Her presenterer vi en lett anvendelig protokoll for å vurdere lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer, en gruppe av naturlig forekommende nanopartikler produsert av celler. Den blemmer er lastet med glucuronidase som en modell enzym og lagres under ulike forhold. Etter lagring evalueres deres fysikalsk parametre og aktiviteten til det innkapslet enzymet.
Ekstracellulære blemmer (EV) er lovende mål i dagens forskning, som skal brukes som narkotika, narkotika-bærere, og biomarkører. For deres klinisk utvikling, ikke bare deres farmasøytiske aktivitet er viktig, men også deres produksjon må vurderes. I denne sammenhengen fokuserer forskningen på isolering av EV-er, deres karakterisering og deres lagring. Det nåværende manuskriptet tar sikte på å gi en facile prosedyre for vurdering av effekten av ulike lagringsforhold på EV ‘ r, uten genetisk manipulasjon eller spesifikke funksjonelle analyser. Dette gjør det mulig å raskt få et første inntrykk av stabiliteten til EV ‘ r under en gitt oppbevarings tilstand, og EV ‘ er avledet fra forskjellige celle kilder kan sammenlignes lett. Stabilitets målingen er basert på de fysikalsk parametrene til EV ‘ r (størrelse, partikkel konsentrasjon og morfologi) og bevaring av aktiviteten til lasten. Sistnevnte er vurdert av saponin-mediert innkapsling av enzymet beta-glucuronidase i EV ‘ r. Glucuronidase fungerer som et surrogat og gir en enkel kvantifisering via kløften av et fluorescerende reporter molekyl. Den nåværende protokollen kan være et verktøy for forskere i jakten på lagringsforhold som optimalt beholde EV egenskaper for å fremme EV forskning mot klinisk anvendelse.
EV ‘ r er membran bundne nanopartikler produsert av nesten alle celletyper. For pattedyrceller kan EV ‘ r deles inn i to hovedgrupper med forskjellige produksjons veier1,2. Membran blemmer, med en størrelse varierer fra cirka 100-1000 NM, produseres av direkte spirende fra cellemembranen. Exosomes, størrelse 30-200 NM, er avledet fra multivesicular organer dannet av innover spirende inn endosomes som senere sikring med cellemembranen å løslate flere Exosomes samtidig. Den viktigste funksjonen til disse blemmer er transport av informasjon mellom celler3. For dette formålet, cargos som RNA, DNA, og proteiner er aktivt sortert inn i dem. EV ‘ r kan formidle en rekke effekter på sine mål, med implikasjoner for både helse og sykdom tilstand. På den ene siden, de megle positive effekter som vev gjenfødelse, antigenpresentasjon, eller antibiotika effekter, noe som gjør dem lovende mål for sin utvikling somlegemiddel,5. På den andre siden kan EV-er fremme tumor endometrial blodkar6, indusere tilskuer effekter i stress respons7, og kan spille en rolle i autoimmune sykdommer8 og inflammatoriske sykdommer9. Dermed kan de være en viktig komponent til en bedre forståelse av mange patologiske effekter. Men tilstedeværelsen av endrede EV ‘ i manifold sykdommer, slik som kreft10,11,12 og kardiovaskulære lidelser13, og deres lett tilgjengelighet i blod og urin gjør dem ideelle biomarkører. Endelig har deres gode biokompatibilitet14 og deres iboende målretting evne til å gjøre EV ‘ er også interessant for legemiddellevering15. I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll for evalueringen av lagrings stabiliteten til EV-er avledet fra pattedyrceller, en viktig egenskap som fortsatt er lite undersøkt.
For den kliniske utviklingen av EV ‘ r er det fortsatt mange hindringer for overvinne16, inkludert evaluering av deres terapeutiske effekter, produksjon, rensing og lagring17. Mens-80 ° c er allment sett på som gullstandarden for EV lagring18, de nødvendige frysere er dyre, og opprettholde den nødvendige kjølekjeden fra produksjon til pasienten kan være utfordrende. Videre tyder enkelte rapporter på at lagring på-80 ° c fortsatt ikke optimalt bevarer EV ‘ er og medfører et tap i EV-funksjonalitet19,20. Andre metoder, for eksempel frysetørking21,22 eller spray-tørking23, har blitt foreslått som potensielle alternativer til den frosne lagring av EV ‘ r.
Den optimale måten å vurdere lagrings stabilitet på vil være å teste EV ‘ r i funksjonelle analyser eller ved evalueringen av en bestemt markør, for eksempel deres antibakterielle aktivitet19. Dette er mulig når den ønskede effekten av blemmer er kjent og når en bestemt gruppe av EV ‘ r skal studert. Hvis EV-er fra forskjellige celle kilder skal sammenlignes (f.eks. for legemiddel innkapsling) eller hvis det ikke finnes noen kjent funksjonell avlesning, er det ikke lenger mulig å vurdere endringer på grunn av lagring på en direkte måte.
På den annen side, bare evaluere endringer i sine fysikalsk parametere, for eksempel størrelse, partikkel utvinning, og proteinkonsentrasjon, ikke alltid forutsi endringer i EV aktivitet, som har vært vist i en fersk patent20.
Her gir vi en lett anvendelig protokoll for å måle lagrings stabiliteten til EV ‘ r ved å vurdere deres fysikalsk parametre kombinert med aktiviteten til et innkapslet beta-glucuronidase enzym som et surrogat for lasten av EV ‘ r. Lastingen av enzymet gjøres ved saponin inkubasjons, en mild metode etablert med EV ‘ r fra ulike kilder21,24,25. Saponin danner forbigående porer i EV-membranen, som gjør det mulig å bruke enzym opptak i vesicle. Ettersom enzymer er tilbøyelige til å miste sin aktivitet hvis de utsettes for ugunstige lagringsforhold, er de et ideelt surrogat for evalueringen av bevaring av funksjonelle laster av EV ‘ r.
Vi har vist at anvendelsen av denne protokollen til EV ‘ r avledet fra menneskelige Mesenchymal stamceller (MSCs), menneskelig navle vene endothelial celler (HUVECs), og menneskelige adenokarsinom alveolære epitelceller (A549) faktisk føre til store forskjeller i lagrings stabilitet mellom ulike cellelinjer, som bør tas i betraktning når du velger EV kilde21.
I dette manuskriptet presenterer vi en omfattende protokoll for å studere stabiliteten til EV ‘ r under forskjellige Oppbevaringsbetingelser. Med kombinasjonen av innkapslet glucuronidase som en funksjonell avlesning og evalueringen av de fysikalsk parametrene til EV ‘ r, tillater protokollen en enkel lagring stabilitets evaluering av EV ‘ r og sammenligningen av EV ‘ r fra forskjellige celle Linjer. SEM og TEM som komplementære metoder gir innsikt i endringer av EV ‘ r på enkelt partikkel nivå. Resultatene som ble p…
The authors have nothing to disclose.
Den NanoMatFutur Junior Research program fra Federal Ministry of Education and Research, Tyskland (Grant nummer 13XP5029A) støttet dette arbeidet. Maximilian Richter ble støttet av Studienstiftung des Deutschen Volkes (German Academic Scholarship Foundation) gjennom et doktorgrads fellesskap.
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |