Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Оценка стабильности хранения внеклеточного везикулы

Published: May 22, 2019 doi: 10.3791/59584
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Biogenic Nanotherapeutics group (BION), 2Department of Pharmacy, Saarland University

Summary

Здесь мы представляем легко применимый протокол для оценки стабильности хранения внеклеточных пузырьков, группы естественных наночастиц, производимых клетками. Пузырьки загружаются с глюкуронидазы в качестве модели фермента и хранятся в различных условиях. После хранения оцениваются их Физикохимические параметры и активность инкапсулированных ферментов.

Abstract

Внеклеточные пузырьки (EV) являются перспективными целями в текущих исследованиях, которые будут использоваться в качестве препаратов, носителей наркотиков и биомаркеров. Для их клинического развития важно не только их фармацевтическая деятельность, но и их производство должно быть оценено. В этом контексте исследования сфокусированы на изолированности электромобилей, их характеризации и хранении. Цель данной рукописи заключается в обеспечении поверхностной процедуры оценки влияния различных условий хранения на ЕДС без генетической манипуляции или специфических функциональных анализов. Это дает возможность быстро получить первое впечатление о стабильности электромобилей в условиях данного хранилища, а у электромобилей, полученных из разных источников, можно легко сравнить. Измерение устойчивости основано на физикохимических параметрах (размер, концентрация частиц и морфология) и сохранении активности их груза. Последний оценивается сапонин-опосредованной инкапсуляции фермента бета-глюкуронидазы в EV. Глюкуронидазы выступает в качестве суррогатной и позволяет легко квантификации через расщепление флуоресцентной молекулы репортера. Настоящий Протокол может быть инструментом для исследователей в поисках условий хранения, которые оптимально сохраняют свойства EV для продвижения исследований EV к клиническому применению.

Introduction

EV-мембранные наночастицы, производимые почти всеми типами клеток. Для клеток млекопитающих, EV может подразделяться на две основные группы с отдельными производственными путями1,2. Мембранные пузырьки, с размером диапазоне от примерно 100-1000 Нм, производятся прямым отпочковываясь от клеточной мембраны. Exosomes, размером 30-200 Нм, являются производными от мультивезикулярных органов формируется внутрь почек в эндосомы, которые впоследствии сливаются с клеточной мембраны выпустить несколько Exosomes одновременно. Основной функцией этих пузырьков является транспортировка информации между клетками3. С этой целью грузы, такие как РНК, ДНК и белки, активно сортируются по ним. EV может передавать различные эффекты на их цели, что имеет последствия как для здоровья, так и для состояния болезни. С одной стороны, они опосредуют положительные эффекты, такие как регенерация тканей, Презентация антигена, или антибиотик эффекты, что делает их благоприятные цели для их развития, как терапевтика4,5. С другой стороны, электромобилей может способствовать васкуляризация опухоли6, индуцировать свидетеля эффекты в стрессовой реакции7, и может играть роль в аутоиммунных заболеваний8 и воспалительных заболеваний9. Таким образом, они могут быть ключевым компонентом для лучшего понимания многих патологических эффектов. Тем не менее, наличие измененных электромобилей в многочисленных заболеваний, таких как рак10,11,12 и сердечно-сосудистые расстройства13, и их легкая доступность в крови и моче делает их идеальными Биомаркеров. Наконец, их хорошая биосовместимость14 и их неотъемлемое целевое умение делают электромобилей также интересными для доставки лекарственных препаратов15. В этой рукописи мы описываем протокол для оценки стабильности хранения электромобилей, полученных из клеток млекопитающих, что является важным свойством, которое до сих пор мало исследовано.

Для клинического развития электромобилей, есть еще много препятствий, чтобы преодолеть16, в том числе оценки их терапевтического эффекта, производство, очистка, и хранение17. В то время как-80 ° c широко рассматривается как золотой стандарт для хранения EV18, необходимые морозильные камеры стоят дорого, и поддержание требуемой холодной цепочки от производства до пациента может быть сложной задачей. Более того, в некоторых отчетах указывается, что хранение при температуре-80 °c по-прежнему не оптимально сохраняет EV и вызывает потерю функциональности EV19,20. Другие методы, такие, как замораживание сушки21,22 или сушки спрей-23, были предложены в качестве потенциальной альтернативы замороженного хранения электромобилей.

Оптимальным способом оценки стабильности хранилища является тестирование электромобилей в функциональном тесте или оценка конкретного маркера, например, их антибактериальная активность19. Это возможно при том, что желаемый эффект пузырьков известен и когда необходимо изучить одну отдельную группу электромобилей. Если сравнивать EV из различных клеточных источников (например, для инкапсуляции лекарственных средств) или если нет какого-либо известного функционального считывания, то уже невозможно оценить изменения, которые были связаны с хранением данных в прямом порядке.

С другой стороны, просто оценка изменений в их физикохимических параметров, таких как размер, восстановление частиц, и концентрация белка, не всегда предсказывают изменения в активности EV, как это было показано в недавнем патенте20.

Здесь мы предоставляем легко применимый протокол для измерения стабильности хранения электромобилей путем оценки их физикохимических параметров в сочетании с активностью инкапсулированного фермента бета глюкуронидазы в качестве суррогата для груза электромобилей. Загрузка фермента осуществляется инкубацией сапонина, мягким методом, установленным с ЕДС из разных источников21,24,25. Сапонин образует переходные поры в мембране EV, что позволяет поглощение фермента в везикул. Поскольку ферменты подвержены потере активности при неблагоприятных условиях хранения, они являются идеальным суррогатом для оценки сохранности функциональных грузов электромобилей.

Мы показали, что применение этого протокола к электромобилей, полученных из человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК), человеческих пупочных клеток эндотелия Вены (HUVECs), и человеческий аденокарцинома альвеолярных эпителиоцитов (A549) действительно приводят к большим различиям в стабильность хранения между различными линиями клеток, которые должны быть приняты во внимание при выборе источника EV21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клетки и продукция клетки-подготовленное средство

  1. Как правило, культивировать клетки в соответствии с индивидуальными условиями, необходимыми для соответствующей клеточной линии.
  2. Культивируйте клетки для 24-72 h в сыворотке-свободно условиях или в средстве содержа EV-обедненного фетальной сыворотке говядины (ФПС).
    Примечание: Если используется EV-обедненный ФПС, использовать метод доказано эффективно истощают сыворотки, чтобы предотвратить заражение с бычьей сыворотки, полученных электромобилей26.
  3. Соберите носитель из фляги. Центрифуга на 300 x g в течение 10 минут, чтобы гранулы клеток. Тщательно собирайте среду с ячейкой (СКК), не нарушая при этом клетки, находящиеся в грануете. Предпочтительно использовать СКК напрямую или хранить его на ночь при температуре 4 °C.
    Примечание: всегда предпочтительнее использовать свежепроизведенный СКК. Если хранение в течение более длительных периодов времени не может быть отменено, все соответствующие параметры должны регистрироваться в соответствии с MISEV2018 руководящими принципами26, а потенциальные предубеждения полученных результатов должны приниматься во внимание.
  4. Пример протокола для HUVECs
    1. Культивировать HUVEC клетки для 120 h в EGM-2 среды, содержащей ФПС и другие добавки.
    2. Культивировать HUVEC клетки для 48 h в EBM-2 базальной среде без каких-либо дополнительных добавок.
    3. Соберите средство из колб и выполните центрифугирования шаг, как указано выше (шаг 1,3). Как правило, использовать 100 мл среднего для одного EV-изоляция.

2. ультраконсервативная СКК

  1. Непосредственно перед ультраклеифугацией (UC), центрифуга СКК для 15 мин при 3 000 x g и 4 °c для удаления клеточного мусора и крупных агломератов.
  2. Аккуратно перенесите супернатант в трубы UC. При использовании фиксированного угла ротора, отметьте ориентацию труб в центрифуге для облегчения извлечения гранул EV после UC. Центрифуга для 2 ч на 120 000 х г, с k-фактором 259,4.
  3. После UC, осторожно Выбросьте супернатант с помощью серологического Pipet, чтобы избежать нарушения опепелений электромобилей.
    Примечание: гранулы могут быть невидимыми.
  4. Добавить 200 мкл 0,2 мкм-отфильтрованный фосфат-буферизованные физиологический раствор (PBS) в первую трубку и использовать PBS и остаточный супернатант для ресуспензируем гранул по пипетки вверх и вниз. Перенесите полученную подвеску EV в следующую трубку соответствующего образца и используйте ее для ресуспендирования. Продолжайте этот путь, чтобы ресуспензируем все EV образца в окончательном томе приблизительно 300-350 мкл.
  5. После ресуспендирования подтвердите наличие частиц путем отслеживания анализа наночастицы (ЗТК). Используйте параметры, оптимизированные для данного типа EV, такие как параметры ниже (Step 2.5.1).
    Примечание: документы Гардинер и др.27 и вестад et al.28 содержат ценную информацию о том, как оптимизировать параметры для измерения электромобилей.
    1. Для воспроизведения описанных ниже результатов используйте инструменты (например, Наноприцел LM14), оснащенные зеленым лазером. Запишите три видео 30-х с экрана усиления 1,0 и камеры уровня 13. Для анализа используйте увеличение экрана 1,0 и порог обнаружения 5.
  6. Используйте гранулы немедленно, если это возможно; в противном случае храните его при температуре 4 °C в одночасье.

3. в EV Инкапсуляция глюкуронидаза

  1. К ресуспендирован гранулы, добавить бета-глюкуронидазы (10 мг/мл в PBS) до конечной концентрации 1,5 мг/мл и сапонин (10 мг/мл в H2O) до конечной концентрации 0,1 мг/мл. Хорошо перемешать по потряхивая для 3 с.
  2. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре с внутрилегонько смешивания, осторожно стряхивая трубку. После инкубации, непосредственно очищают по размеру-исключение хроматографии (SEC) (см. раздел 5).
    Примечание: не следует замораживать образцы глюкуронидазы после оттаивания, чтобы предотвратить деградацию фермента из-за замораживания.

4. липосоме производства

  1. Для подготовки липосомы для сравнения с ЕДС, растворить 1, 2-димиристойил-СН-Г3-фосфолихолин (ДМПК) и 1, 2-дипальмитойл-СН-ггпо-3-ФОСФОЛИХОЛИН (dppc) в 2:3 молярной рацион в хлороформе до конечной концентрации 5 мм. Подготовьте 1 мл aliquототы в высокоисполнении жидких хроматографии (HPLC) флаконов и дайте им высохнуть на ночь, чтобы сформировать липидный фильм.
    Осторожно: хлороформ токсичен и подозревается в канцерогенными. Примите правильные меры предосторожности при обработке его.
  2. Увлажняет липидный фильм с 1 мл PBS, содержащей 1,5 мг/мл глюкуронидазы. Нагрейте его до 42 ° c и вихря в течение 1 мин. Нагрейте экструдер-сборку до 42 ° с и выдав липидный суспензию 11X через поликарбонатные мембраны 200 Нм. Непосредственно очистить SEC (см. раздел 5).

5. Очистка от SEC

  1. Подготовьте столбец SEC, используя следующий протокол.
    1. Используйте только свежую очищенную воду и свежеприготовленные буферы. Фильтровать все буферы через мембранный фильтр 0,2 мкм и дегазиовывать их, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в столбце.
    2. Для подготовки столбца SEC используйте матрицу на основе фильтрации геля агарозы (например, sepharose CL-2b) или другую среду SEC, подходящую для разделения электромобилей и липосомов от белковых примесей и избыточного фермента. Во-первых, удалите 20% решение этох среда хранится в, чтобы предотвратить формирование воздушного пузыря в колонке. С этой целью центрифуга SEC средних на 3 000 x g в течение 10 мин, удалите этох, и заменить его дегазированные воды.
    3. Заполните стеклянную колонну (с внутренним диаметром 10 мм) со средним SEC до отметки 15 мл.
      Примечание: объемы будут отличаться для столбцов с различными размерами. Убедитесь в том, чтобы гель урегулировать полностью.
    4. Перед тем как запустить, устанавливаются колонке, по крайней мере два столбца объемы PBS. Чтобы сохранить столбец, сначала промойте его одним столбца объемом воды, а затем по крайней мере два столбца томов 20% Этон. После хранения, мыть колонки сначала с одним объемом колонки воды до equilibrating с PBS.
    5. Используйте до 400 мкл EV или Липосома подвески в одном отделении. Соберите фракции 1 мл. После SEC, либо хранить очищенный EV (см. раздел 7) или при условии их глюкуронидазы анализа (см. раздел 6).
  2. Подтверждают разделение электромобилей и липосомы от загрязняющих белков и свободных глюкуронидазы. С этой целью коррелируют концентрации частиц собранных фракций с концентрацией белка и глюкуронидазы активности.
    1. Оценка концентрации частиц в ЗТК (см. 2,5)
    2. Оценить содержание белка по биинсулиновой кислоты (ДСС) анализ или другой подходящий белок анализа количественной оценки. Выполните анализ в соответствии с протоколом производителя.
    3. Оценить активность глюкуронидазы с помощью анализа глюкуронидазы (см. раздел 6).
  3. По желанию, оцените морфологию EV путем просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) и сканирующей электронной микроскопии (РЭМ).
    1. Для подготовки образцов ТЕА добавьте 10 мкл суспензии EV в сетку ТЕА, Инкубируйте в течение 10 минут, а затем промокните лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги. Выполните фиксацию в течение 10 минут с 10 мкл 4% параформальдегида и пятно от любого избытка. Промыть 3x водой. Окрашивает пузырьки на 20-е годы инкубацией с 30 мкл 1% гидрата фосфорили-вольфстических кислот. После промокательной от избыточного, сухие везикулы на ночь. Визуализация по ТЕА.
      Осторожно: фосфорно-тунностическая кислота очень едкая; Таким образом, защищают кожу и глаза.
    2. Для Рэм, исправить ранее подготовленные образцы ТЕА на углеродных дисках и распыленную их с 50 Нм толстым слоем золота. Визуализация с помощью Сэм.

