Summary
神経伝達物質の変化は、脳震盪後に発生し、時には壊滅的な長期的な結果に貢献する神経機能障害のメカニズムです。このラットモデルは、微小透析を組み合わせ、生体内神経伝達物質の定量を可能にし、ヒト頭蓋脳外傷の重要な要因である頭部および胴体の急速な加速および減速を行う重量降下技術を用いる。
Abstract
持続的な認知症状および運動症状は、脳震盪/軽度の外傷性脳損傷(mTBE)の既知の結果であり、部分的に神経伝達の変化に起因する可能性がある。実際、げっ歯類における脳微小透析研究は、外傷後最初の10分以内に海馬における過剰な細胞外グルタミン酸放出を実証した。微小透析は、動物を犠牲にする必要がなくても、生体内神経伝達物質連続サンプリングの明確な利点を提供します。前述の技術に加えて、頭部および胴の急速な加速および減速を発揮する閉鎖的な頭部外傷モデルは、そのような要因が他の多くの動物モデルで利用できないように必要とされる。ウェイン状態の重量降下モデルは、人間の頭蓋脳外傷のこの必須成分を模倣し、体重が減少している拘束されていないげっ歯類の頭部への衝撃の誘導を可能にする。私たちの新しいラットモデルと翻訳ラットモデルは、脳微小透析とウェイン州体重減少モデルを組み合わせて、軽く麻酔を受け、拘束されていない成人ラットで、脳震盪後の細胞外神経伝達物質レベルの急激な変化を研究します。このプロトコルでは、微小透析プローブを対象領域として海馬内に挿入し、衝撃で脳内に挿入した。海馬には末端と受容体の密度が高く、脳震盪後に神経伝達が変化したことを文書化するのに関連する領域です。成体スプラーグ・ドーリーラットに適用された場合、我々の組み合わせモデルは、最初の10分以内に海馬細胞外グルタミン酸濃度の増加を誘発し、以前に報告された脳震盪後の症状と一致した。この組み合わせ体重減少モデルは、このプロトコルは、閉じた頭部軽度の外傷を誘発するので、反復的な脳損傷に加えて、脳震盪に対する早期の治療応答を研究するための信頼性の高いツールを提供します。
Introduction
この方法の目的は、脳震盪/軽度の外傷性脳の分子効果の縦方向の特徴付けを可能にしながら、ヒト頭蓋脳外傷のバイオメカニクスを忠実に再現する信頼性の高いツールを研究者に提供することです。傷害(mTTIS)。この方法は、脳微小透析とウェイン状態の体重減少モデルを組み合わせて、軽く麻酔を受け、拘束されていない成人ラットにおいて、脳震盪後の細胞外神経伝達物質レベルの急激な変化を文書化する。この最小限に侵襲的な方法では、グルタミン酸、GABA、タウリン、グリシン、セリンなどの神経伝達物質は、動物を犠牲にする必要がなくても、生体内の外傷後に迅速かつ継続的に定量化することができる。
脳震盪/mTBIは、外力機構によって引き起こされる脳機能に影響を与える病態生理学的破壊である。脳震盪/mTBIは外傷性脳損傷の最も一般的な形態であり、症例1の70〜90%を占める。脳震盪後の急性機能障害のほとんどは、一次および二次脳損傷2、3:(1)頭部および胴体の急速な加速および減速によって引き起こされる第一次脳損傷に起因する可能性がある。これは、バックラッシュ4、5、6および(2)二次脳損傷の間に軸の伸張とせん断が続く圧縮によって脳組織を損傷する外傷に対する間接的な細胞応答である。これは、一次脳損傷の数時間と数日後に起こり、時間の経過とともに観察される運動および認知障害で重要な役割を果たしています。症状の多くは、傷害7、8、9に続く最初の10分で過剰な細胞外グルタミン酸放出を以前に実証したような神経伝達の変化に起因しうる。末端および受容体の密度が高いことを考えると、海馬は傷害後のこの興奮毒性反応に特に脆弱な脳構造である。認知機能10,11に深く関与しているげっ歯類の研究は、脳震盪に関連する海馬の損傷が恐怖の調節と空間記憶の学習の障害につながる可能性があることを報告しました 12,13.この方法論の主な目的は、ウェイン州閉鎖頭体重降下手順を使用して、一次脳損傷のメカニズムを忠実に再現し、脳を組み込む、脳震盪/mTBIのラットモデルを解明することです。生体内で研究する微小透析は、脳震盪後の二次脳損傷に起因する急性細胞外神経伝達物質の変化である。細胞外グルタミン酸およびGABAの濃度を海馬で測定し、我々の方法の代表的な結果として作用した。
これまでのげっ歯類研究では、微小透析と、頭蓋骨の体重減少や皮質影響の制御など、他の損傷モデルを組み合わせて、様々な重症度の損傷に続く細胞外神経伝達物質レベルの急激な変化を実証してきました。度14,15,16,17.しかし、高い変動性に加えて、オープンスカルの体重減少や制御された皮質の影響のようなモデルの翻訳値は、2つの要因による生態学的妥当性の本質的な欠如によって妨げられています:(1)これらのモデルは傷害を多く誘発します。直接脳の負荷を伴うスポーツ関連の脳震盪よりも重篤であり、(2)これらのモデルは、頭蓋骨切除術または開頭術を必要とし、げっ歯類の頭部はステレオタックスフレームで完全に拘束され、急速に障害を引き起こす頭部および胴体の加速および減速は、したがって、脳震盪のバイオメカニクスを不十分に再現する。
微小透析は、グルタミン酸、GABA、タウリン、グリシン、セリンなどのサンプリング神経伝達物質の明確な利点を提供する最小限に侵襲的な方法であり、生体内および継続的に外傷に続き、動物を犠牲にする必要はありません。微小透析によって提供される利点に加えて、ウェイン州立大学は(他のモデルからのオープン頭蓋骨とは対照的に)閉じた頭蓋骨の重量降下モデルを開発し、軽く麻酔され、拘束されていないげっ歯類にmTBIを誘導することを可能にする。したがって、頭部および胴部18の急速な加速および減速を可能にする。前述したように、頭部と胴体の加速と減速は、以前のげっ歯類mTBIモデルが対処できなかったヒトに見られるスポーツ関連脳震盪の中核的な生体力学的特徴である。重量降下のプロシージャは非常に速く行うことができ、前の外科か頭皮の切開を要求しない。脳震盪の誘発後、げっ歯類はほとんど自発的に右反射を回復し、単一の衝撃の後に麻痺、発作または呼吸困難を経験しない。頭蓋内出血や頭蓋骨骨折はまれであり、運動協調のわずかな欠陥のみがげっ歯類で報告されている。このラットモデルは、使用が容易で安価であり、衝撃中に微小透析プローブを除去することなく、脳震盪後の急性期に放出される神経伝達物質の定量を容易にする。
微小透析と脳震盪を組み合わせたラットモデルは、脳震盪の分子効果を縦方向に特徴付けようとする研究者に適しており、幅広い治療研究に使用できます。確かに、数年間の研究と圧倒的な必要性にもかかわらず、脳震盪の長期的な影響を防ぐ薬剤は臨床試験フェーズ19を通過していない。これらの失敗の潜在的な理由の一つは、人間が経験したように脳震盪の外傷性生体力を忠実に再現しない動物モデルの使用である可能性があります。ここで提示される方法は、一次脳損傷が鈍い衝撃だけでなく、頭部および胴体2、3の急速な加速および減速によって誘発されることを指定するヒト脳震盪の定義を満たす。
さらに、脳震盪の他の動物モデルとは一部離れてそれを設定する主な特徴の一つは、誘発することが可能であるということを、繰り返し軽度の外傷性脳損傷(rmTBI)の効果を研究する研究者に適しています。同じ場合に繰り返し、軽度の傷害18.ヒトにおいて、rmTBIは、より重篤な外傷後症状、より長い回復時間、および時間20、21の間に広がる傾向がある悪化した運動および認知障害に関連している。他の関連する動物モデルはまた、rmTBI22、23、24、25、26、27の外傷後病態生理学をよりよく理解することを可能にした.脳の脆弱性の増加は、24時間間隔で最低5 mTBIの後にげっ歯類で実証されている。神経炎症はmTBI経験の数と共に増加し、神経変性のマーカーが28に現れる。繰り返しmTBIは、炎症モードから正常な回復モードへのミクログリアの移行を防止し、長期の興奮毒性活性および神経変性メカニズムの活性化をもたらす29。我々のモデルでは、ラットは1週間の間に1日あたり1回の衝撃にさらされ、合計5回の暴露を受ける可能性がある。この動物モデルの簡易性を考えると、mTBI直後に生じる急性無差別神経伝達物質放出の累積的効果の特徴付けを容易にすることができる。
このモデルはまた、動物が1日あたり2つの衝撃に容易にさらされることを可能にし、選手が最初の打撃30から短時間で別の外傷性の影響を受けたときのようなより厳しい条件を研究することを可能にする。前の研究31で示されるように、頭部への第2の打撃のタイミングは、血管および軸上の損傷に劇的に影響を与えることができる。2回目の打撃が最初の一撃に近いほど、結果はより大きくなります。このモデルは、この特定の条件が細胞外神経伝達物質の放出に影響を与える方法を調査するために適切です。.
この方法では、海馬は脳震盪研究の関連性のために関心のある領域として使用されたが、微小透析サンプルは、同様に関心のある他の領域から収集することができる。しかし、他の脳領域は、ガイドカニューレの衝撃部位が残したスペース(それを取り巻く歯科セメントを含む)がラットの頭部にかなりのスペースを占める可能性があることを考慮する必要があります。これに加えて、膜の分子量カットオフや活性長さなどのこの方法で提示される微小透析パラメータ、サンプリング時間間隔、流量は、研究した分子の種類に応じて調整することができる。例えば、脳震盪に関与する炎症性サイトカインの効率的なコレクションは、はるかに大きな細孔サイズの膜を必要とするであろう。
Protocol
このプロジェクトの動物プロトコルは、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って、ホピタル・デュ・サクレ・クール・ド・モントリオールの動物ケア委員会の承認を得ました。
注: 研究プロトコルの概略的な概要を図1に示します。
1. 動物の準備
- 標準的な実験動物サプライヤーからスプラーグ・ドーリーラットを注文し、生後43~50日の間、体重は151~200gです。
- 12:12 h光のサイクルで個々にすべてのラットを収容:暗闇、水と食べ物へのアドリビタムアクセスと24-26 °Cで。
- プロトコルを開始する前の2週間の間に、研究者と接触して彼らの習慣を容易にするために、毎日5分間ラットを処理します。ラットは生後約10週間で、その体重は脳震盪または偽の傷害誘導時に295〜351gの間でなければなりません。
2. 微小透析ガイドカニューラ移植手術
- 無菌条件下で手術を行う。無菌手袋、ヘアボンネット、外科用マスクを着用してください。オートクレーブと事前にすべての材料や手術器具を殺菌します。エタノール(70%)の溶液で作業領域と立体装置を徹底的に洗浄し、消毒します。
- ケタミン(70mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)のカクテルを経口に注入して動物を麻酔する。つま先のピンチに反射をテストすることにより、麻酔の深さをアセス。
- 電気バリカンを使用して動物の頭から毛皮を取り除きます。2%イソプロピルアルコールと2%クロルヘキシジングルコン酸(3回)の溶液を使用して、きれいに剃った頭部。乾燥を防ぐために麻酔中に潤滑目のチントを適用します。
- 動物の頭部だけが露出できるように外科場をドレープオフする。ラットの頭部を立体装置に入れ、耳道に耳棒を入れ、鼻クランプを締めます。26 G ステンレススチールガイドカニューレを立体装置のホルダーアームに固定します。
- 局所的にブピバカイン(1.5 mg/kg)とリドカイン(1.5mg/kg)の麻酔カクテルを頭部に皮下注射し、切開の10分前に注射する。
- イソフランナトリウムを送送ることによって全体の手順の間に麻酔を維持する(2.5%)0.5 L/minの酸素の流れでノーズコーンが付いている。
- メスで頭皮に沿って中線切開(3センチメートル)を作ります。切開部の周りに4クランプを取り付けることで、頭蓋骨をクリアしたままにしておきます。
- ブレグマとラムダの縫合糸が見えるまで、頭蓋骨から骨膜を外科ブレードでしっかりと擦り取ります。出血がある場合は、ガーゼパッドまたは綿先端アプリケータで頭蓋骨にしっかりと圧力を維持します。
- ブレグマ縫合糸とラムダ縫合糸の背部音節座標を比較して、頭蓋骨がステレオタキスティック装置上で正しく位置合わせされているかどうかを確認します。ガイドカニューレの座標の基準点として、ブレグマ縫合線の前背部、平背部およびドルソベントラ座標座標を識別します。
- Bregma縫合座標を参照として取り、海馬におけるガイドカニューレ移植部位の座標を計算する。
注:以下の座標は、パキシノスとワトソンのラット脳アトラスに従って決定された(前置語:-0.60 cm;平行体:±0.58 cm;ドルソベンテラル:-0.16 cm、図2A)32。 - マーカーを使用して正確な注入部位をマークします。
- ガイドカニューレの標的部位で頭蓋を通して0.5mmの穴を開けます。この点の周りに約5mmの他の穴を開け、アクリル歯科セメントを塗布した後にカニューレを固める3本のアンカーネジを頭蓋骨に通します。
- 海馬にカニューレを挿入し、歯科セメントでそれを固定します。このカニューレは、微小透析手順の7日後に目的の領域にプローブを挿入するために使用されます。重量が落ちる場所の周りに余分な歯科用セメントがこぼれないように注意してください。
- セメントを2分間乾燥させたままにしてから、カニューレからホルダーアームを取り外します。脳脊髄液の浸透と感染のリスクを避けるために、カニューレにステンレス鋼除去可能な観察器を挿入します。
- 4クランプを取り外し、引き込まれた皮膚を引き戻し、外科縫合糸4-0で縫い合わせる。
- 装置からラットを取り出し、痛みを治療するために皮下にブプレノルフィンを注入する(0.05mg/kg、手術後、次の2日間に1日1回)。げっ歯類を意識するまで加熱パッドでケージに戻し、7日間の回復期間を動物介護施設に戻します。
3. 微小透析手順
- 微小透析手順を行っている間、無菌手袋、ヘアボンネットおよび外科マスクを着用する。カニューレ移植手術後7日間、イソフランナトリウムでラットを麻酔する(2.5%)0.5 L/分の酸素の流れで。
- カニューレから閉塞器を取り外し、人工脳脊髄液(ACSF)を注入した微小透析プローブ(26 mmol/L NaHCO3、3mmol/L NaH2 PO4、1.3mmol/L MgCl 2、2.3 mmol/L CaCl2、3.0)mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0.2 mmol/L L-アスコルビン酸), 海馬または他の目的の領域にカニューレを介して.
注:ラットは、観察器を取り外し、微小透析プローブを挿入する間、および脳震盪または偽の傷害の誘導中にのみ麻酔する必要があります。ここで使用されるプローブは、実験室で構成されたI字型で、ポリエチレンチューブ(ID:0.58-0.38 mm)に包まれた融合されたサイドバイサイドシリカ入口出口ライン[内径(ID):50 μm]で構成されています。カニューレの端部は、再生中空セルロース膜の長さで固定されています [分子量カットオフ: 13 kDa, 外径 (OD): 216 μm;ID:200 μm]シアノアクリレート接着剤とエポキシで密封された先端を使用する。活動的な膜は海馬の注入のために2.5 mmを測定するが、目的の領域の深さに従って調節することができる。プローブへのラットの留置カニューレの接続は、フィットした、スレッドステンレススチールカラーで固定されています。 - プローブアセンブリを液体スイベルにつなぎ、ケージの上に吊り下げられたカウンターバランスレバーアームをリングスタンドとクランプで固定し、動物がケージ内を自由に動かすことができるようにします。テザリングラットは、水と食物へのアドリビタムアクセスと微小透析手順の全期間を費やす。
- マイクロ注入ポンプを使用してプローブに噴霧を送り、融合シリカ出口ライン(デッドボリューム:0.79 μL)から透析液を収集します。
- プロシージャが始まる前に少なくとも1時間30分、プローブを作動流量(1 μL/min)に上げてください。ピペットを使用して時間の経過と共に体積を測定することにより、プローブの流量が一貫していることを確認します。
注:流量は、サンプリングされた神経伝達物質と目的の脳領域に応じて多かれ少なかれすることができます.透析サンプルは、脳震盪または偽の傷害誘導の前、中、および後に採取される。サンプリング間隔は、対象の脳領域、分析される神経伝達物質、分析物の透析濃度、および使用される分析化学装置の感度に依存する。グルタミン酸とGABAサンプリングのための海馬でここで行われた収集段階は次のとおりです。
1.ベースライン:実験開始時に、透析サンプルを10分間隔で60分間収集します。
2.脳震盪後または恥ずかしい傷害:脳震盪または偽の傷害の後、追加の90分(9サンプル)のためのサンプルを集める。 - 各透析液を0.25モル/L過塩素酸の1 μLをプリロードした分数バイアルで収集し、検体の劣化を防ぎます。その後の分析のために4°Cでサンプルを保存します。
- 最後の透析液サンプルの採取に続いて、イソフランナトリウムを送り出す鼻コーンでラットを再麻酔する(2.5%)0.5 L/分の酸素の流れで。
- カニューレから微小透析プローブを取り出し、オブチュレータを再挿入し、ラットを動物介護施設に戻します。
4. 脳震盪装置の設置
- 手順の開始前に、固体真鍮から脳震盪(直径19ミリメートル)を与えるために使用される重量を彫り、450 gの質量を得るために真鍮重量の上部に金属ループを挿入します。垂直ポリ塩化ビニル(PVC)ガイドチューブ内の1.0mの距離で予備の穴を開けます。
- 鋭いかみそり刃でアルミシートをスリットします。スロットアルミシートは、真鍮の重量からの頭部衝撃後の体の加速を妨げることなく、ラット(295~351g)の重量を支える必要があります。
- スロット付きアルミシートをU字型のプレキシグラスフレーム(長さ38cm×幅27cm×奥行き30cm、図3A、B)にしっかりとテープを貼り付け、泡クッション(長さ37cm×幅26cm×奥行き12cm)を使用します。
- プレキシグラスフレームをPVCガイドチューブ(直径20mm×長さ1.5m)の下に配置します。
- PVCガイドチューブを、スロット付きアルミの上に3.5cmのクランプスタンドで固定します。
- 金属ループを通してナイロンフライフィッシングライン(容量9.1kg、直径0.46mm)を取り付け、ラットが衝撃に続いて泡クッションに落ちたときに複数のヒットを防ぐために、重量の底部がスロットアルミの上に2.5センチメートルハングアップするようにします。
- ナイロンフライフィッシングラインをクランプスタンドに取り付けます。
- ナイロンフライ釣りラインでPVCチューブを介して重量を引き上げ、1.0 mで予備掘削穴を通して六角キーを挿入することにより、所定の位置に保ちます。
5. 脳震盪誘導
- 透析サンプル採取のベースライン段階の後、イソフランナトリウムを送送る鼻コーン(0.5L/min酸素流量で2.5%イソフラン)を入れてラットを軽く麻酔し直します(セクション3.1で述べたように)。
- その頭が真鍮の重量のパスに直接置かないように、スロット付きアルミシートの上に動物を胸に置きます(図3C,D)。鼻コーンで麻酔を維持し、体重が当たる前にラットが動いたり目覚めたりしないようにします。
- ノーズコーンを取り外し、六角キーを引きます。重量はPVCチューブを通して垂直に落ち、ラットの頭部に影響を与えます。ラットは急速な180°回転を受け、背中に着陸します(図3E)。
- 泡のクッションからラットを取り出し、ケージの背中に置きます。
- デジタルタイマーを使用して、回復と怪我の重症度の兆候として右反射時間を測定します。右反射時間は、げっ歯類が目を覚ますまでの衝撃から、自発的に立ち上がり、上垂座から傾向のある位置に自分自身を右に、または歩き始めるまでの合計時間です。死亡、骨折、出血の兆候に注意してください。
注:手順は、繰り返し脳震盪のための異なる時点で同じ被験者に繰り返すことができます。
6. シャム誘導
- 透析サンプル採取のベースライン段階の後、イソフランナトリウムを送送る鼻コーンを置いてラットを軽く麻酔する(2.5%)0.5 L/minの酸素の流れで、つま先のピンチに応答しないまで(セクション3.1で述べたように)。
- その頭が真鍮の重量のパスに直接横たわるように、スロットされたアルミニウムシートの上に動物を胸の上に置きます。鼻コーンで麻酔を維持し、ラットが動いたり目覚めたりしないようにします。
- ノーズコーンを取り外し、六本鍵を引っ張らずにアルミシートから動物を取り除きます。ラットは急速な180°回転を受け取らない。
- ネズミをケージの中に背中に置きます。
- 神経学的回復の指標として正しい時間を測定するには、デジタルタイマーを使用してください。
7. 高性能液体クロマトグラフィー
- 急速な分離蛍光検出を伴う高性能液体クロマトグラフィーを用いて前カラム誘導体化により神経伝達物質レベル(すなわち、グルタミン酸およびGABA)を決定し、迅速な分離オートサンプラーとポンプ結合からなるシステム3.0 x 50 mm 5 μm の分析カラムに。
- 100 mmol/Lリン酸ナトリウムジビベーシック(Na2HPO4)、3.5%アセトニトリルおよび20%メタノールで移動相を調作する。リン酸でpHを6.7に調整する(85%)必要に応じて。
- 流量を 0.5 mL/min に設定します。
- ストックソリューションから新鮮な毎日の誘導性試薬と作業基準(100 ng/mL)を準備します。サンプルと冷蔵(10°C)急速な分離オートサンプラーにそれらをロードします。
- 各画分を、0.1 mol/Lテトラボレートで希釈したH2Oおよび20 μLのo-フタルデヒド(0.0143モル/L)で希釈した3-メルカプトプロピオン酸(0.071モル/L)の20μLを分析カラムに順次混合します。ミックスが反応する10分を許可します。
- 次のサンプルの汚染を防ぐために、各注射に続いて、メタノール(20%)で注入ループをフラッシュします。
注:グルタミン酸保持時間は、このプロトコルではおよそ1分、各サンプルの合計実行時間は30分です。 - クロマトグラフィーピークの分析中に、既知の基準からの保持時間に応じて一致したサンプルを使用して未知のピークを特定します。μg/mLとして解数のレベルを表現します。
8. ヒストロジー
- 微小透析手順と脳震盪または偽傷害誘導の1ヶ月後、ケタミン(70mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)のカクテルを腹腔内に注入して動物を麻酔し、パラホルムアルデヒド(4%)で安楽死させるそして生理生の心内灌流。
- げっ歯類の首を切り落とし、脳を解剖する。
- パラホルムアルデヒドで脳を保存する (4%)その後、スクロース(30%)の溶液でそれらを凍結保護します。
- クライオスタットで50μmの冠状動脈で脳をスライスします。
- 傷害およびプローブの配置(ニスル染色)の組織学的検証のためにクレシルバイオレットで脳のスライスを染色する。
Representative Results
力と回転を生体内脳微小透析と組み合わせた脳震盪のモデルを用いて、脳震盪または偽の傷害後の経時的な細胞外グルタミン酸およびGABAの変化を、21人の男性、成人、スプラーグ・ドーリーラットに調査した。海馬のCA1領域におけるガイドカニューレの移植。
プローブ配置と損傷の組織学的検証
クレシルバイオレットで染色されたセクションの海馬組織損傷の組織学的検証の後、大規模な脳内出血や挫傷などの形態学的変化は報告されなかった。ガイドカニューレ注入および微小透析プローブ挿入は、負傷者とシャム症例の間で軽度および同様の損傷を誘発した。また、シャム損傷や脳震盪誘導の直前にプローブを取り外さなかった場合、顕微鏡下で見られる海馬組織の損傷は認められず(図2B、C、それぞれ)、プローブの膜はそのまま残っている。その後(図2D、E)。パラホルムアルデヒドに浸透した脳震盪と偽の傷害脳 (4%)微小透析手順の1ヶ月後は、目視検査で区別がつきません(図2F,G)。
右の反射時間
負傷した群の動物は、平均的に正しい時間を有意に増加させた(学生のt検定、p=0.042801)(図4)、意識を取り戻すと驚いたように見えた。脳震盪群の10例のうち、1匹の動物が体重減少後の衝撃部位下で出血の軽度の徴候を示した。頭蓋骨骨折や頭蓋内出血の他の兆候は認められなかった。
生体内脳微小透析
我々の方法の代表的な結果として、海馬から15μLサンプルを抽出し、生体内で、10分間隔で、1μL/minの流量をベースライン中に6つのサンプルから測定した(60分)と偽の傷害または脳震盪の誘導後の9サンプルから(90分)。
グルタミン酸の細胞外濃度
外傷の誘発後最初の10分の間に海馬のCA1領域で細胞外グルタミン酸濃度の有意な増加が観察された(Mann-Whitney U Test, p = 0.009175)(図5)。グルタミン酸濃度の他の差は、他の時点でグループ間で観察されなかった。
GABAの細胞外濃度
外傷の誘導後最初の10分の間に海馬のCA1領域でGABA濃度に有意な変化は認められなかった(Mann-Whitney U Test, p = 0.943861)(図6)。脳震盪症例と偽傷害症例の間の他の時点で GABA 濃度に他の有意な差はなかった.
図1:研究プロトコルの概略概略。この数値は IO Masse 2018 から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プローブの配置と損傷の組織学的検証。(A) パキシノスとワトソンの立体アトラスを用いて海馬における微小透析プローブとガイドカニューレ配置部位のコロナルビュー。(B)ミクロ透析プローブとガイドカニューレによって産生される海馬組織損傷(クレシルバイオレット)の代表的な写真顕微鏡写真。(C) 脳震盪症例から微小透析プローブとガイドカニューレによって産生される海馬組織損傷(クレシルバイオレット)の代表的な写真顕微鏡写真。(D) 脳震盪誘導前の微小透析プローブの代表的な光顕微鏡写真。(E)脳震盪誘導後の微小透析プローブの代表的な光顕微鏡写真。膜はまだ無傷だ(F-G)。シャム(F)および脳震盪(G)の代表的な写真顕微鏡写真は、偽の傷害または脳震盪処置の1ヶ月後に4%のパラホルムアルデヒドを注入した後、脳を損傷した。目視検査では、2つの脳は区別がつきません。この数値は IO Masse 2018 から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脳震盪装置及び微小透析器具の必須成分描写。(A) ラットステージの上に位置する落下重量のための垂直ポリ塩化ビニル(PVC)ガイドチューブで構成されるアセンブリ全体の写真、プレキシグラスフレーム、フォームクッション、コンピュータ制御マイクロ注入ポンプ、気密注射器、液体旋回装置、および並んで融合シリカ入口出口ライン。(B) すべての関連寸法を持つプレキシグラスフレームとフォームクッションの概略表現。(C) 泡クッションの上のラットステージとして機能するアルミ箔のスロット部分の写真。(D) 転倒体重による頭部衝撃の直前のステージ上でのラットの位置を示す写真。(E) 頭部衝撃後のラットを示す写真で、頭部衝撃後のラットの体内の180°水平回転を示し、その後の加速と回転を示す。この数値は IO Masse 2018 から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 右時刻。ラットが麻酔から目を覚まし、上の位置から起こりやすい位置に反転したり、脳震盪(赤いダイヤモンド、n=10)または恥の傷害(青い正方形、n=11)に続いて歩き始めるまでの時間のヒストグラム表現。脳震盪群のラットは、恥ずかしい傷害群と比較して、右にかなり長くかかった。平均値は、各グラフの水平線として表されます。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.この数値は IO Masse 2018 から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:グルタミン酸の細胞外濃度。ベースライン(60分)および脳震盪後(赤身ダイヤモンド、n=10)または恥傷(青い正方形、n=11)条件(90分)の間に海馬の微小透析によって測定されたグルタミン酸(μg/mL)の平均細胞外濃度。誤差余数は、平均の標準誤差を表します。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.この数値は IO Masse 2018 から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:GABAの細胞外濃度。ベースライン(60分)および脳震盪後(赤身ダイヤモンド、n=10)またはシャム傷害(青い正方形、n=11)条件(90分)の間に海馬の微小透析によって測定されたGABA(μg/mL)の平均細胞外濃度。誤差余数は、平均の標準誤差を表します。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.この数値は IO Masse 2018 から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
プロトコルの重要な手順
信頼性の高い結果を生成するには、このプロトコルの重要な手順には特に注意が必要です。カニューレ移植手術中は、特に衝撃部位にこぼれを防ぐために非常に液体である場合は、必要以上のセメントの使用を避けてください。移植部位の遮断を避けるため、カニューレと同じ長さのオブチュレータを使用します。微小透析手順の間に、プローブをカニューレにゆっくりと挿入し、透析サンプリングのために完全に挿入されていることを確認します。脳震盪誘導の前に、アルミシートが鋭利なかみそり刃で適切にスロットされていることを確認してください。それ以外の場合は、真鍮の重量からの衝撃はアルミニウムシートをリッピングするのに十分ではなく、ラットは180°回転を受け、背中に着陸するのではなく、胸を下に残ります。この場合、誘発された傷害は、オープンスカルの体重降下モデルで見られるものとは異なり、鈍い衝撃から生じ、著しく重篤になります。脳震盪誘導中に、これはラットの頭蓋骨に重大な損傷を生成するように重量でカニューレに影響を与えないようにしてください。実験中の操作エラーを制限するために、2 のチームで作業することを強くお勧めします。
変更とトラブルシューティング
微小透析手順の間、プローブがポンプにリンクされると、流れは一定で、灌流速度に適した体積を得るべきである。より低い容積は、ライン内のプローブまたは気泡の膜に目詰まりの存在を示すことができる。目詰まりの場合は、プローブを廃棄して交換する必要があります。しかし、気泡はライン内のACSFを循環することによって排出することができる。目詰まりや気泡が指摘されていない場合、まだ流れが無い場合は、端に最も近い流出管の小さな部分を切断することができます。
メソッドの制限事項
ウェイン州立大学の体重減少を用いた他の研究は、いくつかの基本的な構造および分子変化を評価しています 18.しかし、より広範な調査は、この手順の正当性を維持します。エピジェネティックおよび細胞レベルで起こる生物学的および神経解剖学的変化に関する情報は、我々の方法の信頼性と翻訳的価値をさらに固めるだろう。さらに、認知機能の評価は、げっ歯類モデル33におけるmTBIに関連する確実な結果尺度である。右への時間は、このプロトコルで測定され、シャムケースと比較して傷害症例で有意に遅れましたが、将来の研究は、げっ歯類の外傷誘導後の認知機能を系統的に測定することに集中する必要があります。
既存/代替方法に関する方法の意義
方法の主な意義は二重である:まず、それは頭部および胴の急速な加速および減速を可能にするウェイン州立大学の手順との脳震盪の成功した誘導を可能にする。この方法では、心呼吸停止、頭蓋骨骨折、高死亡率および衝撃部位での目に見える脳挫傷の徴候などの重大な傷害の結果は避けられた。第二に、この微小透析技術は、外傷誘発14、16の後の最初の10分以内に起こる急性および短命の細胞外グルタミン酸放出を以前に実証した。さらに、プローブを手順全体に挿入したままにしておくことは、繰り返し微小透析プローブ挿入34にリンクされたmTBI感受性血液脳関門に損傷を引き起こす可能性を有意に低減する。
メソッドの将来のアプリケーションまたは方向。
ウェイン州立大学の体重減少手順と微小透析によって測定される急性細胞外神経伝達物質レベルの変化の使いやすい側面を考えると、微小透析と脳震盪を組み合わせたラットモデルは、研究者に信頼性の高い情報を提供します。ヒト頭蓋脳外傷のバイオメカニクスを忠実に再現し、脳震盪の分子効果を縦方向に特徴付けるツール。私たちのラットモデルは、動物を犠牲にすることなく、生体内の薬理薬剤のメカニズムと有効性を研究する貴重な機会を提供する貴重な機会を提供するので、我々のラットモデルはまた、治療研究の多種多様に使用することができます。さらに、ここで提示されたようなラットモデルの利用可能性は、神経伝達物質の不均衡と脳震盪の行動結果との関係のより良い理解を大幅に容易にする可能性がある。
Disclosures
競合する金銭的利益は存在しません。
Acknowledgments
動物のケアとメンテナンスのためのルイ・チオッキオ、心内灌流手順の支援のためのモルガン・レグニーズ、クライオスタットの支援のためのデビッド・カストングアイに感謝しています。この研究は、LDBに授与されたモントリオール大学の急性外傷学のキャロライン・デュランド財団議長によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Preparation | |||
| Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery | |||
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| Ophthalmic Ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51600 | |
| Stereotaxic Cannula Holder Arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Cannula Gauge 20 10.55mm | HRS Scientific | C311G/SPC | |
| Dummy-Cannula 10.55mm | HRS Scientific | C311DC/1/SPC | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis Procedure | |||
| CMA 402 Syringe Pump | Harvard Apparatus Canada | CMA-8003110 | |
| Microsyringe 2.5ml Glass | Harvard Apparatus Canada | CMA-8309021 | |
| Syringe Clip Medium For 1-2.5ml | Harvard Apparatus Canada | CMA-3408310 | |
| Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel | Instech Laboratories Inc. | 375/D/22QM | |
| GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
| Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps | Fisher Scientifique | 05769Q | |
| NaHCO3 Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich Canada | S5761-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| MgCl2 Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | M8266-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| NaCl Sodium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | S7653-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich Canada | A5960-25G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| KCl Potassium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | P9333-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Canada | S0751-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| CaCl2 Calcium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | 383147-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| Lighter | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Epoxy Glue | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Super Glue Gel | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Cut-Off Wheels Dremel #409 | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 | Fisher Scientifique | 14-826-15 | For Laboratory Constructed Probes |
| BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 | Fisher Scientifique | 14-826-5B | For Laboratory Constructed Probes |
| 26G Stainless Steel Tubing One Foot | HRS Scientific | SST-26/FT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID | HRS Scientific | C315CT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID | HRS Scientific | C314CT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID | HRS Scientific | C313CT | For Laboratory Constructed Probes |
| 30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long | HRS Scientific | 008BSH/30S | For Laboratory Constructed Probes |
| Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm | Molex LLC Polymicro Technologies | 106815-0015 | For Laboratory Constructed Probes |
| Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO | Spectrum Labs | FSSP9778671 | For Laboratory Constructed Probes |
| Stainless Steel Collar | Sirnay In.c | 304 | For Laboratory Constructed Probes / Custome made |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concussion Apparatus | |||
| Brass Weight | Rapido Métal Inc. | Attach metal loop to base | |
| Metal Loop | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
| PVC Guide Tube | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
| Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
| Tape | Available commercially | ||
| GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
| U-Shaped Plexiglas Frame | Présentoirs PlexiPlus Inc. | Custom made | |
| Foam Cushion | Mousse D&R Foam Inc. | Custom made | |
| Razor Blades | VWR International | 55411-055 | |
| Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley | Canadian Tire | Available at most hardware stores | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Stop Watch | Available at most sporting goods retailer | ||
| Animal Preparation | |||
| Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery | |||
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| Ophthalmic Ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51600 | |
| Stereotaxic Cannula Holder Arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Cannula Gauge 20 10.55mm | HRS Scientific | C311G/SPC | |
| Dummy-Cannula 10.55mm | HRS Scientific | C311DC/1/SPC | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis Procedure | |||
| CMA 402 Syringe Pump | Harvard Apparatus Canada | CMA-8003110 | |
| Microsyringe 2.5ml Glass | Harvard Apparatus Canada | CMA-8309021 | |
| Syringe Clip Medium For 1-2.5ml | Harvard Apparatus Canada | CMA-3408310 | |
| Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel | Instech Laboratories Inc. | 375/D/22QM | |
| GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
| Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps | Fisher Scientifique | 05769Q | |
| NaHCO3 Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich Canada | S5761-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| MgCl2 Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | M8266-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| NaCl Sodium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | S7653-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich Canada | A5960-25G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| KCl Potassium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | P9333-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Canada | S0751-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| CaCl2 Calcium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | 383147-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| Lighter | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Epoxy Glue | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Super Glue Gel | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Cut-Off Wheels Dremel #409 | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 | Fisher Scientifique | 14-826-15 | For Laboratory Constructed Probes |
| BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 | Fisher Scientifique | 14-826-5B | For Laboratory Constructed Probes |
| 26G Stainless Steel Tubing One Foot | HRS Scientific | SST-26/FT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID | HRS Scientific | C315CT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID | HRS Scientific | C314CT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID | HRS Scientific | C313CT | For Laboratory Constructed Probes |
| 30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long | HRS Scientific | 008BSH/30S | For Laboratory Constructed Probes |
| Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm | Molex LLC Polymicro Technologies | 106815-0015 | For Laboratory Constructed Probes |
| Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO | Spectrum Labs | FSSP9778671 | For Laboratory Constructed Probes |
| Stainless Steel Collar | Sirnay In.c | 304 | For Laboratory Constructed Probes / Custome made |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concussion Apparatus | |||
| Brass Weight | Rapido Métal Inc. | Attach metal loop to base | |
| Metal Loop | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
| PVC Guide Tube | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
| Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
| Tape | Available commercially | ||
| GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
| U-Shaped Plexiglas Frame | Présentoirs PlexiPlus Inc. | Custom made | |
| Foam Cushion | Mousse D&R Foam Inc. | Custom made | |
| Razor Blades | VWR International | 55411-055 | |
| Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley | Canadian Tire | Available at most hardware stores | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Stop Watch | Available at most sporting goods retailer |
References
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