Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Vurdering af opbevarings stabiliteten af ekstracellulære vesikler

Published: May 22, 2019 doi: 10.3791/59584
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Biogenic Nanotherapeutics group (BION), 2Department of Pharmacy, Saarland University

Summary

Her præsenterer vi en let anvendelig protokol til at vurdere opbevarings stabiliteten af ekstracellulære vesikler, en gruppe af naturligt forekommende nanopartikler produceret af celler. Vesikler er lastet med glucuronidasesystemer som model enzym og opbevaret under forskellige forhold. Efter opbevaring evalueres deres fysisk-kemiske parametre og aktiviteten af det indkapslet enzym.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EVs) er lovende mål i den nuværende forskning, der skal anvendes som narkotika, narkotika-bærere, og biomarkører. For deres kliniske udvikling, ikke kun deres farmaceutiske aktivitet er vigtig, men også deres produktion skal evalueres. I denne forbindelse fokuserer forskningen på isolation af EVs, deres karakterisering og oplagring. Det nuværende manuskript har til formål at tilvejebringe en letkøbt procedure for vurdering af virkningen af forskellige opbevaringsforhold på evt, uden genmanipulation eller specifikke funktionelle analyser. Dette gør det muligt hurtigt at få et første indtryk af stabiliteten af EVs under en given opbevaringstilstand, og EVs, der er afledt af forskellige celle kilder, kan let sammenlignes. Stabilitets målingen er baseret på EVs ' fysisk-kemiske parametre (størrelse, partikelkoncentration og morfologi) og bevarelsen af deres gods aktivitet. Sidstnævnte vurderes af saponin-medieret indkapsling af enzymet beta-glucuronidase i evt. Glucuronidase fungerer som et surrogat og giver mulighed for en let kvantificering via spaltning af et fluorescerende reporter molekyle. Denne protokol kan være et værktøj for forskere i jagten på opbevaringsforhold, der optimalt bevarer EV-egenskaber for at fremme EV-forskning mod klinisk anvendelse.

Introduction

EVs er membran bundne nanopartikler fremstillet af næsten alle celletyper. For pattedyrsceller kan EVS opdeles i to hovedgrupper med særskilte produktionsveje1,2. Membran vesikler, med et størrelsesinterval fra ca. 100-1.000 Nm, fremstilles ved direkte spir fra cellemembranen. Exosomer, størrelse 30-200 Nm, er afledt af multi vesikulære organer dannet af indadgående spirende til endosomer, der efterfølgende fusionerer med cellemembranen til at frigive flere exosomer på én gang. Den vigtigste funktion af disse vesikler er transport af oplysninger mellem cellerne3. Til dette formål sorteres Cargos som RNA, DNA og proteiner aktivt i dem. Evt kan formidle en række forskellige effekter på deres mål, med konsekvenser for både sundhed og sygdom tilstand. På den ene side, de mægle positive virkninger såsom vævsregeneration, antigen præsentation, eller antibiotika virkninger, som gør dem lovende mål for deres udvikling som terapeutisk, 4,5. På den anden side, kan EVS fremme tumor vaskularitet6, inducere tilskuer effekter i stress svar7, og kan spille en rolle i autoimmune sygdomme8 og inflammatoriske sygdomme9. Således kan de være en nøglekomponent til en bedre forståelse af mange patologiske virkninger. Men tilstedeværelsen af ændrede EVS i mangfoldige sygdomme, såsom kræft10,11,12 og hjerte-kar-sygdomme13, og deres nemme tilgængelighed i blod og urin gør dem ideelle Biomarkører. Endelig, deres gode biokompatibilitet14 og deres iboende målretning evne gør EVS også interessant for narkotika levering15. I dette manuskript beskriver vi en protokol til vurdering af opbevarings stabiliteten for EVs, der er afledt af pattedyrsceller, en vigtig egenskab, der stadig ikke er særlig undersøgt.

Til den kliniske udvikling af EVs er der stadig mange forhindringer for at overvinde16, herunder evaluering af deres terapeutiske virkninger, produktion, rensning og opbevaring17. Mens-80 °C er almindeligt set som guld standard for EV opbevaring18, de nødvendige frysere er dyre, og opretholdelse af den nødvendige kølekæde fra produktionen til patienten kan være udfordrende. Desuden viser nogle rapporter, at opbevaring ved-80 °c stadig ikke optimalt bevarer evt og inducerer et tab i EV-funktionaliteten19,20. Andre metoder, såsom frysetørring21,22 eller spraytørring23, er blevet foreslået som mulige alternativer til frosset opbevaring af elbiler.

Den optimale måde at vurdere opbevarings stabiliteten på ville være at afprøve EVs i funktionelle analyser eller ved at evaluere en bestemt markør, for eksempel deres antibakterielle aktivitet19. Dette er muligt, når den ønskede virkning af vesikler er kendt, og når en særskilt gruppe af evt skal undersøgt. Hvis EVs fra forskellige celle kilder skal sammenlignes (f. eks. for stof indkapsling), eller hvis der ikke er nogen kendt funktionel aflæsning, er det ikke længere muligt at vurdere ændringer som følge af oplagring på en direkte måde.

På den anden side, blot at evaluere ændringer i deres fysisk-kemiske parametre, såsom størrelse, partikel genvinding, og proteinkoncentration, ikke altid forudsige ændringer i EV aktivitet, som det er blevet påvist i en nylig patent20.

Her giver vi en let anvendelig protokol til måling af elevs opbevarings stabilitet ved at vurdere deres fysisk-kemiske parametre kombineret med aktiviteten af et indkapslet beta-glucuronidaseenzym som et surrogat for lasten af EVs. Indlæsningen af enzymet sker ved saponin-inkubation, en mild metode, der er etableret med EVS fra forskellige kilder21,24,25. Saponin danner forbigående porer i EV-membranen, som giver mulighed for enzym optagelse i vesikel. Da enzymer er tilbøjelige til at miste deres aktivitet, hvis de udsættes for ugunstige opbevaringsforhold, er de en ideel surrogat for evalueringen af bevarelsen af funktionelle laster af EVs.

Vi har påvist, at anvendelsen af denne protokol på EVS fra humane mesenchymale stamceller (MSCS), humant navlestrengen vene-endotelceller (huvecer) og humant adenokarcinom alveolære epitelial celler (A549) faktisk resulterer i store forskelle i opbevarings stabilitet mellem forskellige cellelinjer, som bør tages i betragtning ved valg af EV-kilde21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cellekultur og produktion af celle konditioneret medium

  1. Generelt dyrke celler under de individuelle betingelser, der kræves for den pågældende cellelinje.
  2. Der dyrkes celler til 24-72 h i serum frie tilstande eller i medium indeholdende EV-depleteret føtal kvægserum (FBS).
    Bemærk: Hvis der anvendes EV-depleteret FBS, skal man anvende en metode, der er dokumenteret til effektivt at tømme serum, for at undgå kontaminering med serum afledt EVs26.
  3. Indsaml mediet fra kolberne. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter for at pille cellerne. Saml forsigtigt celle konditioneret medium (CCM), uden at forstyrre pelleterede celler. Du skal helst bruge CCM direkte eller opbevare den natten over ved 4 °C.
    Bemærk: det er altid at foretrække at bruge frisk produceret CCM. Hvis opbevaring i længere perioder ikke kan omgås, skal alle relevante parametre registreres i overensstemmelse med MISEV2018 retningslinje26, og de potentielle skævheder af de opnåede resultater skal tages i betragtning.
  4. Eksempel på protokol for HUVECs
    1. Dyrke HUVEC celler for 120 h i EGM-2 medium indeholdende FBS og andre kosttilskud.
    2. Dyrke HUVEC celler for 48 h i EBM-2 basal medium fri for eventuelle yderligere kosttilskud.
    3. Mediet opsamles fra kolberne, og Centrifugerings trinnet udføres som angivet ovenfor (trin 1,3). Brug typisk 100 mL medium til én EV-isolation.

2. ultracentrifugering af CCM

  1. Umiddelbart før ultracentrifugering (UC) centrifugeres CCM i 15 min ved 3.000 x g og 4 °c for at fjerne cellerester og store agglomerater.
  2. Overfør forsigtigt supernatanten til UC-rørene. Hvis der anvendes en fast vinkel rotor, markeres orienteringen af rørene i centrifugen for at lette genfinding af EV-pellet efter UC. Der centrifugeres i 2 timer ved 120.000 x gmed en k-faktor på 259,4.
  3. Efter UC skal supernatanten kasseres forsigtigt med en serologisk pipet for at undgå forstyrrelse af den pelleterede EVs.
    Bemærk: pellet kan være usynlig.
  4. Der tilsættes 200 μL af 0,2 μm-filtreret fosfat-buffer (PBS) til det første rør, og der anvendes PBS og den resterende supernatanten til at resuspendere pillen ved at pipette op og ned. Overfør den resulterende EV-suspension til det næste rør i den pågældende prøve, og brug den til opslæmning. Fortsæt på denne måde for at gensuspendere alle EVs-prøver i et endeligt volumen på ca. 300-350 μL.
  5. Efter resuspension, bekræfte tilstedeværelsen af partikler ved nanopartikel tracking analyse (NTA). Brug de indstillinger, der er optimeret for den givne EV-type, såsom nedenstående indstillinger (trin 2.5.1).
    Bemærk: papirerne fra gardiner et al.27 og vestad et al.28 indeholder værdifulde oplysninger om, hvordan parametrene til måling af evt optimeres.
    1. Brug instrumenter (f. eks. NanoSight LM14), der er udstyret med en grøn laser, til at gengive de nedenfor beskrevne resultater. Optag tre videoer af 30 s med en skærm gevinst på 1,0 og et kamera niveau på 13. Til analysebrug en skærm gevinst på 1,0 og en detektionstærskel på 5.
  6. Brug straks pellet, hvis det er muligt; ellers opbevares den ved 4 °C om natten.

3. glucuronidase indkapsling i EVs

  1. Til den resuspenderede pellet tilsættes beta-glucuronidase (10 mg/mL i PBS) til en endelig koncentration på 1,5 mg/mL og saponin (10 mg/mL i H2O) til en slutkoncentration på 0,1 mg/ml. Bland godt ved vortexning for 3 s.
  2. Inkuperer i 10 minutter ved stuetemperatur med indflettet blanding ved forsigtigt at svipere røret. Efter inkubation renses den direkte efter størrelses udelukkelses kromatografi (SEC) (se punkt 5).
    Bemærk: der må ikke genopfrigøres glucuronidasesystemer-prøver efter optøning for at forhindre enzym nedbrydning på grund af frysning.

4. liposome produktion

  1. For at forberede Liposomer til sammenligning med EVs, opløses 1, 2-dimyristoyl-SN-glycero-3-foshocholine (dmpc) og 1, 2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-FOSHOCHOLINE (dppc) i en 2:3 molær ration i chloroform til en slutkoncentration på 5 mm. Forbered 1 mL aliquoter i højtydende væskekromatografi (HPLC) hætteglas og lad dem tørre natten over for at danne en lipid film.
    Forsigtig: chloroform er giftig og mistænkes for at være cancerogent. Tag passende forholdsregler, når du håndterer det.
  2. Lipid-filmen rehydreres med 1 mL PBS, der indeholder 1,5 mg/mL glucuronidase. Den opvarmes til 42 °C og vortex i 1 min. Opvarm ekstruderen til 42 °C og Ekstruderer lipid suspensionen 11x gennem en 200 Nm polycarbonat membran. Renses direkte af SEC (Se afsnit 5).

5. rensning ved SEC

  1. Forbered SEC-kolonnen ved hjælp af følgende protokol.
    1. Brug kun frisk renset vand og frisk tilberedte buffere. Filtrer alle buffere gennem et 0,2 μm membranfilter og Degas dem for at forhindre dannelsen af luftbobler i kolonnen.
    2. Til fremstilling af en SEC-kolonne anvendes agopstået gel filtrerings baseret matrix (f. eks. Sepharose CL-2b) eller et andet SEC-medium, der er egnet til at adskille EVs og Liposomer fra protein urenheder og overskydende enzym. Fjern først den 20% EtOH-opløsning, mediet er lagret i, for at forhindre luftboble dannelse i kolonnen. Til dette formål centrifugeres SEC-mediet ved 3.000 x g i 10 min., Fjern EtOH, og Udskift det med afgasset vand.
    3. Fyld en glaskolonne (med en indvendig diameter på 10 mm) med SEC-mediet til 15 mL-mærket.
      Bemærk: diskenhederne vil variere for kolonner med forskellige dimensioner. Sørg for at lade gelen bosætte sig helt.
    4. Før en løbetur skal kolonnen kalibreres med mindst to kolonne volumener PBS. For at gemme kolonnen, skal du først vaske den med en kolonne volumen af vand, efterfulgt af mindst to kolonne volumener på 20% EtOH. Efter opbevaring vaskes søjlen først med en kolonne volumen af vand, inden den ækvilibrerer med PBS.
    5. Brug op til 400 μL EV eller Liposom suspension i én separation. Saml brøkdele af 1 mL. Efter SEC skal du enten opbevare den rensede evt (se punkt 7) eller underkaste dem en glucuronidasesystemer-analyse (se punkt 6).
  2. Bekræft adskillelsen af EVs og Liposomer fra kontaminerende proteiner og fri glucuronidase. Til dette formål korrelerer partikelkoncentrationerne af de indsamlede fraktioner med proteinkoncentrationen og glucuronidaseaktiviteten.
    1. Vurder partikelkoncentrationen ved NTA (Se 2,5)
    2. Vurder proteinindholdet ved bicinchoninsyre Acid (BCA) assay eller en anden egnet bestemmelse af protein kvantificering. Udfør analysen i henhold til producentens protokol.
    3. Vurder glucuronidaseaktiviteten ved glucuronidasesystemer-assay (se punkt 6).
  3. Valgfrit, vurdere EV morfologi ved transmission elektronmikroskopi (TEM) og scanning elektronmikroskopi (SEM).
    1. Til fremstilling af TEM-prøver tilsættes 10 μL EV-suspension til et TEM-gitter, inkube i 10 min., og derefter forsvinder eventuel overskydende væske ved hjælp af et filterpapir. Fiksation skal udføres i 10 min med 10 μL 4% PARAFORMALDEHYD og bort væk overskydende. Vask 3x med vand. Vesikler bliver plettede med 20 s inkubation med 30 μL 1% phosphor-tungstisk syre hydrat. Efter at have blottede den overskydende væk, tørre vesikler natten. Visualiser efter TEM.
      Forsigtig: phospho-tungstic syre er meget kaustisk; således beskytte hud og øjne.
    2. For SEM, fix de tidligere forberedte TEM prøver på Carbon diske og sputter dem med et 50 nm tykt guld lag. Visualiser ved SEM.

6. glucuronidaseanalyse

  1. For at muliggøre en sammenligning mellem forskellige prøver og opbevaringsforhold ved korrelation af partikelantal og enzymaktivitet skal man først måle partikelkoncentrationen i prøven af NTA (Se trin 2,5).
  2. Der tilberedes en fungerende opløsning af fluorescein di-β-D-glucuronid ved tilsætning af 1 μL af forbindelsen (10 mg/mL i H2O) til 199 μl PBS. Der tilsættes 25 μL af denne opløsning til 125 μL renset EVs for at opnå en slutkoncentration på 8,3 μg/mL. Prøven pipettages i en sort 96-brønd plade. Mål tidspunkt 0 h med en plade læser, ved hjælp af 480 nm som excitation og 516 nm som emission bølgelængde.
  3. Dæk pladen stramt (f. eks. med transparent plastfolie, der anvendes til PCR-plader) for at minimere fordampningen og inkube i mørke i 18 timer ved 37 °C. Mål fluorescein produktionen ved hjælp af de plade læser parametre, der er angivet i trin 6,2.

7. opbevaring af EVs og Liposomer

Bemærk: til alle opbevaringsformål er det tilrådeligt at bruge lav-bindende rør til at reducere EV tab på grund af adsorption.

  1. Følg parametrene i dette afsnit for at gengive de repræsentative resultater, der er angivet nedenfor. Brug prøver bestående af 400 μL EV suspension.
    1. Opbevares ved 4 °C eller-80 °C eller fortsættes til nedenstående trin.
    2. Lyophilize EVs.
      1. Der tilsættes trehalosedihydrat (40 mg/mL i H2O) op til en slutkoncentration på 4 mg/ml til den rensede evt. Prøverne fryses ved-80 °C i mindst 1 time.
      2. Lyophilize prøverne ved hjælp af følgende parametre. Til hoved tørring indstilles hylde temperaturen til 15 °C og trykket til 0,180 mbar og lader prøverne tørre i 46 h. Til endelig tørring indstilles hylde temperaturen til 25 °C og trykket til 0,0035 mbar og lad prøverne tørre i 2 timer. Opbevar de lyofiliserede prøver ved 4 °C.
      3. For at rehydrere prøverne tilsættes H2O, lig med mængden af EV suspension til stede i begyndelsen (typisk, 400 μl). Brug ikke nogen buffer til rehydrering.

8. analyse efter opbevaring

  1. For at vurdere enzymaktiviteten skal du først fjerne den frie glucuronidase, som kan have lækket fra evt under opbevaring. Opnå dette ved et ekstra rensningstrin, der udføres enten af SEC (Se trin 5) eller asymmetrisk flow Field-flow fraktionering (AF4) (Se trin 8.1.2).
    Bemærk: Vær opmærksom på, at begge metoder fører til fortynding af EV-prøven; derfor anvende tilstrækkelige EV-koncentrationer før opbevaring for at undgå at bevæge sig under NTA-kvantificeringsgrænsen. Forvent en 1:10 fortynding af partiklerne på grund af SEC eller AF4.
    1. Følg den ovenfor beskrevne protokol for SEC-rensning (Se afsnit 5).
    2. Udfør AF4 rensning.
      1. Indstil instrumentet ved hjælp af en lille kanal med en 350 μm spacer og en 30 kD molekylvægt cut-off cellulose membran. Anbring et filter på 0,1 μm porestørrelse mellem HPLC-pumpen og AF4-kanalen. Brug frisklavet 0,1 μm-filtreret PBS som den mobile fase til at reducere partikel belastningen og støjen i lyssprednings detektorer.
      2. Detektér proteiner ved hjælp af en UV-detektor indstillet til 280 Nm. For at detektere partikler, brug multiangle lys spredning med laseren indstillet til 658 nm.
      3. Brug følgende kørselsmetode. Pre-Focus i 1 min med en fokus strøm på 1 mL/min; Injicer derefter 300 μL af prøven med en hastighed på 0,2 mL/min, og hold fokus strømmen i 10 min. Efter injektionen elutes prøven ved 1 ml/min, mens der anvendes en tvær strømning, der falder fra 2 ml/min til 0,1 ml/min i løbet af 8 min. elueres i yderligere 10 min uden Cross Flow. Saml fraktioner af 1 mL, startende efter 12,5 min. og fortsætter indtil 27 min.
    3. Udfør glucuronidaseanalysen som beskrevet ovenfor (se punkt 6).
  2. Til vurdering af størrelse og koncentration anvendes NTA som beskrevet ovenfor (Se trin 2,5).
  3. Du kan eventuelt udføre TEM og SEM for at vurdere EVs ' morfologi efter opbevaring (Se 5,3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser opbevarings egenskaberne for EVS, der er isoleret fra HUVECs. EVs blev isoleret af UC, glucuronidasesystemer blev indkapslet, og efter SEC blev de rensede EVs evalueret for deres fysisk-kemiske egenskaber af NTA. En prøve af vesikler blev efterfølgende udsat for AF4 rensning, og glucuronidaseaktiviteten blev målt.

Vesikler blev derefter opbevaret i 7 d ved 4 °C eller-80 °C og ved 4 °C i lyofiliseret form, i sidstnævnte tilfælde med tilsætning af 4% trehalose. Efter oplagring blev vesikler igen målt ved NTA, og efter AF4 blev den resterende glucuronidaseaktivitet pr. partikel vurderet.

Arbejdsprincippet i AF4 er baseret på kombinationen af laminar flow og en ortogononal krydstrømning gennem den porøse membran i bunden af AF4 kanalen, som differentielt påvirker partikler i forhold til deres størrelse (figur 2). Større partikler har tendens til at være placeret tættere på membranen, mens mindre partikler er placeret længere oppe i kanalen. På grund af den parabol flow profil af laminar flow, partikler længere væk fra membranen rejse hurtigere mod detektoren, hvilket fører til en partikel-separation efter størrelse. I et typisk AF4-eksperiment er de injicerede partikler først fokuseret på membranen ved at anvende en tvær strømning uden et langsgående flow gennem kanalen (figur 2a). Efter injektion og fokusering, starter eluering ved samtidig at anvende en cross flow og en langsgående strøm til fraktionering og eluere de forskellige undergrupper af partikler (figur 2B), som i vores tilfælde var EVS og fri glucuronidase.

Figur 3 illustrerer separationen af nanopartikler (EVS eller Liposomer) fra kontaminerende proteiner og nonencapsulated glucuronidase. SEC-eluerings profilen for Liposomer (figur 3a) renset efter tilberedningen (Se afsnit 4 i protokollen) viste separationen af partiklerne med indkapslet glucuronidasesystemer fra det frie enzym, DETEKTERET både gennem BCA-assay og enzymaktiviteten. I det foreliggende eksempel vil fraktion 6 og 7 blive udvalgt til yderligere forsøg, da de indeholder de højeste partikelkoncentrationer og forhindrer mulige kontamineringer med fri glucuronidase. AF4 havde også held til at adskille EVs fra fri glucuronidasesystemer som påvist i figur 3Bmed en højere ADSKILLELSES grad end SEC, hvilket gjorde kontaminering af fraktioner, der indeholder vesikler, mindre sandsynlig.

I figur 4blev der udført et kontrol eksperiment for at sikre, at den enzymaktivitet, der blev målt for vesikler, faktisk var forbundet med indkapsling af glucuronidasesystemer i EVS og ikke forårsaget af enzym aggregater. Disse aggregater kan være dannet på grund af Inkubationen af glucuronidasesystemer med saponin og føre til falsk positive resultater. For at verificere de fraktioner, hvor vesikler elueres, blev rensede EVs uden indkapslet glucuronidasesystemer udsat for SEC på samme kolonne som den prøve, der blot indeholdt saponin og enzymet.

Når glucuronidasesystemer blev inkueret med saponin og efterfølgende renset af SEC, blev der ikke fundet nogen enzymaktivitet i de fraktioner, der typisk indeholder EVs. Mens små mængder af partikler blev fundet at elueres på samme tid som EVS (der udgør < 0,1% af partiklerne genvundet fra en typisk EV-pellet), var der ingen korrelation enzymaktivitet. Disse resultater indikerer, at aktivt enzym, der blev genvundet i fraktioner indeholdende vesikler, var indkapslet i dem.

Figur 5 sammenligner genfinding af aktivt enzym efter opbevaring med eller uden yderligere AF4 rensning for at fjerne ikke-indkapslet farvestof. Med AF4 rensning er der generelt en lavere restitution af enzym pr. partikel, med den højeste effekt til opbevaring ved 4 °C, hvor genvinding falder med to tredjedele. Derfor kan udeladelse af dette ekstra rensningstrin føre til forkerte antagelser om enzym stabiliteten.

Figur 6 viser effekten af lyofilisering uden kryoprotectant på vesikler afledt af MSC'er, A549-celler og Liposomer sammenlignet med frysning ved-80 °c. Partiklerne blev indlagret ved TEM og SEM som beskrevet ovenfor (Se trin 5,3 i protokollen). MSC'erne og A549 EVs udviste ikke store forskelle i form i TEM-billeder, hvilket sammenlignede de to opbevaringsforhold. I SEM billeder, dog, de lyofiliserede prøver viste aggregater ikke findes i-80 °C prøver. Liposomer viste også aggregater i SEM billede, mens i tem, lyofilisering syntes at fremkalde en størrelse stigning af Liposomer. Lyophilization uden kryoprotectanter reducerede også genfinding af intakt glucuronidasesystemer efter opbevaring (figur 7). Tilsætning af trehalosedihydrat som kryoprotectant forøgede genopretningen af det aktive enzym på en dosisafhængig måde.

Figur 8 viser omdannelsen af fluorescein di-β-D-glucuronid til fri fluorescein, som finder sted i glucuronidasesystemer-analysen. Mens educt var ikke-fluorescerende på 516 nm, fluorescein er meget fluorescerende på denne bølgelængde. Dette tillod en enkel enzymaktivitet assay med høj følsomhed.

Figure 1
Figur 1 : Opbevarings stabilitet for HUVEC EVS. A) partikel genvinding sammenlignet med før oplagring, (b) gennemsnitlig størrelse, og (C) den normaliserede glucuronidasesystemer-aktivitet pr. partikel af EVS, der er isoleret fra huvecs. Vesikler blev opbevaret i 7 d ved 4 °C og-80 °C og ved 4 °C efter lyofilisering med 4% trehalose. Den gennemsnitlige størrelse og partikel genvinding blev målt ved NTA. glucuronidaseaktiviteten pr. partikel blev beregnet ved at kombinere NTA-data og resultaterne af glucuronidaseanalysen og normaliseret til før opbevaring. Middel ± SD, n = 3, *p < 0,05 (envejs-ANOVA efterfulgt af tukey's post hoc-test). Ændret fra Frank et al.21. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Arbejdsprincip i AF4. (A) EVS og fri glucuronidasesystemer er fokuseret efter injektion ved at anvende en cross flow. (B) bagefter Elupes EVS og det frie enzym separat ved at kombinere flowet gennem kanalen med en tvær strømning. Ændret fra Frank et al.21. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Adskillelse af EVS og Liposomer fra fri glucuronidase. A) repræsentativ SEC separation af glucuronidase-loaded Liposomer, fri glucuronidase og protein kontaminanter. Grafen viser partikelkoncentrationen (rød), proteinkoncentrationen (blå) og glucuronidasesystemer aktivitet (grøn). B) påvisning af adskillelse af EVS fra fri glucuronidase. Ubehandlede EVS, EVS spidse med 0,05 mg/ml glucuronidasesystemer, fri glucuronidasesystemer (0,5 mg/ml) og EVS lastet med glucuronidasesystemer og renset af SEC (EV glucuronidasesystemer) blev injiceret og analyseret af UV ved 280 Nm og 90 ° let spredning. Frit enzym elueret separat fra EVs. Ændret fra Frank et al.21. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Kontrol eksperimenter til rensning af EVS fra fri glucuronidase. 400 μL af Native EVs eller 400 μL af 1,5 mg/mL glucuronidasesystemer i PBS inkueret i 10 min med 0,1 mg/mL saponin blev renset ved SEC. (a) partikelkoncentrationer af de indsamlede fraktioner af vesikler og glucuronidasesystemer henholdsvis og enzymaktiviteten af den rensede glucuronidase. B) UV-absorption ved 280 Nm målt i samme forsøg. Den første lille top for glucuronidasesystemer svarer til den grå linje i panel A. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Effekten af yderligere rensningstrin efter EV-opbevaring. Resterende glucuronidaseaktivitet pr. partikel sammenlignet med d0 med eller uden yderligere AF4 rensningstrin efter opbevaring. HUVEC EVs blev opbevaret i 7 d ved 4 °C eller-80 °C og lyofiliseret med 4% trehalose. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Tem-og SEM-billeder af evt. TEM og SEM billeder af EVs fra (a) MSC'er og (B) A549 celler og (C) Liposomer. Prøverne blev opbevaret i 14 d ved-80 °C eller lyofiliseret uden tilsætning af trehalose. Pilene indikerer tilstedeværelsen af morfologisk ændrede partikler i TEM billeder og aggregater i SEM billeder. Ændret fra Frank et al.21. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Virkningen af trehalosedihydrat på enzym genvinding efter lyofilisering. Sammenligning af enzymaktiviteten efter lyofilisering i 14 dage, med 0%, 1% og 4% trehalosedihydrat med prøven før opbevaring (0 dage). Ændret fra Frank et al.21. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : Den enzymatiske spaltning af fluorescein di-β-D-glucuronide af glucuronidase. I ordningen forklares den reaktion, der ligger til grund for påvisning af glucuronidasesystemer. Ikke-fluorescerende fluorescein di-β-D-glucuronid er kløvet af glucuronidase. Gennem fjernelsen af sukker rester genvinder fluorescein dens fluorescerende egenskaber. Den fluorescens, der måles efter inkubationstiden, korrelerer med mængden af aktivt enzym, der er til stede, og er udlæsningen af glucuronidaseanalysen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskript præsenterer vi en omfattende protokol til undersøgelse af elevs stabilitet under forskellige opbevaringsforhold. Med kombinationen af indkapslet glucuronidasesystemer som en funktionel udlæser og evaluering af de fysisk-kemiske parametre for EVs, giver protokollen mulighed for en enkel opbevaring stabilitet vurdering af EVs og sammenligningen af EVs fra forskellige celle Linjer. SEM og TEM som komplementære metoder giver indsigt i ændringer af EVs på enkelt partikel niveau. De her fremlagte resultater viste en tendens til, at EVs og Liposomer blev aggregeret på grund af lyofilisering uden kryoprotectant (figur 6). Dette blev dog kun observeret i SEM eksperimenter. Mens EM-scanning ikke blev udført med prøver, der blev bevaret med trehalose, tyder litteraturen på, at dette kryoprotectant faktisk kan reducere aggregeringen af EVs29. Det er også muligt at vurdere, hvis en given opbevaringstilstand differentialt påvirker EV størrelse, inddrivelse sats og indkapslet molekyler. En sådan virkning er eksemplificeret ved de resultater, der er opnået for HUVEC EVs (figur 1). Mens partikel genfinding for 4 °C og-80 °C var bedre end for de lyofiliserede prøver, var genfinding af aktiv indkapslet glucuronidasesystemer bedst for de lyofiliserede prøver. Lyofilisering af EVs kunne være den mere gunstige opbevaringstilstand, for eksempel ved analyse af EV-biomarkører, hvor fokus er mere på at opnå og bevare intakt ladning i stedet for på intakte vesikler.

I deres nylige avis om lyofilisering af EVs22fulgte charoenviriyakul et al. en sammenlignelig fremgangsmåde. Med hensyn til de fysisk-kemiske parametre, fokuserede de på polydispersitet Index (PDI) og Zeta potentialet, som ændringer i zeta potentiale kan korrelere med reduceret kolloid stabilitet. Dog kan Zeta potentialet ikke alene forklare observerede ændringer i stabiliteten30, hvilket også afspejles i deres resultater. De sammenlignede også protein-og RNA-indholdet i de lagrede EVs med polyacrylamidgel-elektroforese. Denne teknik kan meget vel indikere væsentlige ændringer i indholdet af protein eller RNA i vesikler. Men det kræver meget større mængder af materiale end den metode, der præsenteres her. For at vurdere effekten af oplagring på EV-lasten, udtrykte Charoenviriyakul et al. heterologously et enzym og DNA-arter hver i deres EV-producer cellelinje og overvågede deres aktivitet og integritet i EVs. Et sådant heterologt udtryk er imidlertid ikke egnet, hvis EVs fra forskellige kilder skal sammenlignes, da det kræver en betydelig mængde tid for hver ny cellelinje, mens den simple saponin-medierede indkapsling let kan anvendes.

Det er afgørende at fjerne ethvert ikke-indkapslet enzym, som vist i figur 3. EV-Encapsulated glucuronidasesystemer reagerer meget langsommere med sit substrat end frit enzym i opløsning, hvilket fører til en overvurdering af indkapsling effektivitet. Ren adskillelse er især vigtig for analysen efter opbevaring, da opbevaringsbetingelserne kan påvirke aktiviteten af fri glucuronidasesystemer i prøven på en anden måde og kan føre til lækage fra beskadigede evt. Dette var tydeligt i vores eksperimenter (figur 5), da anvendelsen af AF4 før glucuronidaseanalysen formåede at fjerne farvestoffer, der ikke var indkapslet i vesikler. Således, det gjorde det muligt at få klare resultater om virkningen af de opbevaringsmetoder diskuteret her, mens uden AF4, aktivitets tabet på grund af oplagring ville have været undervurderet.

Et andet vigtigt hensyn er isoleringen og karakteriseringen af de evt, der skal testes for deres stabilitet. Selv om den beskrevne teknik muliggør sammenligning af evt fra forskellige kilder, er dette kun muligt, hvis de alle er fremstillet efter samme isolationsmetode, så resultaterne ikke forvrides18,31,32. I denne sammenhæng skal der også tages hensyn til celle kulturens forhold, da de kan påvirke mængden og bioaktiviteten af de isolerede EVs33. For at opnå resultater, der kan sammenlignes med andre offentliggjorte resultater, er det tilrådeligt at konsultere den nyligt opdaterede "minimal information for undersøgelser af ekstracellulære vesikler", der indeholder retningslinjer for harmonisering af EV forskning26.

I protokollen præsenteret her, vi brugte SEC eller AF4 for at fjerne det frie enzym efter opbevaring. Andre metoder kan anvendes, såsom gradient ultracentrifugering, UC, eller ultrafiltrering34. Sammenlignet med centrifugal metoder er SEC og AF4 mindre tidskrævende (f. eks. ca. 1,5 h for SEC, herunder kolonne ligevægt i forhold til op til 16 timer eller mere for gradient UC), og de kan helt adskille frie proteiner fra EVs i forhold til normal UC, hvor der altid rester supernatanten med pellet. Desuden, SEC15 og AF435 er milde metoder, som inducerer mindre forskydnings stress på evt. Til sammenligning kan de styrker, der pålægges EVS i løbet af UC, føre til ændringer af partiklerne, såsom aggregering og ændringer i størrelse34,36.

En ulempe ved SEC og AF4 er fortynding af prøverne. Det er således nødvendigt at isolere tilstrækkelige mængder af evt til at opretholde de koncentrationer, der kræves til NTA-målinger efter flere rensningstrin. EV-fraktioner kan koncentreres ved hjælp af centrifugal filtre, men afhængigt af Filtermaterialet og protokollen kan der være et tab af vesikler37.

Begrænsningen af den protokol, der diskuteres her, er, at den kun overvåger enzymaktiviteten af eksogent indkapslet glucuronidase, der hverken tager hensyn til indkapslet RNA og DNA eller EV-overflade proteiner, der kan være vigtige for funktionaliteten18 . Til forskning af nye EV-terapeutika, denne teknik kan ikke erstatte analyser om funktionalitet, men komplimentere dem og give en indikation om vesikel stabilitet. Det kunne være til stor nytte, hvis f. eks., at EVs, der er afledt af biofluider, skal oplagres til senere analyse af deres vesikel indhold.

I fremtiden kan denne protokols anvendelsesområde udvides til også at omfatte evt, der er afledt af andre organismer, f. eks. En anden interessant næste skridt ville være at teste indkapsling af nukleinsyre ved saponin inkubation og til også at se på stabiliteten af DNA eller RNA Cargos.

Konklusionen er, at denne procedure er en enkel metode til at vurdere opbevarings stabiliteten for eldrevne køretøjer fra forskellige pattedyrsceller ved at integrere både en fysisk-kemisk og en funktionel udlæser. Denne detaljerede protokol vil give EV-forskere mulighed for at bestemme passende opbevaringsbetingelser for deres vesikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

NanoMatFutur Junior Research program fra Forbundsministeriet for uddannelse og forskning, Tyskland (Grant nummer 13XP5029A) støttede dette arbejde. Maximilian Richter blev støttet af Studienstiftung des deutschen Volkes (German Academic Scholarship Foundation) gennem et Ph.D. stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) Sigma-Aldrich P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) Sigma-Aldrich P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks Corning 431082 Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane Wyatt Technology Europe 1854
350 µm spacer Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase Sigma-Aldrich G7646-100KU
Chloroform Fisher scientific C/4966/17
Column oven Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector  Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm Merck VVLP04700 Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3156 Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec Wyatt Technology Europe
EGM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3162 Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers R&D Systems DY992 used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol Fisher scientific E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block Avanti Polar Lipids 610000-1EA
Filter support Avanti Polar Lipids 610014-1EA used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide Thermo Fisher Scientific F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36 Thermo Fisher Scientific 18912014
Hettich Universal 320 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells Lonza Verviers, S.p.r. C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM Kimble 420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR international 525-0255 the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1 Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes Whatman/GE Healthcare 110406 used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate Sigma-Aldrich 79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation Beckman Coulter 355622
QuantiPro BCA Assay Kit Sigma-Aldrich QPBCA-1KT
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b GE Healthcare 17014001
SEM copper grids with carbon film Plano S160-4
Small AF4 channel Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor Beckman Coulter 339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K Beckman Coulter
UV detector Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter Whatman/GE Healthcare 10401712 Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
  2. Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
  3. Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
  4. György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
  5. Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
  6. Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
  7. Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
  9. Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
  10. Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
  11. Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
  12. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  13. Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
  14. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
  15. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
  16. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  17. Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
  18. Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
  19. Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
  20. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
  21. Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
  22. Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
  23. Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
  24. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  25. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
  26. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  27. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
  28. Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
  29. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
  30. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  31. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
  32. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  33. Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
  34. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
  35. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  36. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
  37. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).

Tags

Bioteknik ekstracellulære vesikler exosomer opbevarings stabilitet enzym indkapsling lyofilsering frysetørring asymmetrisk flow felt-flow fraktionering
Vurdering af opbevarings stabiliteten af ekstracellulære vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, … More

Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, G. Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (147), e59584, doi:10.3791/59584 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter