Summary

Evaluering av lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer

Published: May 22, 2019
doi:

Summary

Her presenterer vi en lett anvendelig protokoll for å vurdere lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer, en gruppe av naturlig forekommende nanopartikler produsert av celler. Den blemmer er lastet med glucuronidase som en modell enzym og lagres under ulike forhold. Etter lagring evalueres deres fysikalsk parametre og aktiviteten til det innkapslet enzymet.

Abstract

Ekstracellulære blemmer (EV) er lovende mål i dagens forskning, som skal brukes som narkotika, narkotika-bærere, og biomarkører. For deres klinisk utvikling, ikke bare deres farmasøytiske aktivitet er viktig, men også deres produksjon må vurderes. I denne sammenhengen fokuserer forskningen på isolering av EV-er, deres karakterisering og deres lagring. Det nåværende manuskriptet tar sikte på å gi en facile prosedyre for vurdering av effekten av ulike lagringsforhold på EV ‘ r, uten genetisk manipulasjon eller spesifikke funksjonelle analyser. Dette gjør det mulig å raskt få et første inntrykk av stabiliteten til EV ‘ r under en gitt oppbevarings tilstand, og EV ‘ er avledet fra forskjellige celle kilder kan sammenlignes lett. Stabilitets målingen er basert på de fysikalsk parametrene til EV ‘ r (størrelse, partikkel konsentrasjon og morfologi) og bevaring av aktiviteten til lasten. Sistnevnte er vurdert av saponin-mediert innkapsling av enzymet beta-glucuronidase i EV ‘ r. Glucuronidase fungerer som et surrogat og gir en enkel kvantifisering via kløften av et fluorescerende reporter molekyl. Den nåværende protokollen kan være et verktøy for forskere i jakten på lagringsforhold som optimalt beholde EV egenskaper for å fremme EV forskning mot klinisk anvendelse.

Introduction

EV ‘ r er membran bundne nanopartikler produsert av nesten alle celletyper. For pattedyrceller kan EV ‘ r deles inn i to hovedgrupper med forskjellige produksjons veier1,2. Membran blemmer, med en størrelse varierer fra cirka 100-1000 NM, produseres av direkte spirende fra cellemembranen. Exosomes, størrelse 30-200 NM, er avledet fra multivesicular organer dannet av innover spirende inn endosomes som senere sikring med cellemembranen å løslate flere Exosomes samtidig. Den viktigste funksjonen til disse blemmer er transport av informasjon mellom celler3. For dette formålet, cargos som RNA, DNA, og proteiner er aktivt sortert inn i dem. EV ‘ r kan formidle en rekke effekter på sine mål, med implikasjoner for både helse og sykdom tilstand. På den ene siden, de megle positive effekter som vev gjenfødelse, antigenpresentasjon, eller antibiotika effekter, noe som gjør dem lovende mål for sin utvikling somlegemiddel,5. På den andre siden kan EV-er fremme tumor endometrial blodkar6, indusere tilskuer effekter i stress respons7, og kan spille en rolle i autoimmune sykdommer8 og inflammatoriske sykdommer9. Dermed kan de være en viktig komponent til en bedre forståelse av mange patologiske effekter. Men tilstedeværelsen av endrede EV ‘ i manifold sykdommer, slik som kreft10,11,12 og kardiovaskulære lidelser13, og deres lett tilgjengelighet i blod og urin gjør dem ideelle biomarkører. Endelig har deres gode biokompatibilitet14 og deres iboende målretting evne til å gjøre EV ‘ er også interessant for legemiddellevering15. I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll for evalueringen av lagrings stabiliteten til EV-er avledet fra pattedyrceller, en viktig egenskap som fortsatt er lite undersøkt.

For den kliniske utviklingen av EV ‘ r er det fortsatt mange hindringer for overvinne16, inkludert evaluering av deres terapeutiske effekter, produksjon, rensing og lagring17. Mens-80 ° c er allment sett på som gullstandarden for EV lagring18, de nødvendige frysere er dyre, og opprettholde den nødvendige kjølekjeden fra produksjon til pasienten kan være utfordrende. Videre tyder enkelte rapporter på at lagring på-80 ° c fortsatt ikke optimalt bevarer EV ‘ er og medfører et tap i EV-funksjonalitet19,20. Andre metoder, for eksempel frysetørking21,22 eller spray-tørking23, har blitt foreslått som potensielle alternativer til den frosne lagring av EV ‘ r.

Den optimale måten å vurdere lagrings stabilitet på vil være å teste EV ‘ r i funksjonelle analyser eller ved evalueringen av en bestemt markør, for eksempel deres antibakterielle aktivitet19. Dette er mulig når den ønskede effekten av blemmer er kjent og når en bestemt gruppe av EV ‘ r skal studert. Hvis EV-er fra forskjellige celle kilder skal sammenlignes (f.eks. for legemiddel innkapsling) eller hvis det ikke finnes noen kjent funksjonell avlesning, er det ikke lenger mulig å vurdere endringer på grunn av lagring på en direkte måte.

På den annen side, bare evaluere endringer i sine fysikalsk parametere, for eksempel størrelse, partikkel utvinning, og proteinkonsentrasjon, ikke alltid forutsi endringer i EV aktivitet, som har vært vist i en fersk patent20.

Her gir vi en lett anvendelig protokoll for å måle lagrings stabiliteten til EV ‘ r ved å vurdere deres fysikalsk parametre kombinert med aktiviteten til et innkapslet beta-glucuronidase enzym som et surrogat for lasten av EV ‘ r. Lastingen av enzymet gjøres ved saponin inkubasjons, en mild metode etablert med EV ‘ r fra ulike kilder21,24,25. Saponin danner forbigående porer i EV-membranen, som gjør det mulig å bruke enzym opptak i vesicle. Ettersom enzymer er tilbøyelige til å miste sin aktivitet hvis de utsettes for ugunstige lagringsforhold, er de et ideelt surrogat for evalueringen av bevaring av funksjonelle laster av EV ‘ r.

Vi har vist at anvendelsen av denne protokollen til EV ‘ r avledet fra menneskelige Mesenchymal stamceller (MSCs), menneskelig navle vene endothelial celler (HUVECs), og menneskelige adenokarsinom alveolære epitelceller (A549) faktisk føre til store forskjeller i lagrings stabilitet mellom ulike cellelinjer, som bør tas i betraktning når du velger EV kilde21.

Protocol

1. cellekultur og produksjon av celle-conditioned medium Vanligvis dyrke celler under de enkelte forholdene som kreves for den respektive cellelinje. Dyrke cellene for 24-72 h i serum-frie forhold eller i medium inneholder EV-utarmet fosterets storfe serum (FBS).Merk: Hvis EV-utarmet FBS brukes, bør du bruke en metode som er bevist for å effektivt tømme serum, for å hindre forurensning med blod serum avledede EV.26. Samle mediet fra flaskene. Sentrifuger på 3…

Representative Results

Figur 1 viser lagringsegenskapene til EV ‘ er isolert fra HUVECs. EV ‘ r ble isolert av UC, glucuronidase var innkapslet, og etter SEC ble renset EV ‘ r evaluert for sine fysikalsk egenskaper av NTA. En prøve av blemmer ble senere utsatt for AF4 rensing og glucuronidase aktiviteten ble målt. De blemmer ble deretter lagret i 7 d ved 4 ° c eller-80 ° c og ved 4 ° c i lyofilisert form, i sistnevnte tilfelle med tillegg av 4% trehalose. Etter lagring ble blemmer igjen målt v…

Discussion

I dette manuskriptet presenterer vi en omfattende protokoll for å studere stabiliteten til EV ‘ r under forskjellige Oppbevaringsbetingelser. Med kombinasjonen av innkapslet glucuronidase som en funksjonell avlesning og evalueringen av de fysikalsk parametrene til EV ‘ r, tillater protokollen en enkel lagring stabilitets evaluering av EV ‘ r og sammenligningen av EV ‘ r fra forskjellige celle Linjer. SEM og TEM som komplementære metoder gir innsikt i endringer av EV ‘ r på enkelt partikkel nivå. Resultatene som ble p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Den NanoMatFutur Junior Research program fra Federal Ministry of Education and Research, Tyskland (Grant nummer 13XP5029A) støttet dette arbeidet. Maximilian Richter ble støttet av Studienstiftung des Deutschen Volkes (German Academic Scholarship Foundation) gjennom et doktorgrads fellesskap.

Materials

1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) Sigma-Aldrich P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) Sigma-Aldrich P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks Corning 431082 Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane Wyatt Technology Europe 1854
350 µm spacer Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase Sigma-Aldrich G7646-100KU
Chloroform Fisher scientific C/4966/17
Column oven Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector  Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm Merck VVLP04700 Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3156 Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec Wyatt Technology Europe
EGM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3162 Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers R&D Systems DY992 used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol Fisher scientific E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block Avanti Polar Lipids 610000-1EA
Filter support Avanti Polar Lipids 610014-1EA used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide Thermo Fisher Scientific F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36 Thermo Fisher Scientific 18912014
Hettich Universal 320 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells Lonza Verviers, S.p.r. C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM Kimble 420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR international 525-0255 the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1 Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes Whatman/GE Healthcare 110406 used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate Sigma-Aldrich 79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation Beckman Coulter 355622
QuantiPro BCA Assay Kit Sigma-Aldrich QPBCA-1KT
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b GE Healthcare 17014001
SEM copper grids with carbon film Plano S160-4
Small AF4 channel Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor Beckman Coulter 339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K Beckman Coulter
UV detector Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter Whatman/GE Healthcare 10401712 Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

References

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).
  2. Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
  3. Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
  4. György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
  5. Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
  6. Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
  7. Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
  9. Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
  10. Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
  11. Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
  12. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  13. Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
  14. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
  15. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).
  16. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  17. Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
  18. Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
  19. Lőrincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
  20. Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , (2016).
  21. Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
  22. Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
  23. Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
  24. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  25. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
  26. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  27. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
  28. Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
  29. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
  30. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  31. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
  32. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  33. Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
  34. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
  35. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  36. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
  37. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).

Play Video

Cite This Article
Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, G. Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (147), e59584, doi:10.3791/59584 (2019).

View Video