Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية

Published: May 22, 2019 doi: 10.3791/59584
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Biogenic Nanotherapeutics group (BION), 2Department of Pharmacy, Saarland University

Summary

هنا نقدم بروتوكول قابل للتطبيق بسهوله لتقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية ، وهي مجموعه من الجسيمات النانويه التي تحدث بشكل طبيعي التي تنتجها الخلايا. يتم تحميل الحويصلات مع جلوكوروداز كانزيم نموذج وتخزينها في ظل ظروف مختلفه. بعد التخزين ، يتم تقييم المعلمات الفيزيائية الكيميائية ونشاط الانزيم المغلف.

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (المركبات الحيوية) هي أهداف واعده في البحوث الحالية ، لاستخدامها كادويه ، وناقلات المخدرات ، والمؤشرات الحيوية. لتطويرهم السريري ، ليس فقط نشاطهم الصيدلاني مهم ولكن أيضا إنتاجهم يحتاج إلى تقييم. وفي هذا السياق ، تركز البحوث علي عزل المركبات الخاصة ، وتوصيفها ، وتخزينها. تهدف المخطوطة الحالية إلى توفير اجراء لتقييم تاثير ظروف التخزين المختلفة علي المركبات الحيوية ، دون التلاعب بالجينات أو المقايسات الوظيفية المحددة. وهذا يجعل من الممكن الحصول بسرعة علي الانطباع الأول من استقرار المركبات التي تحت حاله تخزين معينه ، ويمكن مقارنه المركبات التي تستمد من مصادر الخلايا المختلفة بسهوله. ويستند قياس الاستقرار علي المعلمات الفيزيائية الكيميائية للمركبات (الحجم ، وتركيز الجسيمات ، والمورفولوجية) والحفاظ علي نشاط حمولتها. يتم تقييم هذا الأخير من قبل التغليف بوساطة سابونين من انزيم بيتا جلوكوروداز في المركبات أليفه. جلوكوروداز يعمل كبديل ويسمح للقياس الكمي سهله عن طريق انشقاق جزيء مراسل الفلورسنت. يمكن ان يكون هذا البروتوكول أداه للباحثين في البحث عن ظروف التخزين التي تحتفظ علي النحو الأمثل خصائص EV لدفع البحوث EV إلى التطبيق السريري.

Introduction

المركبات أليفه هي جسيمات نانويه الغشاء التي تنتجها تقريبا جميع أنواع الخلايا. للخلايا الثدييات ، يمكن تقسيم المركبات الاساسيه إلى مجموعتين رئيسيتين مع مسارات إنتاج متميزة1،2. وتنتج الحويصلات غشاء ، مع نطاق حجم من تقريبا 100-1000 نانومتر ، من قبل الناشئة مباشره من غشاء الخلية. وتستمد exosomes ، الحجم 30-200 نانومتر ، من الهيئات متعددة الخلايا التي شكلتها الداخل في مهدها إلى التنظير الداخلي الذي فتيل في وقت لاحق مع غشاء الخلية للإفراج عن التماثيل المتعددة في وقت واحد. الوظيفة الرئيسية لهذه الحويصلات هو نقل المعلومات بين الخلايا3. لهذا الغرض ، يتم فرز الشحنات مثل RNA والحمض النووي والبروتينات بنشاط في نفوسهم. المركبات التي يمكن ان تنقل مجموعه متنوعة من الآثار علي أهدافها ، مع الآثار المترتبة علي كل من الحالة الصحية والمرض. علي جانب واحد, انها التوسط الآثار الايجابيه مثل تجديد الانسجه, العرض مستضد, أو اثار المضادات الحيوية, مما يجعلها أهداف الميمون لتنميتها كما التداوي4,5. علي الجانب الآخر, المركبات النارية يمكن ان تعزز الاوعيه الدموية الورم6, حمل اثار المارة في الاستجابات الإجهاد7, وقد تلعب دورا في امراض المناعة الذاتية8 والامراض التهابيه9. التالي ، فانها قد تكون عنصرا رئيسيا لفهم أفضل للعديد من الآثار المرضية. ومع ذلك ، فان وجود المركبات المتغيرة في الامراض المنوعة ، مثل السرطان10،11،12 واضطرابات القلب والاوعيه الدموية13، وسهوله الوصول اليها في الدم والبول يجعلها مثاليه حيوي. وأخيرا ، والتوافق البيولوجي جيده14 وقدرتها علي استهداف المتاصله جعل المركبات الحيوية أيضا مثيره للاهتمام لتسليم المخدرات15. في هذه المخطوطة ، نقوم بوصف بروتوكول لتقييم استقرار التخزين للمركبات المركبة التي تستمد من خلايا الثدييات ، وهي خاصيه هامه لا يزال التحقيق فيها قليلا.

للتطوير السريري للمركبات المركبات الخاصة ، لا تزال هناك العديد من العقبات للتغلب علي16، بما في ذلك تقييم اثارها العلاجية ، والإنتاج ، وتنقيه ، وتخزين17. بينما-80 درجه مئوية وينظر علي نطاق واسع علي انها معيار الذهب لتخزين EV18، والمجمدات المطلوبة مكلفه ، والحفاظ علي سلسله الباردة المطلوبة من الإنتاج إلى المريض يمكن ان تكون صعبه. وعلاوة علي ذلك ، تشير بعض التقارير إلى ان التخزين في-80 درجه مئوية لا يزال لا يحفظ علي النحو الأمثل المركبات أليفه ويدفع خسارة في وظيفة EV19,20. وقد اقترحت طرق أخرى ، مثل تجميد التجفيف21أو22 أو التجفيف بالرذاذ23، كبدائل محتمله للتخزين المجمد للمركبات المركبة.

والطريقة المثلي لتقييم استقرار التخزين هي اختبار المركبات الحيوية في المقايسات الوظيفية أو من خلال تقييم علامة محدده ، علي سبيل المثال ، نشاطها المضاد للبكتيريا19. وهذا ممكن عندما يكون التاثير المطلوب من الحويصلات المعروفة وعندما مجموعه واحده متميزة من المركبات التي يمكن دراستها. وإذا ما قورنت المركبات التي من مصادر مختلفه للخلايا (علي سبيل المثال ، بالنسبة لتغليف المخدرات) أو إذا لم تكن هناك قراءات وظيفية معروفه ، فانه لم يعد من الممكن تقييم التغيرات الناجمة عن التخزين بطريقه مباشره.

من ناحية أخرى ، ببساطه تقييم التغييرات في المعلمات الفيزيائية الكيميائية ، مثل الحجم ، واستعاده الجسيمات ، وتركيز البروتين ، لا يتنبا دائما التغيرات في نشاط EV ، كما هو مبين في براءة اختراع الاخيره20.

هنا ، ونحن نقدم بروتوكول قابل للتطبيق بسهوله لقياس استقرار التخزين من المركبات أليفه من خلال تقييم المعلمات الفيزيائية الكيميائية جنبا إلى جنب مع نشاط انزيم بيتا جلوكوروداز مغلفه كبديل للبضائع من المركبات أليفه. يتم تحميل الانزيم من قبل حضانة سابونين ، طريقه معتدله التي أنشئت مع المركبات الخاصة من مصادر مختلفه21،24،25. يشكل سابونين المسام العابرة في غشاء EV ، والذي يسمح بامتصاص الانزيم في الحويصلة. كما الانزيمات عرضه لتفقد نشاطها إذا تعرضت لظروف التخزين غير المواتية ، فهي بديل مثالي لتقييم الحفاظ علي الشحنات الوظيفية للمركبات المركبات الخاصة.

وقد أثبتنا ان تطبيق هذا البروتوكول علي المركبات التي تستمد من الخلايا الجذعية البشرية (MSCs) ، والخلايا المبطنة بالوريد السري البشري (HUVECs) ، والخلايا الظهاريه السرطانية البشرية (A549) تؤدي في الواقع إلى اختلافات كبيره في استقرار التخزين بين خطوط الخلايا المختلفة ، والتي ينبغي ان تؤخذ في الاعتبار عند اختيار مصدر EV21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-ثقافة الخلية وإنتاج الخلايا المتوسطة المكيفة

  1. عموما ، زراعه الخلايا تحت الظروف الفردية المطلوبة لخط الخلية المعنية.
  2. زراعه الخلايا ل 24-72 h في ظروف خاليه من المصل أو في المتوسطة التي تحتوي علي مصل الأبقار الجنينية المنضب EV.
    ملاحظه: إذا تم استخدام المستنفدة للمركبات اليورانيوم المنضب ، وتوظيف طريقه ثبت ان تستنفد بكفاءة المصل ، لمنع التلوث مع الأبقار المشتقة مصل المركبات26.
  3. جمع المتوسطة من قوارير. الطرد المركزي في 300 x g ل 10 دقيقه لبيليه الخلايا. بعناية جمع المتوسطة الخلية المكيفة (CCM) ، دون إزعاج الخلايا التي تغلف. يفضل, استخدام CCM مباشره, أو تخزينه بين عشيه وضحيها في 4 ° c.
    ملاحظه: من الأفضل دائما استخدام CCM المنتجة حديثا. وإذا تعذر التحايل علي التخزين لفترات زمنيه أطول ، فينبغي تسجيل جميع البارامترات ذات الصلة وفقا للمبادئ التوجيهية MISEV201826، ويجب ان تؤخذ في الاعتبار التحيزات المحتملة للنتائج المكتسبة.
  4. مثال بروتوكول ل HUVECs
    1. زراعه خلايا HUVEC ل 120 h في غير عادي-2 المتوسطة التي تحتوي علي والمكملات الأخرى.
    2. زراعه الخلايا HUVEC ل 48 h في EBM-2 القاعدية المتوسطة خاليه من اي ملاحق اضافيه.
    3. جمع المتوسطة من قوارير وتنفيذ الخطوة طرد كما هو مبين أعلاه (الخطوة 1.3). عاده ، استخدم 100 مل من المتوسطة لعزل EV واحد.

2-الحلول الخاصة بالذخائر العنقودية

  1. مباشره قبل نبذ حلول (UC) ، الطرد المركزي CCM لمده 15 دقيقه في 3,000 x g و 4 درجه مئوية لأزاله الحطام الخلية والاجلمرتر الكبيرة.
  2. نقل بعناية ماده طافي إلى أنابيب UC. إذا كان استخدام الدوار زاوية ثابته ، وضع علامة علي اتجاه الأنابيب في جهاز الطرد المركزي لتسهيل استعاده بيليه EV بعد UC. الطرد المركزي لمده 2 ح في 120,000 x g، مع k-عامل من 259.4.
  3. بعد UC ، وتجاهل بعناية ماده طافي باستخدام pipet المصلية ، لتجنب اضطراب المركبات الحيوية التي تغلف.
    ملاحظه: قد يكون بيليه غير مرئية.
  4. أضافه 200 μl من 0.2 μm-تصفيه الفوسفات-مخزنه المالحة (التلفزيونية الخاصة) إلى الأنبوب الأول واستخدام التلفزيونية والمتبقية ماده طافي لأعاده تعليق بيليه عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا. نقل تعليق EV الناتجة إلى الأنبوب التالي من العينة المعنية واستخدامه لأعاده التعليق. المضي قدما بهذه الطريقة لأعاده تعليق جميع المركبات التي من العينة في حجم النهائي من حوالي 300-350 μL.
  5. بعد أعاده التعليق ، وتاكيد وجود الجزيئات عن طريق تحليل تتبع جسيمات متناهي (NTA). استخدم الإعدادات المحسنة لنوع EV المعطي ، مثل الإعدادات الموجودة أدناه (الخطوة 2.5.1).
    ملاحظه: الأوراق من جاردينر وآخرون27 و vestad وآخرون28 تحتوي علي معلومات قيمه عن كيفيه تحسين المعلمات لقياس المركبات الحيوية.
    1. لأعاده إنتاج النتائج الموصوفة أدناه ، استخدام الاداات (علي سبيل المثال ، نانوسايت LM14) مجهزه بالليزر الأخضر. تسجيل ثلاثه أشرطه الفيديو من 30 s مع كسب الشاشة من 1.0 ومستوي الكاميرا من 13. للتحليل ، استخدم كسب الشاشة 1.0 وعتبه الكشف عن 5.
  6. استخدام بيليه علي الفور ، إذا كان ذلك ممكنا ؛ والا ، تخزينه في 4 °C بين عشيه وضحيها.

3. جلوكوروداز التغليف في المركبات الخاصة

  1. إلى بيليه أعاده تعليق ، أضافه بيتا جلوكوروداز (10 ملغ/مل في تلفزيوني) إلى تركيز النهائي من 1.5 ملغ/مل و سابونين (10 ملغ/مل في ح2س) إلى تركيز نهائي من 0.1 ملغ/مل. اخلط جيدا بواسطة فورتيكنج لمده 3 ليالي.
  2. احتضان لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة مع خلط شكل متقطع عن طريق التحريك برفق الأنبوب. بعد الحضانة ، تنقيه مباشره بواسطة الفصل اللوني الاستبعاد الحجم (SEC) (انظر القسم 5).
    ملاحظه: لا تقم باعاده تجميد عينات جلوكوروداز مره واحده أذابه ، لمنع تدهور الانزيم بسبب التجمد.

4. إنتاج الليليسوم

  1. لاعداد الشحمية للمقارنة مع المركبات الليفية ، حل 1 ، 2-ديميريستوريل-sn-غليسرو-3-فوسفولكولين (dmpc) و1 ، 2-ديبالميتويل--------3-فوسفونوكولين (dppc) في التموينية المولي 2:3 في كلوروفورم إلى تركيز نهائي من 5 ملم. قم بتحضير 1 مل من الكوبوتس في قوارير السائل اللوني عالي الأداء (HPLC) واتركها تجف بين عشيه وضحيها لتشكل فيلما دهنيا.
    تحذير: كلوروفورم سام ويشتبه في ان يكون الانحلال. اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند التعامل معها.
  2. أعاده ترطيب الفيلم الدهني مع 1 مل من الأفلام التي تحتوي علي 1.5 ملغ/مل جلوكوروداز. يسخن إلى 42 درجه مئوية ودوامه لمده 1 دقيقه. تسخين الجمعية الطارد إلى 42 درجه مئوية وقذف الدهون تعليق 11x من خلال غشاء البولي 200 nm. تنقيه مباشره بواسطة SEC (انظر القسم 5).

5. تنقيه بواسطة SEC

  1. اعداد العمود SEC باستخدام البروتوكول التالي.
    1. استخدم فقط المياه النقية الطازجة والمخازن المؤقتة المحضرة حديثا. تصفيه جميع المخازن المؤقتة من خلال فلتر غشاء 0.2 μm و ديغا لهم لمنع تشكيل فقاعات الهواء في العمود.
    2. لاعداد العمود SEC ، استخدم المصفوفة القائمة علي الترشيح هلام (علي سبيل المثال ، السفبرز Cl-2b) أو آخر SEC المتوسطة مناسبه لفصل المركبات الخاصة والدهنية من شوائب البروتين والانزيم الزائد. أولا ، قم بازاله الحل EtOH 20 ٪ يتم تخزين المتوسطة في ، لمنع تشكيل فقاعه الهواء في العمود. لهذه الغاية ، والطرد المركزي المتوسط SEC في 3,000 x g لمده 10 دقيقه ، وأزاله etoh ، واستبدالها مع المياه الغازية.
    3. أملا عمودا زجاجيا (بقطر داخلي يبلغ 10 ملم) مع متوسط SEC إلى علامة 15 مل.
      ملاحظه: ستختلف وحدات التخزين للاعمده ذات الابعاد المختلفة. تاكد من السماح للهلام يستقر تماما.
    4. قبل تشغيل ، تتوازن العمود مع مجلدين العمود علي الأقل من تلفزيوني. لتخزين العمود ، اغسله أولا بحجم عمود واحد من الماء ، متبوعا بمجلدين علي الأقل من الاعمده بنسبه 20% EtOH. بعد تخزين, يغسل العمود اولي مع واحده عمود حجم الماء قبل تولد مع [ببس].
    5. استخدام ما يصل إلى 400 μL من EV أو تعليق ليبوسوم في فصل واحد. جمع الكسور من 1 مل. بعد SEC ، اما تخزين المركبات الحيوية المنقية (انظر القسم 7) أو إخضاعها لفحص جلوكورونيداز (انظر القسم 6).
  2. تاكيد فصل المركبات الخاصة والشحمية من تلويث البروتينات والجلوكوروداز الحرة. وتحقيقا لهذه الغاية ، ربط تركيزات الجسيمات من الكسور التي تم جمعها مع تركيز البروتين والنشاط جلوكورونيداز.
    1. تقييم تركيز الجسيمات من قبل NTA (انظر 2.5)
    2. تقييم محتوي البروتين عن طريق فحص حمض ثنائي اللون (BCA) أو فحص كمي آخر مناسب للبروتين. قم باجراء الفحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. تقييم النشاط جلوكوروداز بواسطة فحص جلوكوروداز (انظر القسم 6).
  3. اختياريا ، وتقييم المورفولوجية EV عن طريق المجهر الكترون الإرسال (TEM) والمسح المجهري الكترون (SEM).
    1. لاعداد عينات TEM ، أضافه 10 μL من تعليق EV إلى شبكه TEM ، احتضان لمده 10 دقيقه ، ومن ثم لطخه بعيدا اي السائل الزائد باستخدام ورقه فلتر. أداء التثبيت لمده 10 دقيقه مع 10 μL من 4 ٪ بارافورمالدهيد ولطخه بعيدا اي فائض. غسل 3x مع الماء. وصمه عار الحويصلات من قبل الحاضنة 20 ق مع 30 μL من 1 ٪ هيدرات حمض تونغستيك الفوسفور. بعد التنقيط بعيدا الزائدة ، تجف الحويصلات بين عشيه وضحيها. تصور من قبل TEM.
      تحذير: الفوسفات-حمض tungstic هو الكاوية للغاية. التالي ، حماية الجلد والعينين.
    2. لوزارة شؤون المعوقين ، وإصلاح عينات TEM المعدة مسبقا علي أقراص الكربون و بصق لهم مع طبقه ذهبيه سميكه 50 nm. تصور من قبل SEM.

6. فحص جلوكوروداز

  1. ان يسمح مقارنه بين عينات مختلفه وتخزين شروط ب [كوردد] جسيم رقم وانزيم نشاط, اولي يقيس الجسيم تركيز من العينة ب [ا] (يري خطوه 2.5).
  2. اعداد حل العمل من فلوريسئين دي-β-د جلوكورونيد عن طريق أضافه 1 μL من المجمع (10 ملغ/مل في ح2س) إلى 199 ΜL من تلفزيوني. أضافه 25 μL من هذا الحل إلى 125 μL من المركبات الخاصة المنقية للحصول علي تركيز نهائي من 8.3 ميكروغرام/مل. Pipet العينة في لوحه سوداء 96-بئر. قياس نقطه الوقت 0 h مع قارئ لوحه ، وذلك باستخدام 480 nm كما الاثاره و 516 nm كما الطول الموجي الانبعاثات.
  3. تغطيه لوحه باحكام (علي سبيل المثال ، مع رقائق بلاستيكية شفافة تستخدم للواح PCR) للتقليل من التبخر واحتضان في الظلام ل 18 ح في 37 درجه مئوية. قياس إنتاج فلوريسئين باستخدام معلمات قارئ لوحه المدرجة في الخطوة 6.2.

7. تخزين المركبات الكترونيه والشحمية

ملاحظه: لجميع أغراض التخزين ، فانه من المستحسن استخدام أنابيب منخفضه الربط للحد من خسارة EV بسبب الامتزاز.

  1. اتبع المعلمات في هذا القسم لأعاده إنتاج النتائج التمثيلية الواردة أدناه. استخدام عينات تتكون من 400 μL من تعليق EV.
    1. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية أو-80 درجه مئوية أو انتقل إلى الخطوات المدرجة أدناه.
    2. تجميد المركبات الخاصة.
      1. أضافه تريهالوز (40 ملغ/مل في ح2س) تصل إلى تركيز النهائي من 4 مغ/مل إلى المركبات الدقيقة المنقية. تجميد العينات في-80 درجه مئوية لمده 1 ساعة علي الأقل.
      2. تجميد العينات باستخدام المعلمات التالية. لتجفيف الرئيسية ، تعيين درجه حرارة الرف إلى 15 درجه مئوية والضغط علي 0.180 ميليبار وترك عينات لتجف ل 46 h. لتجفيف النهائي ، وتعيين درجه حرارة الرف إلى 25 درجه مئوية والضغط علي 0.0035 ميليبار وترك عينات لتجف لمده 2 ح. تخزين العينات المجففة بالتجميد في 4 درجه مئوية.
      3. لأعاده هيدرات العينات ، أضف H2O ، يساوي مقدار تعليق EV الموجود في البداية (عاده ، 400 μl). لا تستخدم اي مخزن مؤقت للاماهه.

8. التحليل بعد التخزين

  1. لتقييم نشاط الانزيم ، قم أولا بازاله جلوكوروداز الحرة ، والتي قد تسربت من المركبات الخاصة اثناء التخزين. تحقيق ذلك عن طريق خطوه اضافيه من تنقيه التي يتم تنفيذها اما بواسطة SEC (انظر الخطوة 5) أو لاتناظريه تدفق الحقل تدفق التجزئة (AF4) (انظر الخطوة 8.1.2).
    ملاحظه: يرجى العلم ان كلا الأسلوبين يؤدي إلى تخفيف من عينه EV; التالي ، استخدام تركيزات EV كافيه قبل التخزين لتجنب التحرك تحت حد الكمية NTA. نتوقع 1:10 التخفيف من الجسيمات بسبب SEC أو AF4.
    1. لتنقيه SEC ، اتبع البروتوكول المذكور أعلاه (انظر القسم 5).
    2. اجراء تنقيه AF4.
      1. اعداد الصك باستخدام قناه صغيره مع فاصل 350 μm و 30 دينارا كويتيا الوزن الجزيئي قطع غشاء السليلوز. وضع فلتر حجم المسام 0.1 μm بين مضخة HPLC وقناه AF4. استخدام الطازجة أعدت 0.1 μm--تصفيه التلفزيونية كمرحله متنقلة للحد من حموله الجسيمات والضوضاء في كاشفات تشتت الضوء.
      2. الكشف عن البروتينات باستخدام كاشف الاشعه فوق البنفسجية تعيين إلى 280 نانومتر. للكشف عن الجزيئات ، استخدم تشتت الضوء متعدد الزوايا مع تعيين الليزر إلى 658 نانومتر.
      3. استخدم أسلوب التشغيل التالي. قبل التركيز لمده دقيقه واحده مع تدفق التركيز من 1 مل/دقيقه ؛ ثم ، حقن 300 μL من العينة بمعدل 0.2 mL/min ومواكبه تدفق التركيز لمده 10 دقيقه. بعد الحقن ، الوت العينة في 1 مل/دقيقه في حين تطبيق تدفق الصليب الذي ينخفض من 2 مل/دقيقه إلى 0.1 مل/دقيقه علي مدي 8 دقيقه الوت لمده 10 دقيقه أخرى دون تدفق الصليب. جمع الكسور من 1 مل ، ابتداء من 12.5 دقيقه والاستمرار حتى 27 دقيقه.
    3. اجراء فحص جلوكوروداز علي النحو الموصوف أعلاه (انظر القسم 6).
  2. لتقييم حجم وتركيز ، واستخدام NTA كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 2.5).
  3. اختياريا ، وأداء TEM وSEM لتقييم المورفولوجية من المركبات التي بعد التخزين (انظر 5.3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1 يعرض خصائص التخزين من المركبات التي تم عزلها من HUVECs. تم عزل المركبات الخاصة من قبل جامعه كاليفورنيا ، تم تغليف جلوكورونيداز ، وبعد SEC ، تم تقييم المركبات الكيميائية المنقية لخصائصها الفيزيائية من قبل NTA. وخضعت عينه من الحويصلات لاحقا لتنقيه AF4 وتم قياس نشاط جلوكوروداز.

خزنت الحويصلات كان بعد ذلك ل 7 [د] في 4 [ك] أو-80 [ك] وفي 4 [ك] في شكل [بالتجميد], في الحالة متاخره مع الاضافه من 4% [تريهلز]. بعد التخزين ، تم قياس الحويصلات مره أخرى من قبل NTA ، وبعد AF4 ، تم تقييم النشاط جلوكوروداز المتبقية لكل الجسيمات.

ويستند مبدا العمل من AF4 علي مزيج من تدفق الصفيحة والتدفق المتعامد عبر الغشاء المساميه في الجزء السفلي من قناه AF4 ، والتي تؤثر بشكل مختلف الجسيمات وفقا لحجمها (الشكل 2). وتميل الجزيئات الأكبر إلى الاقتراب من الغشاء بينما تقع الجزيئات الأصغر في القناة. بسبب الملف الشخصي تدفق مكافئ للتدفق الرقائقي ، والجسيمات بعيدا عن الغشاء السفر بشكل أسرع نحو الكاشف ، مما يؤدي إلى فصل الجسيمات حسب الحجم. في تجربه AF4 النموذجية ، تركز الجزيئات المحقونة أولا علي الغشاء ، من خلال تطبيق تدفق الصليب دون تدفق طولي من خلال القناة (الشكل 2ا). بعد الحقن والتركيز ، ويبدا التملص من خلال تطبيق في وقت واحد تدفق الصليب وتدفق طوليه إلى يجزا و الوت المجموعات الفرعية المختلفة من الجزيئات (الشكل 2ب) ، والتي ، في حالتنا ، كانت المركبات الخاصة والحرة جلوكوروداز.

ويوضح الشكل 3 فصل الجسيمات النانويه (المركبات التابعة أو الشحمية) من تلويث البروتينات والجلوكوروداز غير المغلف. الملف الشخصي لل SEC من الجسيمات الشحمية (الشكل 3ا) تنقيه بعد اعدادها (انظر القسم 4 من البروتوكول) أظهرت فصل الجزيئات مع جلوكوروداز مغلفه من الانزيم الحر ، الكشف عنها من خلال فحص bca و نشاط الانزيم. وفي المثال الحالي ، سيتم اختيار الجزءين 6 و 7 لاجراء المزيد من التجارب لأنهما يحتويان علي اعلي تركيز للجسيمات ولمنع التلوث الممكنة مع جلوكورونيداز الحر. AF4 كان ناجحا أيضا في فصل المركبات الخاصة من جلوكورونيداز الحرة كما هو موضح في الشكل 3ب، مع درجه اعلي من الانفصال عن الثانية ، مما يجعل التلوث من الكسور التي تحتوي علي حويصلات اقل احتمالا.

في الشكل 4، تم اجراء تجربه مراقبه للتاكد من ان نشاط الانزيم المقيس بالحويصلات كان مرتبطا بالفعل بتغليف جلوكورونيداز في المركبات التي لا تسببها مجاميع الانزيم. قد تكون هذه المجاميع قد تم تشكيلها بسبب احتضان جلوكورونيداز مع سابونين ويؤدي إلى نتائج ايجابيه كاذبه. للتحقق من الكسور حيث الحويصلات سوف elute ، المركبات التي تم تنقيه دون جلوكورونيداز مغلفه تعرضت لل SEC علي نفس العمود كما العينة التي تحتوي فقط علي سابونين والانزيم.

عندما تم احتضان جلوكوروداز مع سابونين وتنقيتها في وقت لاحق من قبل SEC ، لم يتم العثور علي اي نشاط انزيم في الكسور التي تحتوي عاده علي المركبات الخاصة. في حين تم العثور علي كميات صغيره من الجزيئات إلى الوت في نفس الوقت المركبات الخفيفة (التي تشكل < 0.1 ٪ من الجزيئات المستردة من بيليه EV نموذجيه) ، لم يكن هناك نشاط انزيم المرتبطة. وتشير هذه النتائج إلى ان الانزيم النشط المسترد في الكسور التي تحتوي علي حويصلات كان مغلفا بها.

الشكل 5 يقارن استعاده الانزيم النشط بعد التخزين مع أو بدون تنقيه AF4 اضافيه لأزاله صبغه غير مغلفه. مع تنقيه AF4 ، وهناك عموما انخفاض الانتعاش من انزيم لكل الجسيمات ، مع اعلي تاثير للتخزين في 4 درجه مئوية ، حيث ينخفض الانتعاش بنسبه الثلثين. التالي, حذف هذه الخطوة تنقيه اضافيه يمكن ان يؤدي إلى افتراضات خاطئه حول استقرار الانزيم.

يظهر الشكل 6 تاثير التجميد بالتجميد بدون تبريد علي الحويصلات المشتقة من Mscs ، A549 الخلايا ، والدهنيات ، مقارنه مع التجمد عند-80 درجه مئوية. وكانت الجزيئات من قبل TEM وSEM كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 5.3 من البروتوكول). لم MSCs و A549 المركبات التي لا تظهر الاختلافات الكبيرة في الشكل في الصور TEM ، مقارنه ظروف التخزين اثنين. في الصور SEM ، ومع ذلك ، العينات المجففة بالتجميد المجاميع المعروضة لم يتم العثور عليها في-80 ° c عينات. الجسيمات الشحمية أيضا عرض المجاميع في الصورة SEM ، بينما في TEM ، ويبدو ان التجميد للحث علي زيادة حجم الشحمية. خفض التجميد بدون كريوبروتيكتانتس أيضا الانتعاش من جلوكوروداز سليمه بعد التخزين (الشكل 7). الاضافه من تريهالوز كتبريد زيادة الانتعاش من الانزيم النشط بطريقه تعتمد علي الجرعة.

ويبين الشكل 8 تحويل فلوريسئين دي-β-د-جلوكورونيد إلى الفلوريسئين الحرة ، التي تجري في فحص جلوكوروداز. في حين ان التعليم كان غير فلوري في 516 نانومتر ، فلوريسئين هو الفلورسنت للغاية في هذا الطول الموجي. وهذا يسمح لفحص نشاط الانزيم مباشره مع حساسية عاليه.

Figure 1
الشكل 1 : استقرار التخزين من المركبات HUVEC. (ا) استرداد الجسيمات مقارنه بما قبل التخزين ، (ب) متوسط الحجم ، و (ج) نشاط جلوكوروداز الطبيعي لكل جسيم من المركبات التي تم عزلها من huvecs. خزنت حويصلات كان ل 7 [د] في 4 [ك] و-80 [ك] وفي 4 [ك] بعد [فلود] مع 4% [تريهلز]. تم قياس متوسط الحجم والجسيمات الانتعاش من قبل NTA; تم حساب النشاط جلوكوروداز لكل الجسيمات الجمع بين البيانات NTA ونتائج فحص جلوكوروداز وتطبيعها قبل التخزين. يعني ± SD ، n = 3 ، *p < 0.05 (ANOVA في اتجاه واحد تليها اختبار tukey بعد المخصصة). عدلت من فرانك وآخرون21. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 : مبدا العمل لAF4. (ا) تتركز المركبات الخاصة والجلوكوروداز الحرة بعد الحقن عن طريق تطبيق تدفق الصليب. (ب) بعد ذلك ، يتم التملص من المركبات الخاصة والانزيم الحر بشكل منفصل من خلال الجمع بين تدفق عبر القناة مع تدفق الصليب. عدلت من فرانك وآخرون21. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 : فصل المركبات الخاصة والشحمية من جلوكورونيداز الحرة. (ا) الفصل في الثانية التمثيلية لليميمات المحملة جلوكورونيداز ، جلوكورونيداز الحرة ، والملوثات البروتينية. يعرض الرسم البياني تركيز الجزيئات (الأحمر) ، وتركيز البروتين (الأزرق) ، ونشاط جلوكوروداز (الأخضر). (ب) إثبات انفصال المركبات التابعة عن جلوكورونيداز الحرة. المركبات الخفيفة غير المعالجة ، ارتفعت المركبات مع 0.05 ملغ/مل جلوكوروداز ، جلوكورونيداز الحرة (0.5 ملغ/مل) ، والمركبات التي تحمل جلوكورونيداز وتنقيتها من قبل SEC (EV جلوكوروداز) تم حقن وتحليلها من قبل الاشعه فوق البنفسجية في 280 nm و 90 ° تشتت الضوء. الانزيم الحر الذي يتم التملص منه بشكل منفصل عن المركبات. عدلت من فرانك وآخرون21. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 : اختبارات التحكم لتنقيه المركبات الخاصة من جلوكورونيداز الحرة. 400 μL من المركبات الاهليه الاصليه أو 400 μL من 1.5 ملغ/مل جلوكورونيداز في الاحتضان لمده 10 دقيقه مع 0.1 ملغ/مل سابونين تم تنقيته من قبل SEC. (ا) تركيزات الجسيمات من الأجزاء التي تم جمعها من الحويصلات و جلوكوروداز ، علي التوالي ، ونشاط انزيم جلوكوروداز المنقي. (ب) امتصاص الاشعه فوق البنفسجية في 280 نانومتر تقاس في نفس التجربة. الذروة الصغيرة الاولي ل جلوكورونيداز يتوافق مع الخط الرمادي في لوحه A. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 : تاثير خطوات تنقيه اضافيه بعد التخزين EV. النشاط جلوكوروداز المتبقية لكل الجسيمات مقارنه d0 مع أو بدون خطوه تنقيه AF4 اضافيه بعد التخزين. تم تخزين المركبات الخاصة HUVEC ل 7 d في 4 درجه مئوية أو-80 درجه مئوية ومجفف بالتجميد مع 4 ٪ trehalose. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 : تيم والصور SEM من المركبات الخاصة. الصور TEM و SEM من المركبات التي من (ا) mscs و (B) A549 الخلايا و (ج) الجسيمات الشحمية. تم تخزين العينات ل 14 د في-80 درجه مئوية أو بالتجميد بدون أضافه trehalose. الأسهم تشير إلى وجود جزيئات تغيرت شكليا في الصور TEM والمجاميع في الصور SEM. عدلت من فرانك وآخرون21. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7 : تاثير تريهالوز علي استعاده الانزيم بعد التجميد. مقارنه بين نشاط الانزيم بعد التجميد لمده 14 يوما ، مع 0 ٪ ، 1 ٪ ، و 4 ٪ تريهالوز مع العينة قبل التخزين (0 أيام). عدلت من فرانك وآخرون21. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8 : الانشقاق الانزيمي من فلوريسئين دي-β-دي جلوكورونيد بواسطة جلوكوروداز. في المخطط ، يتم شرح رد الفعل الكامن وراء الكشف عن جلوكورونيداز. غير فلوري فلوريسئين دي-β-د جلوكورونيد هو المشقوق من جلوكورونيداز. ومن خلال أزاله بقايا السكر ، يستعيد فلوريسئين خصائصه الفلورية. المضان يقاس بعد فتره الحضانة يرتبط مع كميه الانزيم النشط الحاضر وهو قراءات الفحص جلوكورونيداز. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا شاملا لدراسة استقرار المركبات التي تخضع لظروف تخزين مختلفه. مع مزيج من جلوكوروداز مغلفه كما قراءات وظيفية وتقييم المعلمات الفيزيائية للمركبات المركبات الخاصة ، وبروتوكول يسمح لتقييم الاستقرار التخزين مباشره من المركبات الخاصة ومقارنه المركبات الخاصة من خليه مختلفه خطوط. SEM و TEM كاساليب تكميليه تسمح نظره ثاقبه في التغيرات من المركبات الخاصة علي مستوي الجسيمات واحد. أظهرت النتائج المعروضة هنا ميل المركبات الخاصة والشحمية إلى التجميع بسبب التجميد بدون تبريد (الشكل 6). ومع ذلك ، لوحظ هذا فقط في التجارب SEM. في حين لم تجر التصوير EM مع العينات التي تم الحفاظ عليها مع trehalose ، وتشير الأدبيات إلى ان هذا التبريد قد يقلل في الواقع من تجميع المركبات الخاصة29. ومن الممكن أيضا تقييم ، إذا كانت حاله تخزين معينه تؤثر بشكل مختلف علي حجم EV ، ومعدل الاسترداد والجزيئات مغلفه. ويتجلى هذا الأثر من خلال النتائج التي تم الحصول عليها للمركبات المركبات HUVEC (الشكل 1). في حين ان استرداد الجسيمات ل 4 درجه مئوية و-80 درجه مئوية كان أفضل من للعينات بالتجميد ، كان الانتعاش من جلوكوروداز المغلفة النشطة أفضل للعينات بالتجميد. يمكن بالتجميد من المركبات التي يمكن ان تكون حاله تخزين أكثر ملاءمة ، علي سبيل المثال ، عند تحليل المؤشرات الحيوية EV ، حيث التركيز هو أكثر علي الحصول علي والحفاظ علي البضائع سليمه بدلا من علي الحويصلات سليمه.

وفي ورقتهم الاخيره عن تجميد المركبات الحيوية22، اتبعت charoيحسد riyakul وآخرون نهجا مماثلا. وفيما يتعلق بالمعلمات الفيزيائية الكيميائية ، فانها تركز علي مؤشر تعدد المشتتات (PDI) وإمكانات زيتا ، حيث ان التغيرات في إمكانات زيتا يمكن ان ترتبط مع انخفاض الاستقرار الغرويه. ومع ذلك ، فان إمكانات زيتا لا يمكن ان تفسر فقط التغييرات الملحوظة في الاستقرار30، والتي انعكست أيضا في نتائجها. كما انها قارنت البروتين والحمض الريبي النيبالي محتوي المركبات الكهربائية المخزنة بواسطة الكهربي هلام بولياكريلاميد. هذه التقنية يمكن ان تشير بشكل جيد جدا إلى تغييرات كبيره في البروتين أو الحمض الريبي النيبالي محتوي الحويصلات. ومع ذلك ، فانه يتطلب كميات أكبر بكثير من المواد من الطريقة المعروضة هنا. لتقييم تاثير التخزين علي البضائع EV ، وأعربت Charoيحسد Riyakul وآخرون غير متجانسة الانزيم والحمض النووي الأنواع كل في خط الخلية المنتجة EV ورصد نشاطها والنزاهة في المركبات الحيوية. ومع ذلك ، فان هذا التعبير غير المتجانس ليس مناسبا إذا ما قورنت المركبات التي من مصادر مختلفه ، لأنها تتطلب قدرا كبيرا من الوقت لكل خط خلوي جديد ، في حين يمكن تطبيق التغليف البسيط الذي يتوسطه الستونين بسهوله.

من الضروري أزاله اي انزيم غير مغلف ، كما هو موضح في الشكل 3. يتفاعل جلوكوروداز EV-مغلفه إبطا بكثير مع الركيزة من الانزيم الحر في الحل ، مما يؤدي إلى مبالغه في كفاءه التغليف. الفصل النظيف مهم بشكل خاص للتحليل بعد التخزين ، حيث ان ظروف التخزين قد تؤثر علي نشاط جلوكوروداز الحرة في العينة بشكل مختلف وقد تؤدي إلى تسرب من المركبات التي تضررت. وكان هذا واضحا في تجاربنا (الشكل 5) ، كما تطبيق AF4 قبل فحص جلوكوروداز تمكنت من أزاله صبغه لا مغلفه في الحويصلات. لذلك, جعل هو يمكن ان يحصل نتيجات واضحة علي التاثير من التخزين طرق يتناقش هنا, بينما دون AF4, النشاط خسارة واجبه إلى تخزين يتلقى يكون قللت.

ومن الاعتبارات الهامه الأخرى العزلة وتوصيف المركبات التي سيتم اختبارها من أجل استقرارها. علي الرغم من ان التقنية الموصوفة تمكن من مقارنه المركبات التي من مصادر مختلفه ، وهذا ممكن فقط إذا تم اعداد كل منهم بنفس طريقه العزل بحيث لا يتم تشويه النتائج18،31،32. في هذا السياق ، يجب ان تؤخذ ظروف ثقافة الخلية في الاعتبار أيضا ، لأنها يمكن ان تؤثر علي كميه والنشاطالحيوي للمركبات المركبات ال33ه المعزولة. للحصول علي النتائج التي يمكن مقارنتها بالنتائج المنشورة الأخرى ، فانه من المستحسن الرجوع إلى تحديث "الحد الأدنى من المعلومات للدراسات من الحويصلات خارج الخلية" التي تحتوي علي مبادئ توجيهيه لتنسيق البحوث EV26.

في البروتوكول المعروض هنا ، استخدمنا SEC أو AF4 لأزاله الانزيم الحر بعد التخزين. يمكن تطبيق أساليب أخرى ، مثل التدرج اللوني للانحدار ، UC ، أو الترشيح الفائق34. بالمقارنة مع طرق الطرد المركزي ، SEC و AF4 اقل مضيعه للوقت (علي سبيل المثال ، تقريبا 1.5 h لل SEC بما في ذلك تاخيرمن العمود مقابل ما يصل إلى 16 ساعة أو أكثر لتدرج UC) وانها يمكن ان تفصل تماما البروتينات الحرة من المركبات الخاصة بالمقارنة مع UC العادية ، حيث هناك دائما تبقي ماده طافي المتبقية مع بيليه. وعلاوة علي ذلك ، SEC15 و AF435 هي أساليب معتدله ، والتي تحفز اقل القص الإجهاد علي المركبات الخفيفة. المقارنة ، فان القوات المفروضة علي المركبات التي كانت خلال الجامعة قد تؤدي إلى تعديل الجزيئات ، مثل التجميع والتعديلات في الحجم34،36.

عيب من SEC و AF4 هو تخفيف العينات. التالي ، فمن المطلوب لعزل كميات كافيه من المركبات الخاصة للحفاظ علي التركيزات اللازمة لقياسات NTA بعد خطوات تنقيه متعددة. قد تتركز الكسور EV باستخدام مرشحات الطرد المركزي ولكن ، اعتمادا علي ماده التصفية والبروتوكول ، يمكن ان يكون هناك فقدان الحويصلات37.

الحد من البروتوكول الذي تمت مناقشته هنا هو انه يراقب فقط نشاط انزيم جلوكورونيداز مغلفه مناشئ ، لا تاخذ في الاعتبار الحمض النووي الريبي مغلفه و DNA ولا البروتينات السطحية EV التي قد تكون مهمة للوظائف18 . للبحث في العلاجات EV الجديدة ، لا يمكن لهذه التقنية استبدال الاختبارات علي وظيفة ولكن مجامله لهم وإعطاء اشاره حول الاستقرار حويصلة. يمكن ان يكون من استخدام كبير إذا ، علي سبيل المثال ، المركبات التي تستمد من السوائل الحيوية التي سيتم تخزينها لتحليلها في وقت لاحق من محتوي الحويصلة الخاصة بهم.

في المستقبل ، يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لتشمل أيضا المركبات الفضائية المستمدة من الكائنات الحية الأخرى ، علي سبيل المثال ، حويصلات الغشاء الخارجي البكتيرية. ستكون الخطوة التالية الأخرى المثيرة للاهتمام هي اختبار تغليف الأحماض النووية بواسطة حضانة سابونين والنظر أيضا في استقرار الحمض النووي أو الشحنات الريبية.

وفي الختام ، يوفر هذا الاجراء طريقه بسيطه لتقييم استقرار التخزين للمركبات المركبة من مختلف مصادر خلايا الثدييات عن طريق دمج كل من المادة الفيزيائية الكيميائية وقراءه وظيفية. هذا البروتوكول المفصل سوف يسمح للباحثين EV تحديد واضح لظروف التخزين المناسبة لحويصلتاتهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل برنامج البحوث النانوماتفوتوره المبتدئين الذي قدمته وزاره التعليم والبحوث الاتحادية في ألمانيا (رقم المنحة 13XP5029A). وقد تم دعم ماكسيميليان ريختر من قبل المؤسسة الاكاديميه المانيه للمنح الدراسية من خلال زمالة الدكتوراه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) Sigma-Aldrich P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) Sigma-Aldrich P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks Corning 431082 Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane Wyatt Technology Europe 1854
350 µm spacer Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase Sigma-Aldrich G7646-100KU
Chloroform Fisher scientific C/4966/17
Column oven Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector  Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm Merck VVLP04700 Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3156 Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec Wyatt Technology Europe
EGM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3162 Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers R&D Systems DY992 used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol Fisher scientific E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block Avanti Polar Lipids 610000-1EA
Filter support Avanti Polar Lipids 610014-1EA used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide Thermo Fisher Scientific F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36 Thermo Fisher Scientific 18912014
Hettich Universal 320 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells Lonza Verviers, S.p.r. C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM Kimble 420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR international 525-0255 the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1 Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes Whatman/GE Healthcare 110406 used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate Sigma-Aldrich 79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation Beckman Coulter 355622
QuantiPro BCA Assay Kit Sigma-Aldrich QPBCA-1KT
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b GE Healthcare 17014001
SEM copper grids with carbon film Plano S160-4
Small AF4 channel Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor Beckman Coulter 339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K Beckman Coulter
UV detector Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter Whatman/GE Healthcare 10401712 Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
  2. Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
  3. Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
  4. György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
  5. Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
  6. Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
  7. Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
  9. Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
  10. Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
  11. Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
  12. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  13. Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
  14. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
  15. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
  16. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  17. Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
  18. Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
  19. Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
  20. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
  21. Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
  22. Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
  23. Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
  24. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  25. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
  26. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  27. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
  28. Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
  29. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
  30. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  31. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
  32. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  33. Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
  34. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
  35. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  36. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
  37. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 147 ، الحويصلات خارج الخلية ، السموم ، استقرار التخزين ، تغليف الانزيم ، التجفيف بالتبريد ، تجميد الجفاف ، التدفق غير المتناظر للتدفق الميداني
تقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, … More

Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, G. Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (147), e59584, doi:10.3791/59584 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter