Summary
Her presenterer vi en lett anvendelig protokoll for å vurdere lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer, en gruppe av naturlig forekommende nanopartikler produsert av celler. Den blemmer er lastet med glucuronidase som en modell enzym og lagres under ulike forhold. Etter lagring evalueres deres fysikalsk parametre og aktiviteten til det innkapslet enzymet.
Abstract
Ekstracellulære blemmer (EV) er lovende mål i dagens forskning, som skal brukes som narkotika, narkotika-bærere, og biomarkører. For deres klinisk utvikling, ikke bare deres farmasøytiske aktivitet er viktig, men også deres produksjon må vurderes. I denne sammenhengen fokuserer forskningen på isolering av EV-er, deres karakterisering og deres lagring. Det nåværende manuskriptet tar sikte på å gi en facile prosedyre for vurdering av effekten av ulike lagringsforhold på EV ' r, uten genetisk manipulasjon eller spesifikke funksjonelle analyser. Dette gjør det mulig å raskt få et første inntrykk av stabiliteten til EV ' r under en gitt oppbevarings tilstand, og EV ' er avledet fra forskjellige celle kilder kan sammenlignes lett. Stabilitets målingen er basert på de fysikalsk parametrene til EV ' r (størrelse, partikkel konsentrasjon og morfologi) og bevaring av aktiviteten til lasten. Sistnevnte er vurdert av saponin-mediert innkapsling av enzymet beta-glucuronidase i EV ' r. Glucuronidase fungerer som et surrogat og gir en enkel kvantifisering via kløften av et fluorescerende reporter molekyl. Den nåværende protokollen kan være et verktøy for forskere i jakten på lagringsforhold som optimalt beholde EV egenskaper for å fremme EV forskning mot klinisk anvendelse.
Introduction
EV ' r er membran bundne nanopartikler produsert av nesten alle celletyper. For pattedyrceller kan EV ' r deles inn i to hovedgrupper med forskjellige produksjons veier1,2. Membran blemmer, med en størrelse varierer fra cirka 100-1000 NM, produseres av direkte spirende fra cellemembranen. Exosomes, størrelse 30-200 NM, er avledet fra multivesicular organer dannet av innover spirende inn endosomes som senere sikring med cellemembranen å løslate flere Exosomes samtidig. Den viktigste funksjonen til disse blemmer er transport av informasjon mellom celler3. For dette formålet, cargos som RNA, DNA, og proteiner er aktivt sortert inn i dem. EV ' r kan formidle en rekke effekter på sine mål, med implikasjoner for både helse og sykdom tilstand. På den ene siden, de megle positive effekter som vev gjenfødelse, antigenpresentasjon, eller antibiotika effekter, noe som gjør dem lovende mål for sin utvikling somlegemiddel,5. På den andre siden kan EV-er fremme tumor endometrial blodkar6, indusere tilskuer effekter i stress respons7, og kan spille en rolle i autoimmune sykdommer8 og inflammatoriske sykdommer9. Dermed kan de være en viktig komponent til en bedre forståelse av mange patologiske effekter. Men tilstedeværelsen av endrede EV ' i manifold sykdommer, slik som kreft10,11,12 og kardiovaskulære lidelser13, og deres lett tilgjengelighet i blod og urin gjør dem ideelle biomarkører. Endelig har deres gode biokompatibilitet14 og deres iboende målretting evne til å gjøre EV ' er også interessant for legemiddellevering15. I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll for evalueringen av lagrings stabiliteten til EV-er avledet fra pattedyrceller, en viktig egenskap som fortsatt er lite undersøkt.
For den kliniske utviklingen av EV ' r er det fortsatt mange hindringer for overvinne16, inkludert evaluering av deres terapeutiske effekter, produksjon, rensing og lagring17. Mens-80 ° c er allment sett på som gullstandarden for EV lagring18, de nødvendige frysere er dyre, og opprettholde den nødvendige kjølekjeden fra produksjon til pasienten kan være utfordrende. Videre tyder enkelte rapporter på at lagring på-80 ° c fortsatt ikke optimalt bevarer EV ' er og medfører et tap i EV-funksjonalitet19,20. Andre metoder, for eksempel frysetørking21,22 eller spray-tørking23, har blitt foreslått som potensielle alternativer til den frosne lagring av EV ' r.
Den optimale måten å vurdere lagrings stabilitet på vil være å teste EV ' r i funksjonelle analyser eller ved evalueringen av en bestemt markør, for eksempel deres antibakterielle aktivitet19. Dette er mulig når den ønskede effekten av blemmer er kjent og når en bestemt gruppe av EV ' r skal studert. Hvis EV-er fra forskjellige celle kilder skal sammenlignes (f.eks. for legemiddel innkapsling) eller hvis det ikke finnes noen kjent funksjonell avlesning, er det ikke lenger mulig å vurdere endringer på grunn av lagring på en direkte måte.
På den annen side, bare evaluere endringer i sine fysikalsk parametere, for eksempel størrelse, partikkel utvinning, og proteinkonsentrasjon, ikke alltid forutsi endringer i EV aktivitet, som har vært vist i en fersk patent20.
Her gir vi en lett anvendelig protokoll for å måle lagrings stabiliteten til EV ' r ved å vurdere deres fysikalsk parametre kombinert med aktiviteten til et innkapslet beta-glucuronidase enzym som et surrogat for lasten av EV ' r. Lastingen av enzymet gjøres ved saponin inkubasjons, en mild metode etablert med EV ' r fra ulike kilder21,24,25. Saponin danner forbigående porer i EV-membranen, som gjør det mulig å bruke enzym opptak i vesicle. Ettersom enzymer er tilbøyelige til å miste sin aktivitet hvis de utsettes for ugunstige lagringsforhold, er de et ideelt surrogat for evalueringen av bevaring av funksjonelle laster av EV ' r.
Vi har vist at anvendelsen av denne protokollen til EV ' r avledet fra menneskelige Mesenchymal stamceller (MSCs), menneskelig navle vene endothelial celler (HUVECs), og menneskelige adenokarsinom alveolære epitelceller (A549) faktisk føre til store forskjeller i lagrings stabilitet mellom ulike cellelinjer, som bør tas i betraktning når du velger EV kilde21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur og produksjon av celle-conditioned medium
- Vanligvis dyrke celler under de enkelte forholdene som kreves for den respektive cellelinje.
- Dyrke cellene for 24-72 h i serum-frie forhold eller i medium inneholder EV-utarmet fosterets storfe serum (FBS).
Merk: Hvis EV-utarmet FBS brukes, bør du bruke en metode som er bevist for å effektivt tømme serum, for å hindre forurensning med blod serum avledede EV.26. - Samle mediet fra flaskene. Sentrifuger på 300 x g for 10 min til pellet cellene. Nøye samle celle-conditioned medium (CCM), uten å forstyrre de pelleted cellene. Fortrinnsvis, bruk CCM direkte, eller oppbevar den over natten ved 4 ° c.
Merk: det er alltid å foretrekke å bruke nylig produsert CCM. Hvis lagring for lengre tidsperioder ikke kan omgås, skal alle relevante parametre registreres i henhold til MISEV2018 retningslinjer26, og de potensielle bias av de oppnådde resultatene må tas i betraktning. - Eksempel protokoll for HUVECs
- Dyrke HUVEC celler for 120 h i EGM-2 medium som inneholder FBS og andre kosttilskudd.
- Dyrke HUVEC celler for 48 h i EBM-2 basal medium uten ekstra kosttilskudd.
- Samle mediet fra flaskene og utfør det sentrifugering trinnet som angitt ovenfor (trinn 1,3). Bruk vanligvis 100 mL medium for en EV-isolasjon.
2. Ultracentrifugation av CCM
- Umiddelbart før ultracentrifugation (UC), sentrifuger CCM i 15 min ved 3 000 x g og 4 ° c for å fjerne celle rusk og store agglomerater.
- Overfør supernatanten forsiktig til UC-rørene. Hvis du bruker en fast vinkel rotor, Merk retningen på rørene i sentrifuger for å lette henting av EV pellet etter UC. Sentrifuger for 2 t ved 120 000 x g, med en k-faktor på 259,4.
- Etter UC, kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en serologisk Pipet, for å unngå forstyrrelse av pelleted EV ' r.
Merk: pellet kan være usynlig. - Tilsett 200 μL av 0,2 μm-filtrert fosfat-bufret saltvann (PBS) til det første røret og bruk PBS og rest supernatanten til å resuspend pellet ved pipettering opp og ned. Overfør den resulterende EV-fjæringen til neste rør av den respektive prøven og bruk den til blanding. Fortsett på denne måten for å resuspend alle EV ' r i prøven i et endelig volum på ca. 300-350 μL.
- Etter blanding, bekrefte tilstedeværelsen av partikler ved nanopartikkel sporing analyse (NTA). Bruk innstillingene som er optimalisert for den gitte EV-typen, for eksempel innstillingene nedenfor (trinn 2.5.1).
Merk: papirene til gardiner et al.27 og Vestad et al.28 inneholder verdifull informasjon om hvordan du optimaliserer parametrene for måling av EV ' r.- For å gjengi resultatene som er beskrevet nedenfor, bruk instrumenter (f. eks NanoSight LM14) utstyrt med en grønn laser. Spille inn tre videoer av 30 s med en skjerm gevinst på 1,0 og et kameranivå på 13. For analyse, bruk en skjermen fortjene av 1,0 og en oppdagelsen grense av 5.
- Bruk pellet umiddelbart, hvis mulig; ellers, oppbevar den ved 4 ° c over natten.
3. Glucuronidase innkapsling til EV ' r
- Til resuspendert pellet, tilsett beta-glucuronidase (10 mg/mL i PBS) til en endelig konsentrasjon av 1,5 mg/mL og saponin (10 mg/mL i H2O) til en endelig konsentrasjon på 0,1 mg/ml. Bland godt av virvlingen for 3 s.
- Ruge i 10 min ved romtemperatur med intermitted blanding ved å sveipe forsiktig i røret. Etter inkubasjons, direkte rense av størrelse-utelukkelse kromatografi (SEC) (se avsnitt 5).
Merk: ikke REFREEZE glucuronidase prøver en gang tint, for å hindre enzym degradering på grunn av frysing.
4. liposome produksjon
- For å forberede liposomer for sammenligning med EV-er, oppløses 1, 2-dimyristoylfosfatidylkolin-sn-glycero-3-PHOSPHOCHOLINE (DMPC) og 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) i en 2:3 molar rasjon i kloroform til en endelig konsentrasjon på 5 mm. Forbered 1 mL alikvoter i høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) hetteglass og la dem tørke over natten for å danne en lipid film.
FORSIKTIG: kloroform er giftig og mistenkes for å være cancerogenic. Ta riktige forholdsregler ved håndtering av den. - Rehydrate lipid-filmen med 1 mL PBS inneholdende 1,5 mg/mL glucuronidase. Varm den til 42 ° c og Vortex i 1 min. varm opp Ekstruder forsamlingen til 42 ° c og extrude lipid suspensjonen 11x gjennom en 200 NM polykarbonat membran. Direkte rens av SEC (se avsnitt 5).
5. rensing av SEC
- Klargjør SEC-kolonnen ved hjelp av følgende protokoll.
- Bruk bare friskt renset vann og ferskt tilberedte buffere. Filtrer alle buffere gjennom en 0,2 μm membran filter og Degas dem for å hindre dannelse av luftbobler i kolonnen.
- For utarbeidelse av en SEC-kolonne, bruk agarose gel filtrerings BAS ert matrise (for eksempel Sepharose CL-2b) eller et annet SEC-medium som er egnet til å skille EV-er og liposomer fra protein urenheter og overflødig enzym. Først fjerne 20% EtOH løsning mediet er lagret i, for å hindre luftboble dannelse i kolonnen. For dette formål sentrifuger SEC medium på 3 000 x g i 10 min, Fjern EtOH, og erstatte den med degassed vann.
- Fyll en glass søyle (med en innvendig diameter på 10 mm) med SEC-mediet til 15 mL-merket.
Merk: volumene vil variere for kolonner med forskjellige dimensjoner. Sørg for å la gelen bosette seg helt. - Før et løp, likevekt kolonnen med minst to kolonne volumer av PBS. For å lagre kolonnen, må du først vaske den med en kolonne volum av vann, etterfulgt av minst to kolonne volumer på 20% EtOH. Etter lagring, vask kolonnen først med en kolonne volum av vann før equilibrating med PBS.
- Bruk opptil 400 μL av EV eller liposome suspensjon i ett separasjon. Samle fraksjoner på 1 mL. Etter SEC, enten lagre renset EV ' er (se pkt. 7) eller utsette dem for en glucuronidase analysen (se avsnitt 6).
- Bekreft separasjon av EV ' r og liposomer fra forurensende proteiner og gratis glucuronidase. For dette formål, relatere partikkel konsentrasjonen av de innsamlede fraksjoner med proteinkonsentrasjon og glucuronidase aktivitet.
- Vurdere partikkel konsentrasjonen ved NTA (se 2,5)
- Vurdere proteininnhold av bicinchoninic acid (BCA) analysen eller annen egnet protein kvantifisering analysen. Utfør analysen i henhold til produsentens protokoll.
- Vurder den glucuronidase aktiviteten ved å glucuronidase analysen (se avsnitt 6).
- Alternativt kan du vurdere EV morfologi ved overføring elektron mikroskopi (TEM) og skanning elektron mikroskopi (SEM).
- For fremstilling av TEM-prøver, tilsett 10 μL av EV-fjæring i et TEM-gitter, ruge i 10 minutter, og tørk deretter bort overflødig væske ved hjelp av et filter papir. Utfør fiksering i 10 minutter med 10 μL av 4% paraformaldehyde og tørk bort overflødig. Vask 3x med vann. Stain blemmer ved 20 s inkubasjons med 30 μL av 1% fosfor-wolframs syre hydrat. Etter blotting bort overflødig, tørk blemmer over natten. Visualiser ved TEM.
FORSIKTIG: fosfat-wolframs yre er svært etsende; dermed beskytte huden og øynene. - For SEM, fikse tidligere forberedt TEM prøvene på karbon disker og frese dem med en 50 NM tykt gull lag. Visualiser av SEM.
- For fremstilling av TEM-prøver, tilsett 10 μL av EV-fjæring i et TEM-gitter, ruge i 10 minutter, og tørk deretter bort overflødig væske ved hjelp av et filter papir. Utfør fiksering i 10 minutter med 10 μL av 4% paraformaldehyde og tørk bort overflødig. Vask 3x med vann. Stain blemmer ved 20 s inkubasjons med 30 μL av 1% fosfor-wolframs syre hydrat. Etter blotting bort overflødig, tørk blemmer over natten. Visualiser ved TEM.
6. Glucuronidase analysen
- For å tillate en sammenligning mellom ulike prøver og lagringsforhold ved samkjøre partikkel tall og enzym aktivitet, må du først måle partikkel konsentrasjonen av prøven ved NTA (se trinn 2,5).
- Forbered en fungerende løsning av fluorescein di-β-D-glukuronid ved å tilsette 1 μL av det sammensatte (10 mg/mL i H2O) til 199 ΜL av PBS. Tilsett 25 μL av denne løsningen til 125 μL av renset EV ' r for å få en endelig konsentrasjon på 8,3 μg/mL. Pipet prøven inn i en svart 96-brønn plate. Mål tid punkt 0 h med en plate leser, med 480 NM som eksitasjon og 516 NM som utslipps bølgelengde.
- Dekkplaten tett (f.eks. med transparent folie som brukes til PCR-plater) for å minimere fordamping og ruge i mørket i 18 timer ved 37 ° c. Mål fluorescein produksjonen ved hjelp av parameterne for plate leseren som er oppført i trinn 6,2.
7. lagring av EV-er og liposomer
Merk: for alle lagringsformål anbefales det å bruke lav bindings rør for å redusere EV-tap på grunn av absorpsjon.
- Følg parametrene i denne seksjonen for å gjengi representative resultater gitt nedenfor. Bruk prøver bestående av 400 μL av EV-fjæring.
- Oppbevares ved 4 ° c eller-80 ° c eller gå videre til trinn listet nedenfor.
- Lyophilize på EV ' r.
- Legg til trehalose (40 mg/mL i H2O) opp til en endelig konsentrasjon på 4 mg/ml til renset EV ' er. Frys prøvene ved-80 ° c i minst 1 time.
- Lyophilize prøvene ved hjelp av følgende parametre. For primær tørking setter du hylle temperaturen til 15 ° c og trykk for å 0,180 mbar og la prøvene tørke for 46 h. For endelig tørking setter du hylle temperaturen til 25 ° c og trykk for å 0,0035 mbar og la prøvene tørke i 2 timer. Oppbevar lyofilisert prøvene ved 4 ° c.
- For å rehydrate prøvene, tilsett H2O, lik mengden EV-fjæring som finnes i begynnelsen (vanligvis 400 μL). Ikke bruk buffer for rehydrering.
8. analyse etter lagring
- For å vurdere enzymaktiviteten må du først fjerne den frie glucuronidase, som kan ha lekket ut av EV ' r under lagring. Oppnå dette ved et ekstra trinn av rensing som utføres enten ved SEC (se trinn 5) eller asymmetrisk flyt felt flyt fraksjonering (AF4) (se trinn 8.1.2).
Merk: Vær oppmerksom på at begge metodene fører til en fortynning av EV prøven; Derfor bør du bruke tilstrekkelige EV-konsentrasjoner før lagring for å unngå å bevege deg under NTA kvantifisering grense. Forvent en 1:10 fortynning av partiklene på grunn av SEC eller AF4.- For SEC-rensing følger du protokollen som er beskrevet ovenfor (se avsnitt 5).
- Utfør AF4 rensing.
- Sett opp instrumentet ved hjelp av en liten kanal med en 350 μm spacer og en 30 kD molekylvekt avskåret cellulosemembran. Sett en 0,1 μm pore størrelse filter mellom HPLC pumpen og AF4 kanal. Bruk nylagde 0,1 μm-filtrerte PBS som den mobile fasen for å redusere partikkel belastningen og støyen i detektoren med lysspredning.
- Oppdag proteiner ved hjelp av en UV-detektor satt til 280 NM. For å detektere partikler, bruk multivinkel lysspredning med laseren satt til 658 NM.
- Bruk følgende kjøre metode. Pre-Focus for 1 min med en fokus flyt på 1 mL/min; Injiser deretter 300 μL av prøven med en hastighet på 0,2 mL/min og holde fokus flyten i 10 min. Etter injeksjonen eluere prøven ved 1 mL/min under påføring av en kryss strømning som avtar fra 2 mL/min til 0,1 mL/min i løpet av 8 min. Eluere for ytterligere 10 min uten kryss flyt. Samle fraksjoner på 1 mL, start etter 12,5 min og Fortsett til 27 min.
- Utfør den glucuronidase analysen som beskrevet ovenfor (se pkt. 6).
- For å vurdere størrelsen og konsentrasjonen, bruk NTA som beskrevet ovenfor (se trinn 2,5).
- Du kan eventuelt utføre TEM og SEM for å vurdere morfologi av EV ' r etter lagring (se 5,3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser lagringsegenskapene til EV ' er isolert fra HUVECs. EV ' r ble isolert av UC, glucuronidase var innkapslet, og etter SEC ble renset EV ' r evaluert for sine fysikalsk egenskaper av NTA. En prøve av blemmer ble senere utsatt for AF4 rensing og glucuronidase aktiviteten ble målt.
De blemmer ble deretter lagret i 7 d ved 4 ° c eller-80 ° c og ved 4 ° c i lyofilisert form, i sistnevnte tilfelle med tillegg av 4% trehalose. Etter lagring ble blemmer igjen målt ved NTA, og etter AF4 ble de resterende glucuronidase aktivitet per partikkel vurdert.
Arbeidsprinsippet for AF4 er basert på kombinasjonen av laminær strømning og en ortogonale crossflow gjennom den porøse membranen på bunnen av AF4-kanalen, som differensielt påvirker partikler i henhold til deres størrelse (figur 2). Større partikler har en tendens til å bli plassert nærmere membranen, mens mindre partikler er plassert lenger opp i kanalen. På grunn av den laminær strømningen, vil partikler lenger vekk fra membranen reise raskere mot detektoren, noe som fører til en partikkel separasjon etter størrelse. I et typisk AF4 eksperiment, de injisert partiklene er først fokusert på membranen, ved å bruke en tverr strøm uten en langsgående flyt gjennom kanalen (figur 2a). Etter injeksjon og fokusering starter eluering ved samtidig å påføre en tverr strømning og en langsgående strømning for å fractionate og eluere de ulike delsett av partikler (figur 2B), som i vårt tilfelle var EV ' s og fri glucuronidase.
Figur 3 illustrerer separasjon av nanopartikler (EV-er eller liposomer) fra forurensende proteiner og nonencapsulated glucuronidase. SEC eluering profilen av liposomer (Figur 3A) renset etter deres forberedelse (se pkt. 4 i protokollen) viste separasjon av partiklene med innkapslet glucuronidase fra det frie enzymet, oppdaget både gjennom BCA-analysen og enzym aktivitet. I det nåværende eksempelet vil fraksjon 6 og 7 bli valgt for videre eksperimenter da de inneholdt de høyeste partikkel konsentrasjonene og for å forhindre mulig forurensninger med gratis glucuronidase. AF4 var også vellykket i å separere EV ' r fra gratis glucuronidase som demonstrert i Figur 3B, med en høyere grad av separasjon enn SEC, noe som gjør forurensning av fraksjoner som inneholder blemmer mindre sannsynlig.
I Figur 4ble det utført et kontroll eksperiment for å sikre at enzymaktiviteten som ble målt for blemmer, faktisk var knyttet til innkapsling av Glucuronidase til EV ' r og ikke forårsaket av enzym aggregater. Disse aggregater kan ha blitt dannet på grunn av inkubasjons av glucuronidase med saponin og føre til falske positive resultater. For å verifisere fraksjoner der blemmer ville eluere, ble renset EV-er uten innkapslet glucuronidase utsatt for SEC på samme kolonne som prøven bare inneholder saponin og enzymet.
Da glucuronidase ble inkubert med saponin og senere renset av SEC, ble det ikke funnet enzym aktivitet i fraksjoner som vanligvis inneholdt EV ' er. Mens små mengder partikler ble funnet å eluere på samme tid som EV ' er (utgjør < 0,1% av partiklene utvinnes fra en typisk EV pellet), var det ingen samkjøre enzym aktivitet. Disse resultatene tyder på at aktive enzymet utvinnes i fraksjoner som inneholder blemmer var innkapslet i dem.
Figur 5 sammenligner utvinning av aktive enzymet etter lagring med eller uten ekstra AF4 rensing å fjerne nonencapsulated fargestoff. Med AF4 rensing er det generelt en lavere utvinning av enzymet per partikkel, med den høyeste effekten for lagring ved 4 ° c, der utvinningen synker med to tre deler. Dermed utelate denne ekstra rensing trinn kan føre til feil forutsetninger om enzymet stabilitet.
Figur 6 viser effekten av lyophilization uten kryoprotektant på blemmer avledet fra MSCs, A549 celler, og liposomer, sammenlignet med frysing ved-80 ° c. Partiklene ble avbildet av TEM og SEM som beskrevet ovenfor (se trinn 5,3 av protokollen). De MSCs og A549 EV ' r ikke viser store forskjeller i form i TEM-bilder, sammenligner de to lagringsforhold. I SEM-bilder, men de lyofilisert prøvene vises aggregater ikke funnet i-80 ° c prøver. Liposomer viste også aggregater i SEM-bildet, mens i TEM viste lyophilization seg å indusere en størrelses økning på liposomer. Lyophilization uten cryoprotectants også redusert utvinningen av intakt glucuronidase etter lagring (figur 7). Tilsetning av trehalose som en kryoprotektant økt utvinningen av det aktive enzymet i en dose avhengig måte.
Figur 8 demonstrerer konvertering av fluorescein di-β-D-glukuronid til gratis fluorescein, finner sted i glucuronidase analysen. Mens educt ble nonfluorescent ved 516 NM, fluorescein er svært fluorescerende på denne bølgelengden. Dette tillot en grei enzym aktivitet analysen med høy følsomhet.
Figur 1 : Lagrings stabiliteten til HUVEC EV ' er. (A) partikkel gjenvinning sammenlignet med før lagring, (B) middel størrelse, og (C) normalisert Glucuronidase-aktiviteten per partikkel av EV ' r isolert fra HUVECs. Blemmer ble oppbevart i 7 d ved 4 ° c og-80 ° c og ved 4 ° c etter lyophilization med 4% trehalose. Den gjennomsnittlige størrelsen og partikkel utvinningen ble målt ved NTA; glucuronidase aktivitet per partikkel ble beregnet kombinere NTA data og resultatene av glucuronidase analysen og normalisert til før lagring. Mean ± SD, n = 3, *p < 0,05 (enveis Anova etterfulgt av Tukey ' s post hoc test). Modifisert fra Frank et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Arbeidsprinsipp for AF4. (A) EV-er og gratis glucuronidase er fokusert etter injeksjon ved å bruke en tverr strøm. (B) etterpå blir EV-er og fritt enzym eluert separat ved å kombinere flyten gjennom kanalen med en kryss flyt. Modifisert fra Frank et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Separasjon av EV ' r og liposomer fra gratis glucuronidase. (A) representant SEC-separasjon av glucuronidase liposomer, frie glucuronidase og protein forurensninger. Grafen viser partikkel konsentrasjonen (rød), proteinkonsentrasjon (blå) og glucuronidase aktivitet (grønn). (B) demonstrasjon av separasjon av EV ' r fra gratis glucuronidase. Ubehandlede EV-er, med 0,05 mg/mL glucuronidase, gratis glucuronidase (0,5 mg/mL) og EV ' er lastet med glucuronidase og renset av SEC (EV glucuronidase) ble injisert og analysert av UV ved 280 NM og 90 ° lysspredning. Gratis enzym eluert separat fra EV ' r. Modifisert fra Frank et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Styr eksperimenter for rensing av EV ' r fra gratis glucuronidase. 400 μL av innfødte EV-er eller 400 μL av 1,5 mg/mL glucuronidase i PBS-inkubert i 10 minutter med 0,1 mg/mL saponin ble renset av SEC. (A) partikkel konsentrasjoner av de innsamlede fraksjoner av blemmer og glucuronidase, henholdsvis, og enzymaktiviteten til renset glucuronidase. (B) UV absorpsjon ved 280 NM målt i samme eksperiment. Den første lille toppen for glucuronidase samsvarer med den grå linjen i panel A. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Effekten av ekstra rensing trinn etter EV lagring. Resterende glucuronidase aktivitet per partikkel sammenlignet med D0 med eller uten en ekstra AF4 rensing trinn etter lagring. HUVEC EV ' er oppbevares i 7 d ved 4 ° c eller-80 ° c og lyofilisert med 4% trehalose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Tem-og SEM-bilder av EV ' r. TEM og SEM bilder av EV ' r fra (A) MSCs og (B) A549 celler og (C) liposomer. Prøvene ble lagret i 14 d ved-80 ° c eller lyofilisert uten tilsetning av trehalose. Piler indikerer tilstedeværelsen av morfologisk endrede partikler i TEM bilder og aggregater i SEM bilder. Modifisert fra Frank et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Effekten av trehalose på enzym gjenvinning etter lyophilization. Sammenligning av enzymaktiviteten etter lyophilization i 14 dager, med 0%, 1% og 4% trehalose med prøven før lagring (0 dager). Modifisert fra Frank et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Den enzymatisk fluorescein di-β-D-glukuronid ved glucuronidase. I ordningen, er reaksjonen underliggende påvisning av glucuronidase forklart. Nonfluorescent fluorescein di-β-D-glukuronid er kløyvde av glucuronidase. Gjennom fjerning av sukker rester, fluorescein gjenvinner sine fluorescerende egenskaper. Fluorescens målt etter inkubasjonsperioden samsvarer med mengden av aktive enzymet tilstede og er avlesning av glucuronidase analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet presenterer vi en omfattende protokoll for å studere stabiliteten til EV ' r under forskjellige Oppbevaringsbetingelser. Med kombinasjonen av innkapslet glucuronidase som en funksjonell avlesning og evalueringen av de fysikalsk parametrene til EV ' r, tillater protokollen en enkel lagring stabilitets evaluering av EV ' r og sammenligningen av EV ' r fra forskjellige celle Linjer. SEM og TEM som komplementære metoder gir innsikt i endringer av EV ' r på enkelt partikkel nivå. Resultatene som ble presentert her viste en tendens til at EV ' er og liposomer til Oppsamling på grunn av lyophilization uten kryoprotektant (figur 6). Men dette ble bare observert i SEM eksperimenter. Mens EM Imaging ikke ble gjennomført med prøver som ble bevart med trehalose, antyder litteraturen at denne kryoprotektant kan faktisk redusere aggregering av EV ' r29. Det er også mulig å vurdere, hvis en gitt lagrings tilstand differensielt påvirker EV størrelse, utvinningsgraden og innkapslet molekyler. En slik effekt er et eksempel på resultatene oppnådd for HUVEC EV ' er (figur 1). Mens partikkel utvinningen for 4 ° c og-80 ° c var bedre enn for lyofilisert prøvene, var utvinningen av aktiv innkapslet glucuronidase best for lyofilisert prøvene. Lyophilization av EV ' r kan være den mer gunstige lagrings betingelsen, for eksempel når man analyserer EV-biomarkører, hvor fokuset er mer på å oppnå og bevare intakt Last istedenfor på intakte blemmer.
I sitt siste papir om lyophilization av EV ' r22, Charoenviriyakul et al. fulgt en sammenlignbar tilnærming. Når det gjelder parameterne for fysikalsk, fokuserte de på polydispersitet-indeksen (PDI) og Zeta-potensialet, ettersom endringer i Zeta-potensialet kan relateres til redusert kolloidalt stabilitet. Zeta-potensialet kan imidlertid ikke bare forklare observerte endringer i stabiliteten30, som også gjenspeiles i resultatene. De sammenlignet også protein-og RNA-innholdet i lagrede EV ' er av polyakrylamid gel-elektroforese. Denne teknikken kan godt indikere betydelige endringer i protein eller RNA innhold av blemmer. Det krever imidlertid mye større mengder materiale enn metoden som presenteres her. For å vurdere effekten av lagring på EV Last, Charoenviriyakul et al. heterologously uttrykt et enzym og DNA-arter hver i sin EV produsent cellelinje og overvåket deres aktivitet og integritet i EV ' r. Slike heterologous uttrykk er imidlertid ikke egnet hvis EV ' r fra ulike kilder skal sammenlignes, da det krever en betydelig mengde tid for hver nye cellelinje, mens den enkle saponin innkapsling kan lett påføres.
Det er avgjørende å fjerne eventuelle nonencapsulated enzym, som vist i Figur 3. EV-Encapsulated glucuronidase reagerer mye tregere med sitt substrat enn gratis enzym i løsningen, som fører til en overvurdering av innkapsling effektivitet. Ren separasjon er spesielt viktig for analysen etter lagring, da lagringsforholdene kan påvirke aktiviteten til gratis glucuronidase i prøven annerledes og kan føre til lekkasje fra skadede EV ' er. Dette var tydelig i våre eksperimenter (figur 5), som anvendelsen av AF4 før glucuronidase analysen klarte å fjerne fargestoff ikke innkapslet i blemmer. Dermed gjorde det det mulig å få klare resultater på effekten av lagring metoder diskutert her, mens uten AF4, aktiviteten tap på grunn av lagring ville ha blitt undervurdert.
En annen viktig faktor er isolering og karakterisering av EV ' r som skal testes for deres stabilitet. Selv om den beskrevne teknikken muliggjør sammenligning av EV ' r fra ulike kilder, er dette bare mulig hvis alle av dem er utarbeidet av samme isolasjons metode, slik at resultatene ikke er forvrengt18,31,32. I denne sammenhengen må cellekultur forhold tas med i betraktningen også, da de kan påvirke mengden og bioactivity til de isolerte EV-33. For å oppnå resultater som kan sammenlignes med andre publiserte resultater, er det tilrådelig å konsultere den nylig oppdaterte "minimal informasjon for studier av ekstracellulære blemmer" som inneholder retningslinjer for harmonisering av EV forskning26.
I protokollen som presenteres her, brukte vi SEC eller AF4 for å fjerne den frie enzymet etter lagring. Andre metoder kan brukes, for eksempel graderings ultracentrifugation, UC eller ultrafiltrering34. Sammenlignet med sentrifugal metoder, er SEC og AF4 mindre tidkrevende (for eksempel omtrent 1,5 h for SEC, inkludert Kol onne likevekts versus opptil 16 t eller mer for gradient UC), og de kan helt separate frie proteiner fra EV ' r i forhold til normal UC, hvor gjenstår det alltid gjenværende supernatanten med pellet. Videre er SEC15 og AF435 milde metoder, som induserer mindre skjærbelastning på EV ' r. Til sammenligning kan de styrkene som pålegges på EV ' r under UC føre til endringer av partiklene, slik som aggregering og endringer i størrelse34,36.
En ulempe med SEC og AF4 er fortynning av prøvene. Det er derfor nødvendig å isolere tilstrekkelige mengder av EV ' r for å opprettholde konsentrasjonene som kreves for NTA målinger etter flere rense trinn. EV fraksjoner kan være konsentrert ved hjelp av sentrifugal filtre, men avhengig av filtermaterialet og protokollen, kan det være et tap av blemmer37.
Begrensningen av protokollen diskutert her er at den bare overvåker enzymet aktivitet av exogenously innkapslet glucuronidase, verken tar hensyn til innkapslet RNA og DNA eller EV overflaten proteiner som kan være viktig for funksjonalitet18 . For forskning av nye EV legemidler, kan denne teknikken ikke erstatte analyser på funksjonalitet, men kompliment dem og gi en indikasjon om vesicle stabilitet. Det kan være til stor nytte hvis for eksempel EV ' er avledet fra biofluids skal lagres for senere analyse av deres vesicle innhold.
I fremtiden kan omfanget av denne protokollen utvides til også å omfatte EV-er avledet fra andre organismer, for eksempel, bakteriell ytre membran blemmer. Et annet interessant neste skritt vil være å teste innkapsling av nukleinsyre syrer ved saponin inkubasjons og å også se på stabiliteten av DNA eller RNA cargos.
Som konklusjon, denne prosedyren tilbyr en enkel metode for vurdering av lagring stabiliteten av EV ' r fra ulike pattedyr celle kilder ved å integrere både en fysikalsk og en funksjonell avlesning. Denne detaljerte protokollen vil tillate EV forskere en grei bestemmelse av egnede lagringsforhold for sine blemmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Den NanoMatFutur Junior Research program fra Federal Ministry of Education and Research, Tyskland (Grant nummer 13XP5029A) støttet dette arbeidet. Maximilian Richter ble støttet av Studienstiftung des Deutschen Volkes (German Academic Scholarship Foundation) gjennom et doktorgrads fellesskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Processes for producing stable exosome formulations. US patent. Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