6. глюкуронидазы анализ

  1. Чтобы позволить сравнение между различными образцами и условиями хранения путем корреляции числа частиц и активности фермента, сначала измерить концентрацию частиц образца по ЗТК (см. шаг 2,5).
  2. Подготовить рабочее решение флуорессеин ди-b-D-глюкуронида путем добавления 1 мкл соединения (10 мг/мл в H2O) до 199 мкл PBS. Добавьте 25 мкл этого решения 125 мкл очищенных электромобилей, чтобы получить окончательную концентрацию 8,3 мкг/мл. Pipet образца в черном 96-хорошо пластины. Измерение точки времени 0 ч с читателем пластины, используя 480 Нм, как возбуждение и 516 Нм, как излучение длины волны.
  3. Плотно накройте пластину (например, прозрачной пластиковой фольгой, используемой для использования пластин), чтобы минимизировать испарение и инкубировать в темноте 18 ч при температуре 37 °C. Измерьте производство флюорессеин с помощью параметров считывателя плит, перечисленных в шаге 6,2.

7. хранение электромобилей и липосомы

Примечание: для всех целей хранения целесообразно использовать низкосвязные трубы для уменьшения потерь EV из-за адсорбции.

  1. Выполните следующие параметры этого раздела, чтобы воспроизвести приведенные ниже результаты репрезентативного. Используйте образцы, состоящие из 400 мкл подвески EV.
    1. Храните при температуре 4 °C или-80 ° c или переходите к шагам, перечисленным ниже.
    2. Лиофилизировать электромобилей.
      1. Добавьте trehalose (40 mg/mL в H2O) до окончательной концентрации 4 мг/мл до очищенных электромобилей. Замораживание образцов при-80 ° c, по крайней мере 1 ч.
      2. Лиофилизировать образцы, используя следующие параметры. Для основной сушки установите температуру шельфа до 15 °C и давление до 0,180 mbar и оставьте образцы для просушки на 46 ч. Для окончательного сушки установите температуру полки до 25 °C и давление до 0,0035 mbar и оставьте образцы для просушки на 2 ч. Храните лиофилизированные пробы при температуре 4 °C.
      3. Для увлажнения образцов добавьте H2O, равный количеству СУСПЕНЗИИ EV, присутствующих в начале (обычно, 400 мкл). Не используйте буфер для регидратации.

8. анализ после хранения

  1. Чтобы оценить активность фермента, сначала удалите свободную глюкуронидазу, которая, возможно, просочилась из электромобилей во время хранения. Достижение этого путем дополнительного этапа очистки, который осуществляется либо SEC (см. шаг 5) или асимметричный поток полевая фракционирование потока (AF4) (см. шаг 8.1.2).
    Примечание: пожалуйста, имейте в виду, что оба метода приводят к разбавления образца EV; Таким образом, используйте достаточные концентрации EV перед хранением, чтобы избежать перехода ниже предела кванта. Ожидайте 1:10 разбавления частиц из-за SEC или AF4.
    1. Для очистки SEC следуйте описанным выше протоколу (см. раздел 5).
    2. Выполните очистку AF4.
      1. Настройка прибора с помощью небольшого канала с 350 мкм прокладки и 30 КД молекулярной весовой мембраны целлюлозы. Поместите фильтр размера поры 0,1 мкм между насосом HPLC и каналом AF4. Использование свежеприготовленных 0,1 мкм-фильтруется PBS в качестве мобильной фазы для уменьшения нагрузки частиц и шума в Светорассеивающая детекторов.
      2. Обнаружение белков с помощью УФ-детектора, установленного на 280 Нм. Для обнаружения частиц используйте Многоугольный рассеяние света с лазерным набором до 658 Нм.
      3. Используйте следующий метод запуска. Предварительное Фокусируйтесь на 1 мин с фокусом потока 1 мл/мин; затем впрыснуть 300 мкл образца в размере 0,2 мл/мин и сохранить фокус потока в течение 10 мин. После инъекции, при применении поперечных потоков, которые уменьшаются с 2 мл/мин до 0,1 мл/мин в течение 8 мин. элюировать в течение еще 10 мин без поперечных потоков. Соберите доли 1 мл, начиная после 12,5 мин и продолжается до 27 мин.
    3. Выполните анализ глюкуронидазы, описанный выше (см. раздел 6).
  2. Чтобы оценить размер и концентрацию, используйте ЗТК, как описано выше (см. шаг 2,5).
  3. По желанию выполняйте ТЕА и Рэм для оценки морфологии электромобилей после хранения (см. 5,3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 отображаются характеристики хранилища электромобилей, изолированные от huvecs. Электромобилей были изолированы от UC, глюкуронидаза был инкапсулирован, и после SEC, очищенных электромобилей были оценены по их физикохимических свойств ЗТК. Затем образец пузырьков был подвергнут очистке AF4 и была измерена активность глюкуронидазы.

Пузырьки затем хранились в течение 7 г при температуре 4 ° c или-80 ° с и при 4 ° с в лиофилизированную форму, в последнем случае с добавлением 4% trehalose. После хранения пузырьки снова измерялись ЗТК, а после AF4 года оценивалась оставшаяся активность глюкуронидазы на частицу.

Принцип работы AF4 основан на комбинации ламинарного потока и ортогонального скрещивание через пористую мембрану в нижней части канала AF4, которая различно воздействует на частицы в зависимости от их размера (рис. 2). Большие частицы, как правило, расположены ближе к мембране, в то время как меньшие частицы расположены дальше в канале. Из-за параболического профиля потока ламинара, частицы дальше от мембраны путешествуют быстрее к детектору, приводя к частице-разделению по размеру. В типичном эксперименте AF4, впрыснуто частицы сперва сфокусированы на мембране, путем прикладывать Поперечный поток без продольного течения через канал (Рисунок 2a). После инъекции и фокусировки, эруция начинается с одновременного применения поперечных потоков и продольного потока к фракционировать и елют различные подмножества частиц (рис. 2B), которые, в нашем случае, были эВ и свободными глюкуронидазы.

Рисунок 3 иллюстрирует разделение наночастиц (EV или липосомы) из загрязняющих белков и неинкапсулированных глюкуронидазы. Профиль эруции SEC липосомы (рис. 3а) очищенный после их подготовки (см. раздел 4 протокола) показал разделение частиц с инкапсулированной глюкуронидазы из свободного фермента, обнаружены как через анализ ДСС и активности фермента. В настоящем примере фракция 6 и 7 будет выбрана для дальнейших экспериментов, поскольку они содержат самые высокие концентрации частиц и предотвращают возможное контаминицию с бесплатным глюкуронидазы. AF4 также успешно отделяя EV от бесплатного глюкуронидазы, как показано на рисунке 3B, с более высокой степенью разделения, чем sec, делая загрязнение фракций, содержащих везикулы менее вероятным.

На рисунке 4был выполнен контрольный эксперимент для обеспечения того, чтобы активность фермента, измеряемая для пузырьков, действительно была связана с инкапсуляции глюкуронидазы в ЕДС и не была вызвана агрегатами ферментов. Эти агрегаты могли быть сформированы из-за инкубации глюкуронидазы с сапонин и привести к ложным положительным результатам. Для проверки фракций, где пузырьки будут эмуты, очищенные ЕДС без инкапсулированной глюкуронидазы были подвергнуты SEC на той же колонке, что и образец, содержащий только сапонин и фермент.

Когда глюкуронидазы инкубировали с сапонин и впоследствии очищали от SEC, не было обнаружено активности фермента в фракциях, обычно содержащих EV. В то время как небольшое количество частиц были обнаружены в элюировать в то же время, как электромобилей (что составляет < 0,1% частиц оправился от типичных гранул EV), не было корреляции фермента активности. Эти результаты показывают, что активный фермент, восстановленный в фракциях, содержащих пузырьки, был инкапсулирован в них.

На рисунке 5 сравнивается восстановление активного фермента после хранения с или без дополнительной очистки AF4 для удаления неинкапсулированной краски. С AF4 очистки, как правило, более низкое восстановление фермента на одну частицу, с наибольшим эффектом для хранения при температуре 4 ° c, где восстановление снижается на две трети. Таким образом, опуская этот дополнительный шаг очищения может привести к неправильным предположениям о стабильности фермента.

На рисунке 6 показан эффект лиофилизации без крикопротекторов на пузырьки, получаемые из ММСК, A549 клеток и липосомов, по сравнению с замораживанием при температуре-80 ° c. Частицы были запечатлена ТЕА и Рэм, как описано выше (см. шаг 5,3 протокола). ММСК и A549 EV не проявляют больших различий в форме в изображениях ТЕА, сравнивая два условия хранения. Однако в картинах МДж в лиофилизированных образцах отображаются агрегаты, не найденные в образцах-80 ° c. Липосомы также отображается агрегаты в МДж изображение, в то время как в ТЕА, лизиофилизация, как представляется, вызывают увеличение размера липосом. Лиофилизация без криопротекторов также уменьшила восстановление неповрежденной глюкуронидазы после хранения (рис. 7). Добавление trehalose как крикопротектор увеличил восстановление активного фермента в дозозависимые образом.

Рисунок 8 демонстрирует преобразование флуорессеин ди-А-д-глюкуронида в свободный флуоресцеин, который проходит в пробирку глюкуронидаза. В то время как образование было нефлуоресцентным на 516 Нм, флуоресцеин очень флуоресцентный на этой длине волны. Это позволило простой анализ активности фермента с высокой чувствительностью.

Figure 1
Рисунок 1 : Стабильность хранения HUVEC EV. A) рекуперации частиц по сравнению с до хранения,b) среднего размера, и (с) действие нормализованной глюкуронидазы на частицу электромобилей, изолированных от huvecs. Пузырьки хранились в течение 7 г при температуре 4 °C и-80 ° с и при 4 °C после лиофилизации с 4% Трегалоза. Средние размеры и рекуперации частиц были измерены ЗТК; деятельность глюкуронидазы на одну частицу была рассчитана на объединение данных ЗТК и результатов анализа глюкуронидазы и нормализованных до их хранения. Среднее ± SD, n = 3, *p < 0,05 (в одну сторону Анова следуют после специального теста tukey). Изменено с Франка et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Принцип работы AF4. (A) EV и Free глюкуронидазы фокусировались после инъекции, применяя попереционное течение. (B) после этого, ЕДС и свободный фермент ускольтаются отдельно, комбинируя поток через канал с перекрестным потоком. Изменено с Франка et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Разделение электромобилей и липосомы от бесплатного глюкуронидазы. (A) представитель sec отделение глюкуронидазы нагруженные липосомы, бесплатно глюкуронидазы, и белка загрязняющих веществ. На графике отображается концентрация частиц (красная), концентрация белка (синий) и глюкуронидазы (зеленый). B) демонстрация разделения электромобилей от бесплатного глюкуронидазы. Необработанные эВ, EV с шипами 0,05 мг/мл глюкуронидазы, бесплатный глюкуронидазы (0,5 мг/мл), и эВ, нагруженные глюкуронидазы и очищенные SEC (EV глюкуронидазы) вводили и анализировали УФ при рассеянии света 280 Нм и 90 °. Свободный фермент, ускольтанный отдельно от электромобилей. Изменено с Франка et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Контрольные эксперименты по очистке электромобилей от бесплатного глюкуронидазы. 400 мкл родных электромобилей или 400 мкл 1,5 мг/мл глюкуронидазы в инкубациях PBS в инкубировали 10 мин с 0,1 мг/мл сапонина были очищены с помощью SEC.a) концентрации частиц собранных фракций пузырьков и глюкуронидазы, соответственно, и энзимную активность очищенный глюкуронидазы. (B) УФ-поглощения в 280 Нм измеряется в том же эксперименте. Первый небольшой пик глюкуронидазы соответствует серой линии в панели а. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Эффект дополнительных этапов очистки после хранения EV. Остальная активность глюкуронидазы на частицу по сравнению с D0 с или без дополнительных AF4 этап очистки после хранения. HUVEC EV хранились в течение 7 d при температуре 4 °C или-80 ° с и лиофилизированный с 4% trehalose. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : ТЕА и Рэм фотографии электромобилей. ТЕА и Рэм фотографии электромобилей из (а) МСК и (б) A549 клеток и (с) липосомы. Образцы хранились для 14 d при-80 ° c или лиофилизированный без добавления trehalose. Стрелки указывают на наличие морфологически измененных частиц в ТЕА фотографии и агрегаты в Рэм фотографии. Изменено с Франка et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Эффект Трегалоза на восстановление фермента после лиофилизации. Сравнение активности фермента после лиофилизации в течение 14 дней, с 0%, 1% и 4% Трегалоза с образцом перед хранением (0 дней). Изменено с Франка et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8 : Ферментативное расщепление флуорессеин ди-в-д-глюкурониде по глюкуронидазы. В схеме поясняется реакция, лежащая в основе обнаружения глюкуронидазы. Флуоресцентный флуорессеин ди-а-д-глюкуронид Расщепляем глюкуронидазы. Через удаление остатков сахара, флуоресцеин восстанавливает свои люминесцентные свойства. Люминесцентное измерение после инкубационного периода коррелирует с количеством активного настоящего фермента и является считывание анализа глюкуронидазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой рукописи мы представляем всеобъемлющий протокол для изучения стабильности электромобилей при различных условиях хранения. При сочетании инкапсулированной глюкуронидазы в качестве функционального считывания и оценки физикохимических параметров электромобилей, протокол позволяет для простой оценки стабильности хранения электромобилей и сравнение электромобилей из различных клеточных Линии. Рэм и ТЕА в качестве дополняющих методов позволяют заглянуть в изменения электромобилей на уровне одной частицы. Представленные здесь результаты свидетельствовали о склонности электромобилей и липосомов к агрегированию из-за лизофилизации без крикопротекторов (рис. 6). Однако, это наблюдалось только в экспериментах Рэм. В то время как изображения EM не проводились с образцами, которые были сохранены с trehalose, литература предполагает, что этот крикопротектор может действительно уменьшить агрегацию электромобилей29. Также можно оценить, если данное состояние хранилища различно влияет на размер EV, скорость восстановления и инкапсулированные молекулы. Примером такого эффекта являются результаты, полученные для HUVEC EV (рис.1). В то время как восстановление частиц на 4 ° с и-80 ° c было лучше, чем для лиофилизированных образцов, восстановление активных инкапсулированных глюкуронидазы было лучше для лиофилизированных образцов. Лиофилизация электромобилей может быть более благоприятным состоянием хранения, например, при анализе EV биомаркеров, где фокус больше на получение и сохранение нетронутыми груз, а не на нетронутыми пузырьки.

В своей недавней работе по лиофилизации электромобилей22, чарозависталь и др., следуют сопоставимой подход. Что касается физикохимических параметров, они сосредоточились на индексе полидисдисперсной (PDI) и Дзета потенциал, как изменения в Дзета потенциал может коррелировать с уменьшенным коллоидной стабильности. Тем не менее, дзета потенциал не может объяснить только наблюдаемые изменения в стабильности30, который также отражается в их результатах. Они также сравнили содержание белка и РНК в хранимых эВ путем полиакриламида гель электрофорез. Этот метод может очень хорошо указывают существенные изменения в содержании белка или РНК пузырьков. Тем не менее, она требует гораздо большего количества материала, чем метод, представленный здесь. Для оценки эффекта хранения на груз EV, Чароозаваль et al. гетерогенно выразили ферментов и видов ДНК, каждый в своей линии ячейки производителя EV и мониторинг их деятельности и целостности в электромобилей. Однако такое гетерологичные выражения не подходят для сравнирования электромобилей из разных источников, так как для каждой новой клеточной линии требуется значительное количество времени, в то время как простая инкапсуляция, опосредованная сапонин, может быть легко применена.

Очень важно удалить любой Неинкапсулированный фермент, как показано на рисунке 3. EV-инкапсулинидазы реагирует гораздо медленнее с его субстратом, чем свободный фермент в растворе, что приводит к переоценке эффективности инкапсуляции. Чистое разделение особенно важно для анализа после хранения, так как условия хранения могут повлиять на активность свободного глюкуронидазы в образце по-разному и могут привести к утечке из поврежденных электромобилей. Это было очевидно в наших экспериментах (рис. 5), так как применение AF4 до анализа глюкуронидазы удалось удалить краситель, не инкапсулированный в пузырьки. Таким образом, это позволило получить четкие результаты по влиянию методов хранения, обсуждавшихся здесь, в то время как без AF4, потеря активности из-за хранения была бы недооценена.

Еще одним важным аспектом является изоляция и квалификация электромобилей для проверки их стабильности. Хотя описанная методика позволяет сравнивать ЕДС из разных источников, это возможно только в том случае, если все они подготовлены тем же методом изоляции, поэтому результаты не искажаются18,31,32. В этом контексте необходимо также учитывать условия клеточной культуры, поскольку они могут влиять на количество и биоактивность изолированных электромобилей33. Чтобы получить результаты, которые можно сравнить с другими опубликованными результатами, желательно проконсультироваться недавно обновленный "минимальная информация для исследований внеклеточного везикулы", который содержит руководящие принципы для согласования EV исследований26.

В протоколе, представленном здесь, мы использовали SEC или AF4 для удаления свободного фермента после хранения. Другие методы могут быть применены, такие, как градиент ультрафазригации, UC, или ультрафильтрации34. По сравнению с центробежные методы, SEC и AF4 меньше времени (например, примерно 1,5 h для sec, включая состояния столбца против до 16 ч или более для градиента UC), и они могут полностью отделить свободных белков от электромобилей по сравнению с нормальным UC, где всегда остается остаточный супернатант с гранулятом. Кроме того, SEC15 и AF435 являются умеренными методами, которые вызывают меньшее напряжение сдвига на электромобилей. Для сравнения, силы, навязанные электромобилей во время UC может привести к изменениям частиц, таких как агрегация и изменения в размере34,36.

Недостатком SEC и AF4 является разбавление образцов. Таким образом, необходимо изолировать достаточное количество электромобилей для поддержания концентраций, необходимых для измерений ЗТК после многократных этапов очистки. Фракции EV могут быть сконцентрированы с использованием центробежных фильтров, но, в зависимости от материала фильтра и протокола, может быть потеря пузырьков37.

Ограничение протокола обсуждается здесь является то, что он только контролирует активность фермента экзогениально инкапсулированных глюкуронидазы, ни с учетом инкапсулированных РНК и ДНК, ни EV поверхности белков, которые могут быть важны для функциональности18 . Для исследования новой терапии EV, этот метод не может заменить анализы на функциональность, но комплимент их и дать указание о стабильности везикул. Это может иметь большое применение, если, например, полученные из биожидкостей электромобилей должны храниться для последующего анализа их содержания везикулы.

В будущем сфера применения этого протокола может быть расширена, а также включать в себя EV, получаемый из других организмов, например, бактериальных внешних мембранных пузырьков. Другой интересный следующий шаг будет заключаться в проверке инкапсуляции нуклеиновой кислоты путем инкубации сапонин и также заглянуть в устойчивость ДНК или РНК грузов.

В заключение, эта процедура предлагает простой метод для оценки стабильности хранения электромобилей из различных источников клеток млекопитающих путем включения как физикохимических и функциональных считывания. Этот подробный протокол позволит исследователям EV простое определение подходящих условий хранения их пузырьков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

В рамках этой работы была поддержана программа исследований в области Нанпофутур, проводимая федеральным министерством образования и научных исследований Германии (номер гранта 13XP5029A). Максимилиан Рихтер был поддержан Студенистифтунг де Дойшен Волькес (немецкий академический Стипендиальный фонд) через стипендию кандидата наук.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) Sigma-Aldrich P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) Sigma-Aldrich P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks Corning 431082 Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane Wyatt Technology Europe 1854
350 µm spacer Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase Sigma-Aldrich G7646-100KU
Chloroform Fisher scientific C/4966/17
Column oven Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector  Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm Merck VVLP04700 Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3156 Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec Wyatt Technology Europe
EGM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3162 Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers R&D Systems DY992 used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol Fisher scientific E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block Avanti Polar Lipids 610000-1EA
Filter support Avanti Polar Lipids 610014-1EA used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide Thermo Fisher Scientific F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36 Thermo Fisher Scientific 18912014
Hettich Universal 320 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells Lonza Verviers, S.p.r. C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM Kimble 420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR international 525-0255 the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1 Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes Whatman/GE Healthcare 110406 used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate Sigma-Aldrich 79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation Beckman Coulter 355622
QuantiPro BCA Assay Kit Sigma-Aldrich QPBCA-1KT
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b GE Healthcare 17014001
SEM copper grids with carbon film Plano S160-4
Small AF4 channel Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor Beckman Coulter 339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K Beckman Coulter
UV detector Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter Whatman/GE Healthcare 10401712 Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
  2. Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
  3. Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
  4. György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
  5. Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
  6. Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
  7. Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
  9. Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
  10. Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
  11. Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
  12. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  13. Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
  14. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
  15. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
  16. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  17. Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
  18. Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
  19. Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
  20. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
  21. Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
  22. Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
  23. Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
  24. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  25. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
  26. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  27. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
  28. Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
  29. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
  30. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  31. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
  32. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  33. Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
  34. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
  35. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  36. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
  37. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).

Tags

Биоинженерия выпуск 147 внеклеточные везикулы exosomes стабильность хранения инкапсуляция ферментов лиофизизация замораживание сушки асимметричное поток-фракционирование потока
Оценка стабильности хранения внеклеточного везикулы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, … More

Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, G. Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (147), e59584, doi:10.3791/59584 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter