Summary
Neurotransmitter ændring er en mekanisme af neurale dysfunktion, der opstår efter hjernerystelse og bidrager til de undertiden katastrofale langsigtede konsekvenser. Denne rotte model kombinerer mikrodialyse, tillader in vivo neurotransmitter kvantificering, med en vægt-dråbe teknik udøve hurtig acceleration og deceleration af hovedet og torso, en vigtig faktor for menneskelige kraniocerebrale traumer.
Abstract
Vedvarende kognitive og motoriske symptomer er kendte konsekvenser af hjernerystelse/mild traumatisk hjerneskade (mTBIs), som delvis kan tilskrives ændret neurotransmission. Faktisk har cerebral mikrodialyse undersøgelser hos gnavere demonstreret en overdreven ekstracellulær glutamat frigivelse i hippocampus inden for de første 10 minutter efter traumer. Mikrodialyse giver den klare fordel ved in vivo neurotransmitter kontinuerlig prøvetagning uden at skulle ofre dyret. Ud over ovennævnte teknik, en lukket hovedskade model, der udøver hurtig acceleration og deceleration af hovedet og torso er nødvendig, da en sådan faktor ikke er tilgængelig i mange andre dyremodeller. Wayne State vægt-drop model efterligner denne væsentlige bestanddel af menneskelige kraniocerebrale traumer, tillader induktion af en indvirkning på hovedet af en uhæmmet gnaver med en faldende vægt. Vores roman og translationel rat model kombinerer cerebral mikrodialyse med Wayne State vægt-drop model til at studere, i let bedøvet og uhæmmet voksne rotter, de akutte ændringer i ekstracellulære neurotransmitter niveauer efter hjernerystelse. I denne protokol blev mikrodialyse sonden indsat inde i hippocampus som region af interesse, og blev indsat i hjernen i Impact. Der er en høj tæthed af terminaler og receptorer i hippocampus, hvilket gør det til en relevant region til at dokumentere ændret neurotransmission efter hjernerystelse. Når de anvendes til voksne Sprague-Dawley rotter, vores kombinerede model induceret stigninger i hippocampus ekstracellulære glutamat koncentrationer inden for de første 10 min, i overensstemmelse med den tidligere rapporterede post-hjernerystelse symptomologi. Denne kombinerede vægt-drop model giver et pålideligt værktøj for forskerne at studere tidlige terapeutiske reaktioner på hjernerystelse ud over gentagne hjerneskade, da denne protokol inducerer en lukket-hovedet mildt traume.
Introduction
Formålet med denne metode er at give forskerne et pålideligt værktøj, der trofast reproducerer biomekanik af humant kraniocerebralt traume samtidig tillade langsgående karakterisering af de molekylære virkninger af hjernerystelse/mild traumatisk hjerne skade (mTBIs). Denne metode kombinerer cerebral mikrodialyse med Wayne State vægt-drop model til at dokumentere, i let bedøvet og uhæmmet voksne rotter, de akutte ændringer i ekstracellulære neurotransmitter niveauer efter hjernerystelse. Med denne minimalt-invasive metode, neurotransmittere såsom glutamat, GABA, taurin, glycin og serin kan hurtigt og kontinuerligt kvantificeres efter traumer, in vivo, mens ikke at skulle ofre dyret.
Hjernerystelse/mTBI er en patofysiologisk forstyrrelse, der påvirker hjernens funktion forårsaget af en ekstern kraft mekanisme. Hjernerystelse/mTBI er den mest almindeligt form for traumatisk hjerneskade, der tegner sig for 70-90% af tilfældene1. De fleste af de akutte funktionelle forstyrrelser efter en hjernerystelse kan tilskrives en primær og en sekundær hjernen skade2,3: (1) den primære hjerneskade induceres af den hurtige acceleration og deceleration af hoved og torso som skader hjernevæv ved kompression efterfulgt af stretching og klipning af axoner under tilbageslag4,5,6 og (2) den sekundære hjerneskade er den indirekte cellulære respons på traumet. Det finder sted timer og dage efter den primære hjerneskade og spiller en vigtig rolle i motoren og kognitiv svækkelse observeret over tid. Mange af symptomerne kan tilskrives ændret neurotransmission såsom den tidligere påviste overdreven ekstracellulære glutamat frigivelse i de første 10 min efter skade7,8,9. På grund af sin høje tæthed af terminaler og receptorer, hippocampus er en hjernestruktur særligt sårbar over for denne excitotoxic respons efter skade. At være stærkt involveret i kognitiv funktion10,11, undersøgelser i gnavere rapporterede, at hippocampus skader forbundet med hjernerystelse kan føre til funktionsnedsættelser i frygt conditioning og indlæring rumlig hukommelse12 , 13. Hovedformålet med denne metode var at udarbejde en rotte model for hjernerystelse/MTBI, ved hjælp af Wayne State lukket hovedvægt-drop procedure til trofast reproducere mekanismerne i den primære hjerneskade, og indarbejde cerebral mikrodialyse at studere in vivo, den akutte ekstracellulære neurotransmitter ændringer på grund af den sekundære hjerneskade efter en hjernerystelse. Koncentrationer af ekstracellulær glutamat og GABA blev målt i hippocampus til at fungere som repræsentative resultater af vores metode.
Tidligere gnaver undersøgelser har kombineret mikrodialyse og andre modeller af skade, såsom åben-kraniet vægt fald og kontrolleret kortikale virkning, at påvise de akutte ændringer i ekstracellulære neurotransmitter niveauer efter en skade af varierende sværhedsgrad grader14,15,16,17. Men ud over de høje grader af variabilitet, den translationelle værdi af modeller som åben-kraniet vægt fald og kontrolleret kortikale virkning er hæmmet af en iboende mangel på økologisk gyldighed på grund af 2 faktorer: (1) disse modeller fremkalde skader meget mere alvorlige end sport-relaterede hjernerystelse led hos mennesker, der involverer direkte hjerne lastning og (2) disse modeller nødvendiggør en kranie-eller kraniotomi, idet lederen af gnaver er helt tilbageholdende i en stereotaxisk ramme, hvilket hæmmer den hurtige acceleration og deceleration af hoved og torso, således dårligt gengive biomekanik af hjernerystelse.
Mikrodialyse er en minimalt-invasiv metode, der giver den klare fordel ved prøvetagning af neurotransmittere såsom glutamat, GABA, taurin, glycin og serin, in vivo og kontinuerligt efter traumer, mens de ikke behøver at ofre dyret. Ud over de fordele, der tilbydes ved mikrodialyse, Wayne State University udviklet en lukket-kraniet vægt-dråbe model (i modsætning til åbne kraniet fra andre modeller), som tillader induktion af en mTBI på en let bedøvet og uhæmmet gnaver, således tillader hurtig acceleration og deceleration af hovedet og torso18. Som tidligere nævnt, acceleration og deceleration af hoved og torso er en kerne biomekaniske træk ved sport-relaterede hjernerystelse set hos mennesker, at tidligere gnaver mTBI modeller har undladt at behandle. Vægt-drop proceduren kan gøres meget hurtigt og kræver ikke nogen forudgående kirurgi eller hovedbund incision. Efter induktion af hjernerystelse, genvinder gnavere den stabiliserende refleks næsten spontant og oplever ikke lammelse, krampeanfald eller åndedrætsbesvær efter en enkelt påvirkning. Intrakranielle blødninger og kranie frakturer er sjældne, og der er kun indberettet mindre underskud i motorisk koordination hos gnavere. Denne rotte model er nem at bruge, billig og letter kvantificeringen af neurotransmittere frigivet i den akutte fase efter en hjernerystelse uden at fjerne mikrodialyse sonde under påvirkning.
Vores rotte model kombinerer mikrodialyse og hjernerystelse er passende for forskere, der søger at karakterisere længderetningen de molekylære virkninger af hjernerystelse og kan anvendes i en bred vifte af terapeutiske undersøgelser. Faktisk, på trods af flere års forskning og et overvældende behov, ingen lægemiddel til at forhindre de langsigtede virkninger af hjernerystelse har bestået den kliniske forsøg fase19. En af de mulige årsager til disse fejl kan være brugen af dyremodeller, der ikke trofast gengiver de traumatiske biomekaniske kræfter af hjernerystelse, som opleves af mennesker. Den metode, der præsenteres her, opfylder definitionen af menneskelige hjernerystelse, som specificerer, at den primære hjernen skade er induceret af en stump effekt samt hurtig acceleration og deceleration af hovedet og torso2,3.
Desuden er vores kombinerede model passende for forskere, der studerer virkningerne af gentagen mild traumatisk hjerneskade (rmTBI), da en af dens vigtigste egenskaber, der adskiller den fra andre dyremodeller for hjernerystelse, er, at den gør det muligt at inducere gentagne, milde skader til samme sag18. Hos mennesker, rmtbi er forbundet med mere alvorlige post-traumatiske symptomer, længere inddrivelse gange, og forværret motoriske og kognitive funktionsnedsættelser, der har tendens til at sprede sig over tid20,21. Andre relevante dyremodeller har også gjort det muligt bedre at forstå den posttraumatiske Patofysiologi af rmtbi22,23,24,25,26,27 . Øget hjerne sårbarhed er blevet påvist hos gnavere efter mindst 5 mTBI med 24 timers intervaller. Neuroinflammation stiger med antallet af mTBI erfarne og markører for neurodegeneration synes28. Gentagne mTBI ville forhindre overgangen af microglia fra en proinflammatorisk tilstand til en normal tilstand af opsving, resulterer i langvarig excitotoxic aktivitet og aktivering af neurodegenerative mekanismer 29. Med vores model, rotter kunne blive udsat for 1 virkning pr. dag i perioden på 1 uge for i alt 5 eksponeringer. I betragtning af enkelheden i denne dyremodel, det kunne lette karakteriseringen af de kumulative virkninger af akut vilkårlig neurotransmitter frigivelse opstår umiddelbart efter en mTBI.
Denne model giver også dyrene mulighed for let at blive udsat for 2 påvirkninger om dagen, hvilket gør det muligt at studere endnu mere alvorlige forhold, såsom når en atlet får en anden traumatisk virkning inden for kort tid fra det første slag30. Som påvist i en tidligere undersøgelse31, timingen af et andet slag til hovedet kan dramatisk påvirke vaskulære og axonal skade. Jo tættere det andet slag er på det første slag, jo mere skadelige konsekvenser. Denne model er egnet til at undersøge, hvordan denne særlige tilstand påvirker ekstracellulære neurotransmitter frigivelse.
I denne metode, hippocampus blev brugt som region af interesse på grund af sin relevans i hjernerystelse forskning, men mikrodialyse prøver kan indsamles fra andre regioner af interesse samt. Men, enhver anden hjerneregion skal tages i betragtning på grund af den plads efterladt af Impact site fra guide kanyle, herunder dental cement omkring det, kan tage en betydelig mængde plads på rotte hoved. Ud over dette, de mikrodialyse parametre præsenteret i denne metode, såsom membranens molekylvægt cut-off og aktiv længde, Prøvetagningstiden intervaller og strømningshastigheden kan justeres i henhold til den type molekyle undersøgt. Den effektive samling af pro-inflammatoriske cytokiner involveret i hjernerystelse, for eksempel, ville kræve en membran med en meget større porestørrelse.
Protocol
Dyre protokollen for dette projekt fik godkendelse fra dyresundheds Udvalget i Hopital du Sacre-Cœur de Montreal i overensstemmelse med retningslinjerne fra det canadiske råd om dyrepasning.
NOTE: en skematisk skitse af forskningsprotokollen er præsenteret i figur 1.
1. tilberedning af dyr
- Bestil Sprague-Dawley-rotter fra en standard laboratorie leverandør, der skal leveres mellem 43 og 50 dage og med en vægt mellem 151 og 200 g.
- Hus alle rotter individuelt i en cyklus af 12:12 h lys: mørke, ved 24-26 °C med ad libitum adgang til vand og mad.
- I løbet af de 2 uger før du starter protokollen, håndtere rotter i 5 min på daglig basis for at lette deres tilvænning i kontakt med forskere. Rotter bør være i alderen omkring 10 uger gamle og deres vægt bør være mellem 295 og 351 g på tidspunktet for hjernerystelse eller Sham skade induktion.
2. mikrodialyse guide kanyle operation
- Udfør operationen under sterile forhold. Bær sterile handsker, en hårhjelm og en kirurgisk maske under hele proceduren. Autoklave og sterilisere alle materialer og kirurgiske instrumenter på forhånd. Rengør og Desinficer arbejdsområdet og stereotaxiske apparater grundigt med en opløsning af ethanol (70%).
- Bedøve dyrene ved at injicere en cocktail af ketamin (70 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) intraperitonealt. Æsler bedøvelses dybde ved at teste refleks til en tå knivspids.
- Fjern pels fra dyrets hoved ved hjælp af elektriske Clippers. Rengør glatbarberet hoved ved hjælp af en opløsning af 2% isopropylalkohol og 2% chlorhexidin gluconat (3 gange). Påfør smøre øjensalve under anæstesi for at forhindre tørhed.
- Drape-off operationsområdet, så kun dyrets overhoved er eksponeret. Placer lederen af rotten i et stereotaxisk apparat, sæt ørepuderne i øregangene med stor omhu og stram derefter næseklemmen. Fastgør en 26 G rustfri stål guide kanyle til holderen arm på stereo taxic apparat.
- Lokalt injicere en bedøvelsesmiddel cocktail af bupivacaine (1,5 mg/kg) og lidocain (1,5 mg/kg) subkutant på hovedet, 10 min før incision.
- Vedligehold anæstesi under hele proceduren ved at levere natriumisofluran (2,5%) ved 0,5 L/min oxygen flow med en næse kegle.
- Lav en midterlinje indsnit (3 cm) langs hovedbunden med en skalpel. Lad kraniet klart ved at installere 4 klemmer omkring snittet.
- Fastgøre periosteum fra kraniet med et kirurgisk blad, indtil Bregma-og lambda-suturerne er synlige. Opretholde fast pres på kraniet med en gaze pude eller bomuld tippet applikator, hvis der er blødning.
- Bekræft, om kraniet er korrekt justeret på stereotaxiske apparater ved at sammenligne de dorsoventral koordinater for Bregma og lambda sutures. Identificere de anteroposterior, mediolaterale og dorsoventral koordinater af Bregma sutur som referencepunkter for koordinaterne af guide kanyle.
- Ved at tage Bregma-suturkoordinaterne som referencer, beregnes koordinaterne for hjælpelinjen med implantationsstedet i hippocampus.
Bemærk: Følgende koordinater blev fastlagt i henhold til rotte hjernen Atlas fra Paxinos og Watson (anteroposterior:-0,60 cm; mediolaterale: ± 0,58 cm; dorsoventral:-0,16 cm, figur 2a)32. - Marker det præcise implantationssted med en markør.
- Bor et 0,5 mm hul gennem kranium på målstedet for hjælpelinjen kanyle. Bor 3 andre huller ca. 5 mm omkring dette punkt at tråde 3 anker skruer i kraniet, der vil størkne kanylen efter akryl dental cement påføres.
- Indsæt kanylen i hippocampus og ordne det med Dental cement. Denne kanyle vil blive brugt til at indsætte sonden i regionen af interesse 7 dage senere under mikrodialyse proceduren. Vær omhyggelig med ikke at spilde overskydende dental cement omkring det sted, hvor vægten vil blive droppet.
- Lad cementen tørre i 2 min., og fjern derefter holder armen fra kanyle. Indsæt en aftagelig Obturator i rustfrit stål i kanylen for at undgå cerebrospinalvæske nedsivning og infektionsrisici.
- Fjern de 4 klemmer, træk tilbagetrukket hud og sy den med en kirurgisk sutur tråd 4-0.
- Fjern rotten fra apparatet, og Injicer buprenorphin subkutant for at behandle smerter (0,05 mg/kg, efter operationen én gang dagligt i løbet af de følgende 2 dage). Placer gnaver tilbage i sit bur med en varmepude under, indtil den bliver bevidst, derefter returnere den til dyrepleje facilitet for en 7 dages restitutionsperiode under nøje overvågning.
3. mikrodialyse procedure
- Mens du udfører mikrodialyse proceduren, bære sterile handsker, en hårhjelm og en kirurgisk maske. Syv dage efter, at implantationen er blevet indopereret, bedøbe rotten med natriumisofluran (2,5%) ved 0,5 L/min oxygen flow.
- Fjern obturatoren fra kanylen og Indsæt langsomt en mikrodialyse sonde, perfanvendes med kunstig cerebral spinalvæske (ACSF) (26 mmol/L NaHCO3, 3 mmol/l Nah2po4, 1,3 mmol/l mgcl2, 2,3 mmol/l CaCl2, 3,0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0,2 mmol/L L-ascorbinsyre) gennem kanylen ind i hippocampus eller en anden region af interesse.
Bemærk: Rotter har brug for at blive bedøvet kun mens fjerne Obturator og indsættelse af mikrodialyse sonde, og under induktion af hjernerystelse eller Sham skade. De sonder anvendes her er laboratorium-konstrueret, I-formet, og består af smeltet side-by-side silica indløb-udløb linjer [indre diameter (ID): 50 μm] indkapslet i polyethylen slange (ID: 0,58-0,38 mm). Enden af kanylen er sikret med en længde af regenereret hule cellulose membran [molekylvægt cut-off: 13 kDa, udvendig diameter (OD): 216 μm; ID: 200 μm] ved hjælp af cyanoacrylat klæbemiddel og spidsen forseglet med epoxy. Den aktive membran måler 2,5 mm for implantation i hippocampus, men kan justeres i forhold til dybden af interesseområdet. Tilslutningen af den permanent kanyle af rotten til sonden er sikret med en monteret, gevind rustfri stål krave. - Fastgør sonde samlingen til en fjeder i rustfrit stål, der er bundet til en væske dreje-og modbalancearm, som er suspenderet over buret med en ring stander og klemmer, så dyret kan bevæge sig frit i sit bur. Tethered rotter tilbringer hele varigheden af mikrodialyse proceduren med ad libitum adgang til vand og mad.
- Brug en mikroinfusions pumpe til at sende perfusat til sonder, og Indsaml dialysatet fra den sammensmeltet silica-udløbs linje (dødt volumen: 0,79 μL).
- Mindst 1 time og 30 minutter før proceduren begynder, Skru op for sonden til dens arbejds flow (1 μL/min). Kontrollér, at sondens strømningshastighed er konsistent ved at måle lydstyrken over tid med en pipette.
Bemærk: Gennemstrømningshastigheden kan være mere eller mindre afhængig af den indsamlede neurotransmittere og hjernens interesseområde. Dialyse prøver tages før, under og efter hjernerystelse eller fingeret skade induktion. Prøvetagnings intervallet afhænger af hjernens interesseområde, neurotransmittere, der analyseres, dialysekoncentrationer af analytten og følsomheden af det anvendte analytiske kemi udstyr. Indsamlingen faser udført her i hippocampus for glutamat og GABA prøveudtagning er som følger:
1. baseline: ved begyndelsen af eksperimentet opsamles dialyse prøver med 10 min. intervaller for 60 min.
2. post-hjernerystelse eller Sham skade: efter hjernerystelse eller Sham skade, indsamle prøver for en ekstra 90 min (9 prøver). - Hver dialysatprøve opsamles i et hætteglas med en fraktion, som er forudindlæst med 1 μl 0,25 mol/L perklorsyre for at forhindre nedbrydning af analysand. Prøverne opbevares ved 4 °C ved efterfølgende analyse.
- Efter indsamlingen af den sidste dialysetprøve blev rotten bedøvet igen med en næse kegle, der leverede natriumisofluran (2,5%) ved 0,5 L/min oxygen flow.
- Fjern mikrodialyse sonden fra kanylen, sæt obturatoren i igen, og returner derefter rotten til dyrepleje anlægget.
4. hjernerystelse apparatur installation
- Før påbegyndelse af proceduren, skære en vægt, der skal anvendes til at påføre hjernerystelse (19 mm i diameter) fra solid messing til at opnå en masse på 450 g. Indsæt en metal løkke i toppen af messing vægten. Bore huller indledende i en afstand af 1,0 m inde i en lodret polyvinylchlorid (PVC) guide rør.
- Slids en aluminiumsplade med en skarp barberkniv. Den kærne aluminiumsplade bør understøtte vægten af rotten (295 til 351 g) uden at forstyrre acceleration af kroppen efter hovedet påvirkning fra messing vægten.
- Tape den kærne aluminiumsplade stramt til en U-formet plexiglas ramme (38 cm lang x 27 cm bred x 30 cm dyb, figur 3a, B), der indeholder en skum pude (37 cm lang x 26 cm bred x 12 cm dyb).
- Placer plexiglas rammen under et PVC-styre glas (20 mm diameter x 1,5 m længde).
- Hold PVC-styrerøret på plads med en klemme stander 3,5 cm over den kærne aluminium.
- Fastgør en nylon fluefiskeri linje (kapacitet på 9,1 kg, 0,46 mm diameter) gennem metal sløjfen, så bunden af vægten hænger 2,5 cm over den kærne aluminium for at forhindre flere hits, når rotten falder på skumpuden efter påvirkning.
- Fastgør nylon fluefiske linjen til klemme holderen.
- Træk op vægten gennem PVC-røret med nylon fluefiskeri linje derefter holde det på plads ved at indsætte en hex nøgle gennem de indledende boret huller på 1,0 m.
5. hjernerystelse induktion
- Efter den baseline fase af dialyse prøver indsamling, re-bedøve rotten let ved at placere en næse kegle leverer natriumisofluran (2,5% isofluran ved 0,5 L/min ilt flow) indtil det som ingen reaktion på en tå knivspids (som nævnt i punkt 3,1).
- Placer dyret på brystet på den kærne aluminiumsplade, så dens hoved er placeret direkte i vejen for messing vægten (figur 3c, D). Vedligehold anæstesi med næse keglen for at sikre, at rotten ikke bevæger sig eller vågner, før vægten rammer den.
- Fjern næse keglen og træk hex-tasten. Vægten vil falde lodret gennem PVC-røret og påvirke lederen af rotten. Rotter vil gennemgå en hurtig 180 ° rotation og lander på ryggen (figur 3E).
- Fjern rotten fra skumpuden og Placer den på ryggen i buret.
- Brug en digital timer til at måle den opretnings refleks tid som et tegn på helbredelse og skadens sværhedsgrad. Den oprette refleks tid er den samlede tid fra virkningen, indtil gnavere vågner op og spontant ret til den udsatte position fra liggende position, eller begynde at gå. Bemærk alle tegn på død, fraktur eller blødning.
Bemærk: Proceduren kan gentages på samme emne på forskellige tidspunkter for gentagne hjernerystelse.
6. Sham-induktion
- Efter den baseline fase af dialyse prøver indsamling, re-anesthetize rotten let ved at placere en næse kegle leverer natrium isofluran (2,5%) ved 0,5 L/min ilt flow indtil det som ingen reaktion på en tå knivspids (som nævnt i punkt 3,1).
- Placer dyret på brystet på den kærne aluminiumsplade, så dens hoved lægger direkte i vejen for messing vægten. Vedligehold anæstesi med næse keglen for at sikre, at rotten ikke bevæger sig eller vågner.
- Fjern næse keglen og fjern dyret fra aluminiums arket uden at trække hex-tasten. Rotten vil ikke gennemgå en hurtig 180 ° rotation.
- Placer rotten på ryggen i buret.
- Brug en digital timer til at måle den oprette tid som en indikator for neurologisk restaurering.
7. højtydende væskekromatografi
- Bestemme neurotransmitter niveauer (dvs., glutamat og GABA) ved forkolonne forædling ved hjælp af højtydende væskekromatografi med hurtig separation fluorescens detektion, og et system bestående af en hurtig adskillelse Autosampler og en pumpe koblet til en 3,0 x 50 mm 5 μm analytisk kolonne.
- Forbered en mobil fase med 100 mmol/L natriumphosphat dibasisk (na2HPO4), 3,5% acetonitril og 20% methanol. PH-værdien justeres til 6,7 med phosphorsyre (85%) efter behov.
- Indstil strømningshastigheden til 0,5 mL/min.
- Forbered friske daglige forædling reagenser og arbejdsstandarder (100 ng/ml) fra stamopløsninger. Læg dem i en køle-Autosampler (10 °C) hurtig separation med prøver.
- Hver fraktion blandes sekventielt ind i den analytiske kolonne med 20 μL 3-mercaptopropionsyre (0,071 mol/L) fortyndet med H2O og 20 μl o-phthaldehyd (0,0143 mol/l) fortyndet med 0,1 mol/l natriumtetraborat. Tillad 10 min for blandingen at reagere.
- For at forhindre kontaminering af næste prøver skylles injektions sløjfen med methanol (20%) efter hver injektion.
Bemærk: Den glutamat retention tid ville være af 1 min ca i denne protokol, for en samlet køre tid på 30 min for hver prøve. - Under analyse af kromatografiske toppe identificeres ukendte toppe ved hjælp af prøver, som matches efter opbevarings tidspunktet fra kendte standarder. Eksprestniveauer af analytter som μg/mL.
8. histologi
- En måned efter mikrodialyse proceduren og hjernerystelse eller Sham skade induktion, bedøve dyrene ved at injicere en cocktail af ketamin (70 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) intraperitonealt og aflive dem ved PARAFORMALDEHYD (4%) og saltvands-intrakardiel perfusion.
- Decapitate gnavere derefter dissekere hjernen.
- Opbevar hjernen i PARAFORMALDEHYD (4%) og derefter kryoprotect dem i en opløsning af saccharose (30%).
- Skær hjernen i de koronale sektioner af 50 μm med en kryostat.
- Pletter hjerne skiver med cresylacetat violet for histologisk verifikation af skader og sonde placering (Nissl farvning).
Representative Results
Ved hjælp af vores model for hjernerystelse, som kombinerer kraft og rotation med in vivo cerebral mikrodialyse, den akutte ekstrellulære glutamat og GABA ændringer over tid efter en hjernerystelse eller Sham skade blev undersøgt i 21 mandlige, voksne, Sprague-Dawley rotter af implantation af en guide kanyle i CAREJREGIONEN i hippocampus.
Histologisk verifikation af sonde placering og tilskadekomst
Ingen morfologiske ændringer såsom massive intracerebral blødninger eller kontusioner blev rapporteret efter den histologiske verifikation af hippocampus vævsskader på sektioner plettet med cresylacetat violet. Guide kanyle implantation og mikrodialyse sonde indsættelse inducerede mindre og lignende skader mellem tilskadekomne og fingerede tilfælde. Desuden ikke fjerne sonden lige før Sham skade eller hjernerystelse induktion ikke give nogen skelne hippocampus vævsskade som set under et mikroskop (figur 2b, C, henholdsvis), med membranen af sonden stadig intakt efterfølgende (figur 2D, E). Hjernerystelse og fingeret skade hjerner perfbrugt med PARAFORMALDEHYD (4%) 1 måned efter mikrodialyse procedurer skelnes ikke ved visuel inspektion (figur 2F, G).
Stabilite refleks tid
Dyr fra den skadede gruppe havde en markant forøget opretningstid i gennemsnit versus fingerede tilfælde (Student's t-test, p = 0,042801) (figur 4) og syntes bedøvet ved at genvinde bevidstheden. Af de 10 tilfælde fra hjernerystelse gruppe, et enkelt dyr viste mindre tegn på blødning under Impact site efter vægt-drop. Der blev ikke observeret andre tegn på kraniets fraktur eller intrakraniel blødning.
In vivo cerebral mikrodialyse
For at fungere som repræsentative resultater af vores metode, blev 15 10 μL prøver af dialysat ekstraheret fra hippocampus, in vivo, med intervaller på 10 min og en strømningshastighed på 1 μL/min. ekstracellulære niveauer af glutamat og GABA blev målt fra 6 prøver under baseline ( 60 min) og fra 9 prøver efter induktion af Sham-skade eller hjernerystelse (90 min).
Ekstrellulære koncentrationer af glutamat
Der blev observeret signifikante stigninger i ekstracellulære glutamatkoncentrationer i CARINOMRÅDET i hippocampus i løbet af de første 10 minutter efter induktion af traumer sammenlignet med Sham-skade (Mann-Whitney U-testen, p = 0,009175) (figur 5). Ingen anden forskel i glutamat koncentrationer blev observeret mellem grupperne på noget andet tidspunkt.
Ekstracellulære koncentrationer af GABA
Der blev ikke observeret nogen signifikant ændring i GABA-koncentrationerne i den første 10 min. efter induktion af traumer i området for hippocampus i forhold til Sham-skade (Mann-Whitney U-testen, p = 0,943861) (figur 6). Der var ingen anden signifikant forskel i GABA koncentrationer på noget andet tidspunkt mellem hjernerystelse tilfælde og Sham skadetilfælde.
Figur 1: skematisk skitse af forskningsprotokollen. Dette tal er blevet ændret fra IO masse 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: histologisk verifikation af sonde placering og tilskadekomst. (A) koronal visning af microdialyseproben og guide-kanyle-placeringsstedet i hippocampus ved hjælp af stereotaxisk Atlas over Paxinos og Watson. B) repræsentativt fotografisk materiale af hippocampus vævsskade (cresyl violet) fremstillet ved en mikrodialyse sonde og en guide kanyle fra en fingeret skade sag. C) repræsentativ fotograf for hippocampus vævsskader (cresyl violet) fremstillet af en mikrodialyse sonde og en guide kanyle fra en hjernerystelse sag. D) repræsentativt fotograf af en mikrodialyse sonde før indledning af hjernerystelse. E) repræsentativt fotograf af en mikrodialyse sonde efter induktion af hjernerystelse. Membranen er stadig intakt. (F-G). Repræsentativ photomicrograph af en farce (F) og hjernerystelse (G) skadet hjerne efter perfusion med 4% PARAFORMALDEHYD ved 1-måneders efter Sham skade eller hjernerystelse procedure. Ved visuel inspektion, de 2 hjerner er umulig at skelne. Dette tal er blevet ændret fra IO masse 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: hjernerystelse apparatur og mikrodialyse instrumenter væsentlige komponenter skildringer. A) et fotografi af hele samlingen bestående af et lodret polyvinylchlorid (PVC) føringsslange til den faldende vægt, der ligger over rotte stadiet, plexiglas stel, skum pude, computerstyret mikroinfusions pumpe, gastætte-sprøjter, flydende og side om side smeltet silica indløb-udløb linjer. (B) skematisk gengivelse af plexiglas stel og skum pude med alle relevante dimensioner. C) et fotografi af det kærne stykke aluminiumsfolie, der fungerer som rotte Stage over skumpuden. D) et fotografi, der viser rotte Rens placering på stadiet umiddelbart før hovedet, som følge af den faldende vægt. E) et fotografi, der viser rotten efter hovedstød, og som illustrerer 180 ° horisontal rotation af kroppen af rotten efter hovedstød og den deraf følgende acceleration og rotation. Dette tal er blevet ændret fra IO masse 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: opretningstid. Histogram repræsentationer af den tid, der tages af rotter til at vågne fra bedøvelse og flip fra liggende position til den udsatte position eller begynde at gå efter hjernerystelse (røde diamanter, n = 10) eller Sham skade (blå firkanter, n = 11). Rotter fra hjernerystelse gruppen tog betydeligt længere tid at rette sig sammenlignet med Sham skade gruppe. Middelværdierne repræsenteres som en vandret linje i hver graf. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001. Dette tal er blevet ændret fra IO masse 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: ekstracellulære koncentrationer af glutamat. Gennemsnitlige ekstrellulære koncentrationer af glutamat (μg/mL) målt ved mikrodialyse i hippocampus under baseline (60 min) og efter hjernerystelse (røde diamanter, n = 10) eller Sham skade (blå firkanter, n = 11) betingelser (90 min). Fejllinjer repræsenterer standardfejl i middelværdi. * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001. Dette tal er blevet ændret fra IO masse 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: ekstracellulære koncentrationer af GABA. Gennemsnitlige ekstracellulære koncentrationer af GABA (μg/mL) målt ved mikrodialyse i hippocampus under baseline (60 min) og efter hjernerystelse (røde diamanter, n = 10) eller Sham skade (blå firkanter, n = 11) betingelser (90 min). Fejllinjer repræsenterer standardfejl i middelværdi. * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001. Dette tal er blevet ændret fra IO masse 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Til generering af pålidelige resultater, kritiske trin i denne protokol kræver særlig opmærksomhed. Under kanylen implantations kirurgi, undgå at bruge mere cement end nødvendigt, især når det er meget flydende for at forhindre spild overslag stedet. For at undgå blokering af implantationsstedet, brug en Obturator, der har samme længde som kanyle. Under mikrodialyse proceduren skal proben langsomt sættes ind i kanylen, og sørg for, at den er sat helt ind til udtagning af dialysat. Før hjernerystelse induktion, skal du sørge for, at aluminiums arket er korrekt slidtet med en skarp barberkniv. Ellers vil virkningen fra messing vægten ikke være tilstrækkelig til at rippe aluminiums arket og rotten forbliver brystet ned i stedet for undergår en 180 ° rotation og landing på ryggen. Hvis dette er tilfældet, skader induceret vil skyldes den stumme virkning, ikke i modsætning til hvad der ses i den åbne-kraniet vægt dråbe modeller og være betydeligt mere alvorlige. Under hjernerystelse induktion, undgå at påvirke kanylen med vægten, da dette ville generere kritisk skade på kraniet af rotten. Det anbefales stærkt at arbejde i teams af 2 for at begrænse manipulations fejl under eksperimentet.
Ændringer og fejlfinding
Under mikrodialyse proceduren skal strømmen være konstant og give et volumen, der passer til perfusions hastigheden, når sonden er forbundet med pumpen. Lavere volumener kan indikere tilstedeværelsen af tilstopning i membranen af sonden eller luftbobler i linjerne. I tilfælde af tilstopning skal sonden kasseres og udskiftes. Luftbobler kan dog skubbes ud ved cirkulerende ACSF i linjerne. Hvis der ikke er nogen tilstopning eller luftbobler noteret, og der stadig ikke er nogen strøm, kan en lille del af udstrømnings røret tættest på enden skæres.
Metodens begrænsninger
Andre undersøgelser ved hjælp af Wayne State University vægt-drop har evalueret nogle fundamentale strukturelle og molekylære ændringer18. En mere omfattende undersøgelse ville imidlertid bevare legitimiteten af denne procedure. Oplysninger om de biologiske og neuroanatomiske ændringer, der finder sted på epigenetiske og cellulære niveauer vil yderligere størkne den pålidelige og translationelle værdi af vores metode. Endvidere, evaluering af kognitiv funktion er en pålidelig måling af resultatet relateret til mTBI i gnaver modeller33. Mens den tid-til-højre blev målt i denne protokol og blev betydeligt forsinket i tilskadekomne tilfælde i forhold til Sham tilfælde, undersøgelser i fremtiden bør koncentrere sig om metodisk måling kognitive funktion efter traume induktion i gnavere.
Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder.
Den vigtigste betydning af metoden er dobbelt: for det første, det giver mulighed for vellykket induktion af en hjernerystelse med Wayne State University procedure, som giver mulighed for hurtig acceleration og deceleration af hovedet og torso. Med denne metode blev alvorlige kvæstelser som kardiorespiratoriske arrestationer, kraniets fraktur, høj dødelighed og tegn på synlige cerebral kontusioner på slag stedet undgået. For det andet, denne mikrodialyse teknik med succes replikeret den tidligere demonstrerede den akutte og kortvarige ekstracellulære glutamat frigivelse finder sted inden for de første 10 min efter traume induktion14,16. Desuden reducerer det betydeligt sandsynligheden for at inducere skader på den mTBI-følsomme blod-hjerne barriere, der er forbundet med gentagen mikrodialyse sonde indsættelse34, ved at holde sonden indsat under hele proceduren.
Fremtidige anvendelser eller anvisninger af metoden.
I betragtning af de let anvendelige aspekter af Wayne State University vægt-drop proceduren og de akutte ekstracellulære neurotransmitter niveauændringer målt ved mikrodialyse, vores rotte model kombinerer mikrodialyse og hjernerystelse giver forskerne en pålidelig værktøj til trofast reproducerer biomekanik af humant kraniocerebrale traumer og længde-udinalt karakterisere de molekylære virkninger af hjernerystelse. Vores rotte model kunne også anvendes i en bred vifte af terapeutiske undersøgelser, da det giver en værdifuld mulighed for at studere mekanismen og effekten af farmakologisk agenter in vivo, kontinuerligt og uden at skulle ofre dyret. Desuden kan tilgængeligheden af en rotte model som den, der præsenteres her, i høj grad lette den bedre forståelse af forholdet mellem neurotransmitter ubalancer og de adfærdsmæssige konsekvenser af hjernerystelse.
Disclosures
Der findes ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi er glade for Louis chiocchio for dyrepleje og vedligeholdelse, Morgane regniez for assistance med intrakardiel perfusion procedure, og David castonguay for assistance med cryostat. Dette arbejde blev støttet af Caroline Durand Foundation Chair i akut traumatologi af universite de Montreal tildelt LDB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Preparation | |||
| Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery | |||
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| Ophthalmic Ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51600 | |
| Stereotaxic Cannula Holder Arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Cannula Gauge 20 10.55mm | HRS Scientific | C311G/SPC | |
| Dummy-Cannula 10.55mm | HRS Scientific | C311DC/1/SPC | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis Procedure | |||
| CMA 402 Syringe Pump | Harvard Apparatus Canada | CMA-8003110 | |
| Microsyringe 2.5ml Glass | Harvard Apparatus Canada | CMA-8309021 | |
| Syringe Clip Medium For 1-2.5ml | Harvard Apparatus Canada | CMA-3408310 | |
| Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel | Instech Laboratories Inc. | 375/D/22QM | |
| GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
| Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps | Fisher Scientifique | 05769Q | |
| NaHCO3 Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich Canada | S5761-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| MgCl2 Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | M8266-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| NaCl Sodium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | S7653-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich Canada | A5960-25G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| KCl Potassium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | P9333-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Canada | S0751-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| CaCl2 Calcium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | 383147-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| Lighter | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Epoxy Glue | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Super Glue Gel | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Cut-Off Wheels Dremel #409 | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 | Fisher Scientifique | 14-826-15 | For Laboratory Constructed Probes |
| BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 | Fisher Scientifique | 14-826-5B | For Laboratory Constructed Probes |
| 26G Stainless Steel Tubing One Foot | HRS Scientific | SST-26/FT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID | HRS Scientific | C315CT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID | HRS Scientific | C314CT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID | HRS Scientific | C313CT | For Laboratory Constructed Probes |
| 30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long | HRS Scientific | 008BSH/30S | For Laboratory Constructed Probes |
| Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm | Molex LLC Polymicro Technologies | 106815-0015 | For Laboratory Constructed Probes |
| Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO | Spectrum Labs | FSSP9778671 | For Laboratory Constructed Probes |
| Stainless Steel Collar | Sirnay In.c | 304 | For Laboratory Constructed Probes / Custome made |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concussion Apparatus | |||
| Brass Weight | Rapido Métal Inc. | Attach metal loop to base | |
| Metal Loop | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
| PVC Guide Tube | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
| Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
| Tape | Available commercially | ||
| GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
| U-Shaped Plexiglas Frame | Présentoirs PlexiPlus Inc. | Custom made | |
| Foam Cushion | Mousse D&R Foam Inc. | Custom made | |
| Razor Blades | VWR International | 55411-055 | |
| Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley | Canadian Tire | Available at most hardware stores | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Stop Watch | Available at most sporting goods retailer | ||
| Animal Preparation | |||
| Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery | |||
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| Ophthalmic Ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51600 | |
| Stereotaxic Cannula Holder Arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Cannula Gauge 20 10.55mm | HRS Scientific | C311G/SPC | |
| Dummy-Cannula 10.55mm | HRS Scientific | C311DC/1/SPC | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis Procedure | |||
| CMA 402 Syringe Pump | Harvard Apparatus Canada | CMA-8003110 | |
| Microsyringe 2.5ml Glass | Harvard Apparatus Canada | CMA-8309021 | |
| Syringe Clip Medium For 1-2.5ml | Harvard Apparatus Canada | CMA-3408310 | |
| Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel | Instech Laboratories Inc. | 375/D/22QM | |
| GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
| Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps | Fisher Scientifique | 05769Q | |
| NaHCO3 Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich Canada | S5761-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| MgCl2 Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | M8266-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| NaCl Sodium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | S7653-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich Canada | A5960-25G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| KCl Potassium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | P9333-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Canada | S0751-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| CaCl2 Calcium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | 383147-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
| Lighter | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Epoxy Glue | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Super Glue Gel | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| Cut-Off Wheels Dremel #409 | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
| BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 | Fisher Scientifique | 14-826-15 | For Laboratory Constructed Probes |
| BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 | Fisher Scientifique | 14-826-5B | For Laboratory Constructed Probes |
| 26G Stainless Steel Tubing One Foot | HRS Scientific | SST-26/FT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID | HRS Scientific | C315CT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID | HRS Scientific | C314CT | For Laboratory Constructed Probes |
| Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID | HRS Scientific | C313CT | For Laboratory Constructed Probes |
| 30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long | HRS Scientific | 008BSH/30S | For Laboratory Constructed Probes |
| Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm | Molex LLC Polymicro Technologies | 106815-0015 | For Laboratory Constructed Probes |
| Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO | Spectrum Labs | FSSP9778671 | For Laboratory Constructed Probes |
| Stainless Steel Collar | Sirnay In.c | 304 | For Laboratory Constructed Probes / Custome made |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concussion Apparatus | |||
| Brass Weight | Rapido Métal Inc. | Attach metal loop to base | |
| Metal Loop | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
| PVC Guide Tube | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
| Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
| Tape | Available commercially | ||
| GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
| U-Shaped Plexiglas Frame | Présentoirs PlexiPlus Inc. | Custom made | |
| Foam Cushion | Mousse D&R Foam Inc. | Custom made | |
| Razor Blades | VWR International | 55411-055 | |
| Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley | Canadian Tire | Available at most hardware stores | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Stop Watch | Available at most sporting goods retailer |
References
- Cassidy, J. D., et al. Incidence, risk factors and prevention of mild traumatic brain injury: results of the WHO Collaborating Centre Task Force on Mild Traumatic Brain Injury. Journal of Rehabilitation Medecine. 43, 28-60 (2004).
- McCrory, P., et al. What is the definition of sports-related concussion: a systematic review. British Journal of Sports Medecine. 51 (11), 877-887 (2017).
- McCrory, P., et al. 5th International Conference on Concussion in Sport (Berlin). British Journal of Sports Medecine. 51 (11), 837 (2017).
- Cernak, I.
- Davis, A. E. Mechanisms of traumatic brain injury: biomechanical, structural and cellular considerations. Critical Care Nursing Quarterly. 23 (3), 1-13 (2000).
- Gaetz, M.
- Giza, C. C., Hovda, D. A. The new neurometabolic cascade of concussion. Neurosurgery. 75, Suppl 4. S24-S33 (2014).
- Guerriero, R. M., Giza, C. C., Rotenberg, A. Glutamate and GABA imbalance following traumatic brain injury. Current neurology and neuroscience reports. 15 (5), 27 (2015).
- Meldrum, B. S. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology and pathology. Journal of Nutrition. 130 (4S Suppl), 1007S-1015S (2000).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Olton, D. S., Papas, B. C. Spatial memory and hippocampal function. Neuropsychologia. 17 (6), 669-682 (1979).
- Ray, S. K., Dixon, C. E., Banik, N. L. Molecular mechanisms in the pathogenesis of traumatic brain injury. Histology and histopathology. 17 (4), 1137-1152 (2002).
- Reger, M. L., et al. Concussive brain injury enhances fear learning and excitatory processes in the amygdala. Biological Psychiatry. 71 (4), 335-343 (2012).
- Faden, A. I., Demediuk, P., Panter, S. S., Vink, R. The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury. Science. 244 (4906), 798-800 (1989).
- Folkersma, H., et al. Increased cerebral (R)-[(11)C]PK11195 uptake and glutamate release in a rat model of traumatic brain injury: a longitudinal pilot study. Journal of neuroinflammation. 8, 67 (2011).
- Katayama, Y., Becker, D. P., Tamura, T., Hovda, D. A. Massive increases in extracellular potassium and the indiscriminate release of glutamate following concussive brain injury. Journal of neurosurgery. 73 (6), 889-900 (1990).
- Nilsson, P., Hillered, L., Ponten, U., Ungerstedt, U. Changes in cortical extracellular levels of energy-related metabolites and amino acids following concussive brain injury in rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 10 (5), 631-637 (1990).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of neuroscience. 203 (1), 41-49 (2012).
- Dewitt, D. S., Perez-Polo, R., Hulsebosch, C. E., Dash, P. K., Robertson, C. S. Challenges in the development of rodent models of mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (9), 688-701 (2013).
- Eisenberg, M. A., Andrea, J., Meehan, W., Mannix, R. Time interval between concussions and symptom duration. Pediatrics. 132 (1), 8-17 (2013).
- Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. JAMA. 290 (19), 2549-2555 (2003).
- Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Frontiers in neurology. 5, 12 (2014).
- Meehan, W. P. 3rd, Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
- Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental neuroscience. 32 (5-6), 510-518 (2010).
- Schwetye, K. E., et al. Traumatic brain injury reduces soluble extracellular amyloid-beta in mice: a methodologically novel combined microdialysis-controlled cortical impact study. Neurobiology of disease. 40 (3), 555-564 (2010).
- Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. Journal of neuropathology and experimental neurology. 70 (7), 551-567 (2011).
- Willie, J. T., et al. Controlled cortical impact traumatic brain injury acutely disrupts wakefulness and extracellular orexin dynamics as determined by intracerebral microdialysis in mice. Journal of neurotrauma. 29 (10), 1908-1921 (2012).
- Bolton, A. N., Saatman, K. E. Regional neurodegeneration and gliosis are amplified by mild traumatic brain injury repeated at 24-hour intervals. Journal of neuropathology and experimental neurology. 73 (10), 933-947 (2014).
- Blaylock, R. L., Maroon, J. Immunoexcitotoxicity as a central mechanism in chronic traumatic encephalopathy-A unifying hypothesis. Surgical neurology international. 2, 107 (2011).
- McCrory, P., Davis, G., Makdissi, M. Second impact syndrome or cerebral swelling after sporting head injury. Current Sports Medecine Reports. 11 (1), 21-23 (2012).
- Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29 (12), 2172-2180 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th edn, Academic Press. (1998).
- Bales, J. W., Wagner, A. K., Kline, A. E., Dixon, C. E. Persistent cognitive dysfunction after traumatic brain injury: A dopamine hypothesis. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 33 (7), 981-1003 (2009).
- Sumbria, R. K., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochemical Research. 36 (1), 109-116 (2011).
