.
    3. Remplissez une colonne de verre (avec un diamètre intérieur de 10 mm) avec le milieu SEC à la marque de 15 mL.
      Remarque: les volumes diffèrent pour les colonnes de dimensions différentes. Assurez-vous de laisser le gel s’arranger complètement.
    4. Avant une course, Equilibrer la colonne avec au moins deux volumes de colonne de PBS. Pour stocker la colonne, lavez-la d’abord avec une colonne de volume d’eau, suivie d’au moins deux volumes de colonne de 20% EtOH. Après le stockage, laver la colonne d’abord avec un volume d’eau de colonne avant d’équilibrer avec PBS.
    5. Utiliser jusqu’à 400 μL de suspension EV ou Liposome en une seule séparation. Prélever des fractions de 1 mL. Après la SEC, stockez les EVs purifiés (voir rubrique 7) ou les soumettre à un dosage de glucuronidase (voir rubrique 6).
  2. Confirmer la séparation des EVs et des liposomes des protéines contaminantes et de la glucuronidase libre. À cette fin, corréler les concentrations de particules des fractions recueillies avec la concentration protéique et l’activité de la glucuronidase.
    1. Evaluer la concentration de particules par NTA (voir 2,5)
    2. Évaluez la teneur en protéines par dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) ou un autre dosage approprié de quantification des protéines. Effectuer le dosage selon le protocole du fabricant.
    3. Évaluer l’activité de la glucuronidase par dosage de la glucuronidase (voir rubrique 6).
  3. Si vous le souhaitez, évaluez la morphologie des EV par microscopie électronique à transmission (TEM) et microscopie électronique à balayage (SEM).
    1. Pour la préparation des échantillons TEM, ajouter 10 μL de suspension EV à une grille TEM, incuber pendant 10 min, puis éponger tout excès de liquide à l’aide d’un papier filtre. Effectuer la fixation pendant 10 min avec 10 μL de 4% de paraformaldéhyde et éponger tout excès. Laver 3x avec de l’eau. Tacher les vésicules par 20 s d’incubation avec 30 μL d’hydrate d’acide Phosphor-tungstique à 1%. Après avoir effacé l’excès, sécher les vésicules pendant la nuit. Visualisez par TEM.
      ATTENTION: l’acide phospho-tungstique est très caustique; ainsi, protéger la peau et les yeux.
    2. Pour le SEM, fixez les échantillons TEM préalablement préparés sur des disques de carbone et pulvérisez-les avec une couche d’or épaisse de 50 nm. Visualisez par SEM.

6. dosage de la glucuronidase

  1. Pour permettre une comparaison entre les différents échantillons et les conditions de stockage par corrélation entre le nombre de particules et l’activité enzymatique, mesurez d’abord la concentration particulaire de l’échantillon par NTA (Voir l’étape 2,5).
  2. Préparer une solution de travail de la fluorescéine di-β-D-glucuronide en ajoutant 1 μL du composé (10 mg/mL en H2O) à 199 ΜL de PBS. Ajouter 25 μL de cette solution à 125 μL d’EVs purifiés pour obtenir une concentration finale de 8,3 μg/mL. Pipetonner l’échantillon dans une plaque noire 96-well. Mesurer le point de temps 0 h avec un lecteur de plaque, en utilisant 480 nm comme excitation et 516 nm comme longueur d’onde d’émission.
  3. Recouvrir fermement la plaque (par exemple, avec une feuille de plastique transparente utilisée pour les plaques PCR) pour minimiser l’évaporation et incuber dans l’obscurité pendant 18 h à 37 ° c. Mesurez la production de fluorescéine à l’aide des paramètres du lecteur de plaque énumérés à l’étape 6,2.

7. stockage des EVs et des liposomes

Remarque: pour tous les besoins de stockage, il est conseillé d’utiliser des tubes à faible liaison pour réduire la perte de EV due à l’adsorption.

  1. Suivez les paramètres de cette section pour reproduire les résultats représentatifs donnés ci-dessous. Utiliser des échantillons constitués de 400 μL de suspension EV.
    1. Conserver à 4 ° c ou-80 ° c ou passer aux étapes énumérées ci-dessous.
    2. Lyophiliser les véhicules électriques.
      1. Ajouter le tréhalose (40 mg/mL en H2O) jusqu’à une concentration finale de 4 mg/ml pour les EVS purifiés. Congeler les échantillons à-80 ° c pendant au moins 1 h.
      2. Lyophiliser les échantillons en utilisant les paramètres suivants. Pour le séchage principal, réglez la température de l’étagère à 15 ° c et la pression à 0,180 mbar et laissez les échantillons sécher pendant 46 h. Pour le séchage final, régler la température de l’étagère à 25 ° c et la pression à 0,0035 mbar et laisser les échantillons sécher pendant 2 h. conserver les échantillons lyophilisés à 4 ° c.
      3. Pour réhydrater les échantillons, ajouter H2O, égal à la quantité de suspension ev présente au début (typiquement, 400 μl). Ne pas utiliser de tampon pour la réhydratation.

8. analyse après stockage

  1. Pour évaluer l’activité enzymatique, retirez d’abord la glucuronidase libre, qui peut avoir fui les EVs pendant le stockage. Réaliser ceci par une étape supplémentaire de purification qui est effectuée soit par SEC (voir étape 5) ou par fractionnement de flux de champ asymétrique (AF4) (Voir l’étape 8.1.2).
    Remarque: Veuillez noter que les deux méthodes conduisent à une dilution de l’échantillon EV; ainsi, utiliser suffisamment de concentrations EV avant le stockage pour éviter de se déplacer en deçà de la limite de quantification NTA. Attendez-vous à une dilution 1:10 des particules en raison de SEC ou AF4.
    1. Pour la purification SEC, suivre le protocole décrit ci-dessus (voir section 5).
    2. Effectuer la purification AF4.
      1. Installer l’instrument à l’aide d’un petit canal avec une entretoise de 350 μm et une membrane de cellulose de 30 kD à coupure de poids moléculaire. Placez un filtre de taille de pores de 0,1 μm entre la pompe HPLC et le canal AF4. Utilisez du PBS filtré à 0,1 μM fraîchement préparé comme phase mobile pour réduire la charge de particules et le bruit dans les détecteurs de diffusion de la lumière.
      2. Détectez les protéines à l’aide d’un détecteur UV réglé sur 280 nm. Pour détecter les particules, utilisez la diffusion de la lumière multiangulaire avec le laser réglé à 658 nm.
      3. Utilisez la méthode d’exécution suivante. Pré-Focus pendant 1 min avec un flux de mise au point de 1 mL/min; Ensuite, injecter 300 μL de l’échantillon à un taux de 0,2 mL/min et maintenir le flux de mise au point pendant 10 min. Après l’injection, éluer l’échantillon à 1 ml/min pendant l’application d’un flux croisé qui diminue de 2 ml/min à 0,1 ml/min au cours de 8 min. éluer pour une autre 10 min sans écoulement croisé. Prélever des fractions de 1 mL, en commençant après 12,5 min et en continuant jusqu’à 27 min.
    3. Effectuer le dosage de la glucuronidase comme décrit ci-dessus (voir rubrique 6).
  2. Pour évaluer la taille et la concentration, utilisez le NTA comme décrit ci-dessus (Voir l’étape 2,5).
  3. Éventuellement, exécutez TEM et SEM pour évaluer la morphologie des EVs après le stockage (voir 5,3).

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Representative Results

La figure 1 affiche les caractéristiques de stockage des véhicules électriques isolés des HUVECs. Les EVs ont été isolés par UC, la glucuronidase a été encapsulée et après la SEC, les EVs purifiées ont été évaluées pour leurs propriétés physicochimiques par NTA. Un échantillon des vésicules a ensuite été soumis à la purification AF4 et l’activité de la glucuronidase a été mesurée.

Les vésicules ont ensuite été entreposées pour 7 d à 4 ° c ou-80 ° c et à 4 ° c sous forme lyophilisée, dans ce dernier cas avec l’addition de 4% de tréhalose. Après le stockage, les vésicules ont été à nouveau mesurées par NTA, et après AF4, l’activité de glucuronidase restante par particule a été évaluée.

Le principe de fonctionnement du AF4 est basé sur la combinaison du flux laminaire et d’un flux orthogonale à travers la membrane poreuse au bas du canal AF4, ce qui affecte de façon différentielle les particules en fonction de leur taille (figure 2). Les particules plus grosses tendent à être localisées plus près de la membrane tandis que les particules plus petites sont situées plus haut dans le canal. En raison du profil de débit parabolique du flux laminaire, les particules plus loin de la membrane se déplacent plus rapidement vers le détecteur, conduisant à une séparation des particules par taille. Dans une expérience AF4 typique, les particules injectées sont d’abord concentrées sur la membrane, en appliquant un flux croisé sans écoulement longitudinal à travers le canal (figure 2a). Après injection et mise au point, l’élution commence par l’application simultanée d’un flux croisé et d’un écoulement longitudinal pour fractionner et éluer les différents sous-ensembles de particules (figure 2B), qui, dans notre cas, étaient des EVS et de la glucuronidase libre.

La figure 3 illustre la séparation des nanoparticules (EVS ou liposomes) des protéines contaminantes et de la glucuronidase non encapsulée. Le profil d’élution SEC des liposomes (figure 3A) purifié après leur préparation (voir la section 4 du protocole) a montré la séparation des particules avec la glucuronidase encapsulée de l’enzyme libre, détectée à la fois par dosage BCA et l’activité enzymatique. Dans le présent exemple, les fractions 6 et 7 seraient choisies pour d’autres expériences car elles contenaient les concentrations de particules les plus élevées et pour prévenir les contaminations possibles avec la glucuronidase libre. AF4 a également réussi à séparer les EVs de la glucuronidase libre comme le démontre la figure 3B, avec un degré de séparation plus élevé que sec, ce qui rend la contamination des fractions contenant des vésicules moins probables.

Dans la figure 4, une expérience de contrôle a été réalisée pour s’assurer que l’activité enzymatique mesurée pour les vésicules était en effet liée à l’encapsulation de la glucuronidase en EVS et non causée par des agrégats enzymatiques. Ces agrégats pourraient avoir été formés en raison de l’incubation de la glucuronidase avec la saponine et conduire à des résultats faussement positifs. Pour vérifier les fractions où les vésicules seraient éluées, les EVs purifiées sans glucuronidase encapsulée ont été soumises à la SEC sur la même colonne que l’échantillon contenant seulement de la saponine et de l’enzyme.

Lorsque la glucuronidase a été incubée avec la saponine et ensuite purifiée par SEC, aucune activité enzymatique n’a été trouvée dans les fractions contenant généralement des EVs. Alors que de petites quantités de particules ont été trouvées pour éluer en même temps que les EVs (ce qui représente < 0,1% des particules récupérées à partir d’une granule EV typique), il n’y avait pas d’activité enzymatique corrél. Ces résultats indiquent que l’enzyme active retrouvée dans les fractions contenant des vésicules a été encapsulée dans ces derniers.

La figure 5 compare la récupération de l’enzyme active après le stockage avec ou sans purification AF4 supplémentaire pour enlever le colorant non encapsulé. Avec la purification AF4, il y a généralement une récupération plus faible de l’enzyme par particule, avec l’effet le plus élevé pour le stockage à 4 ° c, où la récupération diminue de deux tiers. Ainsi, omettre cette étape de purification supplémentaire peut conduire à des hypothèses erronées sur la stabilité de l’enzyme.

La figure 6 montre l’effet de la lyophilisation sans cryoprotecteur sur les vésicules dérivées des MSCS, des cellules A549 et des liposomes, comparativement au gel à-80 ° c. Les particules ont été imagées par TEM et SEM comme décrit ci-dessus (Voir l’étape 5,3 du protocole). Les MSCs et les A549 EVs ne présentent pas de grandes différences de forme dans les images TEM, comparant les deux conditions de stockage. Dans les images SEM, cependant, les échantillons lyophilisés affichaient des agrégats non trouvés dans les échantillons-80 ° c. Les liposomes ont également affiché des agrégats dans l’image SEM, tandis que dans le TEM, la lyophilisation semble induire une augmentation de la taille des liposomes. La lyophilisation sans cryoprotecteurs a également réduit la récupération de la glucuronidase intacte après le stockage (figure 7). L’addition de tréhalose en tant que cryoprotecteur a accru la récupération de l’enzyme active d’une manière dose-dépendante.

La figure 8 démontre la conversion de la fluorescéine di-β-D-glucuronide en fluorescéine libre, qui se déroule dans le dosage de la glucuronidase. Alors que l’éduct était non fluorescent à 516 nm, la fluorescéine est très fluorescente à cette longueur d’onde. Cela a permis un dosage d’activité enzymatique simple avec une sensibilité élevée.

Figure 1
Figure 1 : Stabilité de stockage de HUVEC EVS. (A) récupération des particules par rapport au stockage avant, (B) la taille moyenne et (C) l’activité de la glucuronidase normalisée par particule d’EVS isolée des HUVECs. Les vésicules ont été entreposées pour 7 d à 4 ° c et-80 ° c et à 4 ° c après lyophilisation avec 4% de tréhalose. La taille moyenne et la récupération des particules ont été mesurées par NTA; l’activité de la glucuronidase par particule a été calculée en combinant les données NTA et les résultats du dosage de la glucuronidase et en les normalisant avant le stockage. Moyenne ± écart-type, n = 3, *p < 0,05 (ANOVA à sens unique suivie du test post-hoc de Tukey). Modifié de Frank et coll.21. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
La figure 2 : Principe de fonctionnement du AF4. (A) EVS et la glucuronidase libre sont concentrées après l’injection en appliquant un flux croisé. (B) ensuite, les EVS et l’enzyme libre sont élués séparément en combinant le flux à travers le canal avec un flux croisé. Modifié de Frank et coll.21. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Séparation des EVS et des liposomes de la glucuronidase libre. A) séparation représentative des liposomes chargés de glucuronidase, delaglucuronidase libre et des contaminants protéiques. Le graphique affiche la concentration en particules (rouge), la concentration en protéine (bleue) et l’activité de la glucuronidase (vert). Bdémonstration de la séparation des EVS de la glucuronidase libre. Les véhicules électriques non traités, les EVs dopés avec 0,05 mg/mL de glucuronidase, la glucuronidase libre (0,5 mg/mL) et les EVs chargés de glucuronidase et purifiés par la SEC (EV glucuronidase) ont été injectés et analysés par des UV à 280 nm et à 90 ° de dispersion lumineuse. L’enzyme libre éluted séparément des EVs. Modifié de Frank et coll.21. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Expériences de contrôle pour la purification des EVS de la glucuronidase libre. 400 μL d’EVs indigènes ou 400 μL de 1,5 mg/mL de glucuronidase dans le PBS incubé pendant 10 min avec 0,1 mg/mL de saponine ont été purifiés par la SEC.a) les concentrations de particules des fractions de vésicules et de glucuronidase recueillies respectivement et l’activité enzymatique de la glucuronidase purifiée. B) absorption UV à 280 nm mesurée dans la même expérience. Le premier petit pic de glucuronidase correspond à la ligne grise du panneau A. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : L’effet des étapes de purification supplémentaires après le stockage ev. Activité de glucuronidase restante par particule par rapport à D0 avec ou sans une étape de purification AF4 supplémentaire après le stockage. Les HUVEC EVs ont été entreposés pendant 7 d à 4 ° c ou-80 ° c et lyophilisés avec 4% de tréhalose. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Images TEM et SEM d’EVS. Les images TEM et SEM d’EVs de (A) MSCS et (B) A549 Cells et (C) liposomes. Les échantillons ont été stockés pour 14 d à-80 ° c ou lyophilisés sans addition de tréhalose. Les flèches indiquent la présence de particules morphologiquement altérées dans les images TEM et les agrégats dans les images SEM. Modifié de Frank et coll.21. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : L’effet du tréhalose sur la récupération enzymatique après lyophilisation. Comparaison de l’activité enzymatique après lyophilisation pendant 14 jours, avec 0%, 1% et 4% de tréhalose avec l’échantillon avant stockage (0 jours). Modifié de Frank et coll.21. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Le clivage enzymatique de fluorescéine di-β-D-glucuronide par glucuronidase. Dans le schéma, la réaction sous-jacente à la détection de la glucuronidase est expliquée. La fluorescéine non fluorescente di-β-D-glucuronide est clivé par la glucuronidase. Par l’enlèvement des résidus de sucre, la fluorescéine reprend ses propriétés fluorescentes. La fluorescence mesurée après la période d’incubation est corrélée avec la quantité d’enzyme active présente et est la lecture du dosage de la glucuronidase. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole complet pour étudier la stabilité des véhicules électriques dans des conditions de stockage différentes. Avec la combinaison de glucuronidase encapsulée comme lecture fonctionnelle et l’évaluation des paramètres physicochimiques des EVs, le protocole permet une évaluation simple de la stabilité du stockage des véhicules électriques et la comparaison des EVs de différentes cellules Lignes. SEM et TEM en tant que méthodes complémentaires permettent un aperçu des changements des EVs au niveau de la particule unique. Les résultats présentés ici montrent une tendance des EVs et des liposomes à s’agréger en raison de la lyophilisation sans cryoprotecteur (figure 6). Cependant, cela n’a été observé que dans les expériences SEM. Alors que l’imagerie EM n’a pas été réalisée avec des échantillons qui ont été conservés avec le tréhalose, la littérature suggère que ce cryoprotecteur pourrait effectivement réduire l’agrégation des EVs29. Il est également possible d’évaluer, si une condition de stockage donnée affecte de façon différentielle la taille EV, le taux de récupération et les molécules encapsulées. Un tel effet est illustré par les résultats obtenus pour HUVEC EVs (figure 1). Alors que la récupération des particules pour 4 ° c et-80 ° c était meilleure que pour les échantillons lyophilisés, la récupération de la glucuronidase encapsulée active était la meilleure pour les échantillons lyophilisés. La lyophilisation des EVs pourrait être la condition de stockage plus favorable, par exemple, lors de l’analyse des biomarqueurs EV, où l’accent est plus sur l’obtention et la préservation de la cargaison intacte plutôt que sur les vésicules intactes.

Dans leur récent article sur la lyophilisation d’EVs22, charoenviriyakul et coll. ont suivi une approche comparable. En ce qui concerne les paramètres physicochimiques, ils se sont concentrés sur l’indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta, car les changements du potentiel zêta peuvent corréler avec une stabilité colloïdale réduite. Cependant, le potentiel zêta ne peut pas expliquer uniquement les changements observés dans la stabilité30, ce qui a également été reflété dans leurs résultats. Ils ont également comparé la teneur en protéines et en ARN des EVs stockés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Cette technique peut très bien indiquer des changements substantiels dans la teneur en protéine ou en ARN des vésicules. Cependant, il nécessite des quantités beaucoup plus importantes de matériel que la méthode présentée ici. Pour évaluer l’effet du stockage sur la cargaison de véhicules électriques, Charoenviriyakul et coll. ont exprimé de façon hétérologue une enzyme et des espèces d’ADN dans leur lignée de cellules de producteurs EV et ont surveillé leur activité et leur intégrité dans les véhicules électriques. Toutefois, une telle expression hétérologue n’est pas appropriée si les EVs de différentes sources doivent être comparées, car elle nécessite une quantité substantielle de temps pour chaque nouvelle lignée de cellules, tandis que l’encapsulation simple médiée par la saponine peut être facilement appliquée.

Il est crucial d’enlever toute enzyme non encapsulée, comme illustré à la figure 3. La glucuronidase EV-encapsulée réagit beaucoup plus lentement avec son substrat que l’enzyme libre en solution, conduisant à une surestimation de l’efficacité d’encapsulation. Une séparation propre est particulièrement importante pour l’analyse après le stockage, car les conditions de stockage peuvent affecter l’activité de la glucuronidase libre dans l’échantillon différemment et peuvent entraîner des fuites des véhicules électriques endommagés. Cela était apparent dans nos expériences (figure 5), comme l’application de AF4 avant le dosage de la glucuronidase a réussi à éliminer le colorant non encapsulé dans les vésicules. Ainsi, il a permis d’obtenir des résultats clairs sur l’effet des méthodes de stockage discutées ici, alors que sans AF4, la perte d’activité due au stockage aurait été sous-estimée.

Une autre considération importante est l’isolement et la caractérisation des véhicules électriques à tester pour leur stabilité. Bien que la technique décrite permette la comparaison des EVS de différentes sources, cela n’est possible que si tous sont préparés selon la même méthode d’isolement, de sorte que les résultats ne sont pas faussés18,31,32. Dans ce contexte, les conditions de culture cellulaire doivent également être prises en considération, car elles peuvent influer sur la quantité et la bioactivité des EVs33isolés. Pour obtenir des résultats qui peuvent être comparés à d’autres résultats publiés, il est conseillé de consulter la récente mise à jour "information minimale pour les études des vésicules extracellulaires" qui contient des lignes directrices pour l’harmonisation de la recherche EV26.

Dans le protocole présenté ici, nous avons utilisé SEC ou AF4 pour enlever l’enzyme libre après le stockage. D’autres méthodes pourraient être appliquées, telles que le gradient ultracentrifugation, UC, ou ultrafiltration34. Par rapport aux méthodes centrifuges, SEC et AF4 sont moins chronophages (p. ex., environ 1,5 h pour la SEC, y compris l’équilibration de la colonne versus jusqu’à 16 h ou plus pour le gradient UC) et ils peuvent séparer complètement les protéines libres des EVs par rapport à l’UC normale, où Il reste toujours le surnageant résiduel avec le culot. En outre, SEC15 et AF435 sont des méthodes douces, qui induisent moins de stress de cisaillement sur le EVS. En comparaison, les forces imposées à EVS pendant l’UC pourraient conduire à des altérations des particules, telles que l’agrégation et les altérations de taille34,36.

Un inconvénient de SEC et AF4 est la dilution des échantillons. Ainsi, il est nécessaire d’isoler des quantités suffisantes d’EVs pour maintenir les concentrations requises pour les mesures de NTA après plusieurs étapes de purification. Les fractions EV peuvent être concentrées à l’aide de filtres centrifuges, mais, selon le matériau filtrant et le protocole, il pourrait y avoir une perte de vésicules37.

La limitation du protocole discuté ici est qu’il surveille uniquement l’activité enzymatique de la glucuronidase encapsulée de façon exogène, ni en tenant compte de l’ARN encapsulé et de l’ADN ni des protéines de surface EV qui pourraient être importantes pour la fonctionnalité18 . Pour la recherche de nouvelles thérapies EV, cette technique ne peut pas remplacer les essais sur la fonctionnalité, mais les complimenter et donner une indication sur la stabilité des vésicules. Il pourrait être d’une grande utilité si, par exemple, les EVs dérivés de Biofluides doivent être stockés pour une analyse ultérieure de leur teneur en vésicules.

À l’avenir, le champ d’application de ce protocole pourrait être élargi pour inclure également les EVs dérivées d’autres organismes, par exemple, les vésicules membranaires externes bactériennes. Une autre prochaine étape intéressante serait de tester l’encapsulation des acides nucléiques par incubation de saponine et d’examiner également la stabilité des cargos d’ADN ou d’ARN.

En conclusion, cette procédure offre une méthode simple pour l’évaluation de la stabilité du stockage des véhicules électriques à partir de diverses sources de cellules mammaliennes en intégrant à la fois une lecture physicochimique et fonctionnelle. Ce protocole détaillé permettra aux chercheurs d’EV une détermination simple des conditions de stockage appropriées pour leurs vésicules.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le programme de recherche Junior NanoMatFutur du ministère fédéral de l’éducation et de la recherche, Allemagne (Grant number 13XP5029A) a appuyé ce travail. Maximilian Richter a été soutenu par la Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fondation allemande des bourses d’études académiques) par le biais d’une bourse de doctorat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) Sigma-Aldrich P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) Sigma-Aldrich P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks Corning 431082 Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane Wyatt Technology Europe 1854
350 µm spacer Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase Sigma-Aldrich G7646-100KU
Chloroform Fisher scientific C/4966/17
Column oven Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector  Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm Merck VVLP04700 Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3156 Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec Wyatt Technology Europe
EGM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3162 Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers R&D Systems DY992 used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol Fisher scientific E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block Avanti Polar Lipids 610000-1EA
Filter support Avanti Polar Lipids 610014-1EA used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide Thermo Fisher Scientific F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36 Thermo Fisher Scientific 18912014
Hettich Universal 320 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells Lonza Verviers, S.p.r. C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM Kimble 420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR international 525-0255 the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1 Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes Whatman/GE Healthcare 110406 used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate Sigma-Aldrich 79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation Beckman Coulter 355622
QuantiPro BCA Assay Kit Sigma-Aldrich QPBCA-1KT
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b GE Healthcare 17014001
SEM copper grids with carbon film Plano S160-4
Small AF4 channel Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor Beckman Coulter 339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K Beckman Coulter
UV detector Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter Whatman/GE Healthcare 10401712 Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

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References

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Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, G. Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (147), e59584, doi:10.3791/59584 (2019).

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