Este protocolo detalla los pasos quirúrgicos de un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, un modelo técnicamente desafiante que puede servir como una herramienta poderosa en el estudio del destino y la longevidad de las células del bazo, los mecanismos de distinto bazo las poblaciones celulares en progresión de la enfermedad e inmunidad al trasplante.
El bazo es un órgano linfoide único que desempeña un papel crítico en la la homeostasis de los sistemas inmunológico y hematopoyético. Los pacientes que se han sometido a una esplenectomía, independientemente de las causas desencadenantes, son propensos a desarrollar una infección de post-esplenectomía abrumadora y experimentan un mayor riesgo de trombosis venosa profunda y neoplasias malignas. Recientemente, los estudios epidemiológicos indicaron que la esplenectomía podría estar asociada a la aparición de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que las funciones fisiológicas del bazo aún no se han reconocido plenamente. Aquí, presentamos un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, que no sólo se puede utilizar para estudiar la función y la actividad conductual de los subconjuntos de células inmunitarias esplénica en diferentes procesos biológicos, sino que también puede ser una herramienta poderosa para probar el potencial terapéutico del trasplante de bazo en ciertas enfermedades. Los principales pasos quirúrgicos de este modelo incluyen la cosecha del bazo del donante, la extirpación del bazo nativo receptor y la revascularización del injerto del bazo. Utilizando cepas de ratón Congénicos (p. ej., ratones con fondos de CD 45.1/CD 45.2), observamos que después del trasplante singénico, los linfocitos esplénicos derivados de donantes y las células mieloide migraron del injerto tan pronto como el día 1 postoperatorio, concomitantemente con la afluencia de múltiples tipos de células destinatarias, generando así una quimera única. A pesar de las técnicas relativamente desafiantes, este procedimiento se puede realizar con > 90% tasa de éxito. Este modelo permite rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos durante el estado estacionario y en un entorno de enfermedad después de un trasplante de bazo, ofreciendo así una gran oportunidad para descubrir el papel distintivo de las células inmunes derivadas del bazo en diferentes procesos de la enfermedad.
El bazo es el órgano linfoide secundario más grande del cuerpo y es crítico en los sistemas inmunológico y hematopoyético. Sus funciones se llevan a cabo principalmente por dos compartimentos morfológicamente distintos, la pulpa roja y la pulpa blanca1. La pulpa roja es una malla tridimensional de senos venosos y cuerdas esplénica que consisten en fibras reticulares, células reticulares y macrófagos asociados. Esta estructura única permite que la pulpa roja actúe como un filtro sanguíneo eficaz que elimina los materiales extraños y los eritrocitos viejos o dañados. La pulpa blanca incluye folículos, zona marginal y vainas linfoides periarteriolares (PALS) y es un sitio importante para la captura y procesamiento de antígeno, el homing de linfocitos, la transformación, la proliferación y la maduración2. Sin embargo, el bazo se ha considerado comúnmente como un órgano prescindible porque otros órganos linfáticos, como los ganglios linfáticos, también pueden llevar a cabo algunas de sus funciones y la pérdida del bazo no suele conducir a la muerte. Por lo tanto, la esplenectomía se ha realizado ampliamente como un método terapéutico para pacientes con lesión esplénica o enfermedades hematológicas benignas3. Sin embargo, los pacientes con esplenectomía enfrentan una serie de complicaciones a largo plazo. Las infecciones bacterianas son las complicaciones mejor reconocidas de la esplenectomía4,5. Recientemente, la abrumadora sepsis post-esplenectomía ha sido reconocida como una complicación intensiva de la esplenectomía asociada a una alta mortalidad6. Por otra parte, estudios epidemiológicos recientes indican que la esplenectomía puede estar asociada a la ocurrencia de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que aún quedan por explorar las funciones fisiológicas del bazo7,8.
En la clínica se han utilizado tanto autotrasplante de bazo como alotrasplante de bazo. Actualmente, el autotrasplante de bazo mediante la implantación de secciones de tejido esplámico en bolsas creadas en el epiplón mayor se considera como la única posibilidad para preservar la función esplénica después de la esplenectomía traumática9,10. Sin embargo, la eficacia de esta cirugía es discutible como complicaciones post-cirugía como necrosis aséptica del tejido esplémico y la obstrucción del intestino delgado debido a adherencias postoperatorias podrían ocurrir11. La alotrasplante de bazo está implicada en el trasplante multivisceral12. La evidencia clínica del trasplante multivisceral sugiere que el alotrasplante de bazo puede desempeñar un papel protector en el rechazo de los aloinjertos intestinales pequeños sin causar enfermedad de injerto contra huésped (EICH)12. Sin embargo, la literatura sobre el efecto beneficioso del alotrasplante de bazo como componente del trasplante multivisceral sigue siendo limitada y los mecanismos subyacentes permanecen por definir. En 2006, Yair Reisner y otros informaron que el trasplante de tejido de bazo embrionario de cerdo que no tiene células T a los ratones podría curar la hemofilia a, una enfermedad genética sin causar la EICH13, apoyando que el transplante de bazo tiene una promesa terapéutica en ciertas enfermedades. Por lo tanto, es necesario seguir investigando sobre el potencial terapéutico del trasplante de bazo.
Los modelos animales de trasplante de bazo son valiosos para explorar la función no apreciada de las células inmunes derivadas del bazo en la progresión de la enfermedad, así como para probar el posible efecto terapéutico del trasplante de bazo. Se han documentado modelos experimentales de trasplantes de bazo enteros desde principios de 1900, según lo revisado por Cohen14. En 1969, Coburn Richard J. y Lee et al. detalló la técnica del trasplante de bazo en ratas15,16. Más recientemente, SWIRSKI FK y otros describieron un modelo de ratón de trasplante de bazo17. En comparación con los modelos de ratas, los modelos de ratones de trasplante de bazo son más atractivos debido a sus diversas ventajas inherentes. Por ejemplo, al utilizar un modelo de ratón, podemos acceder a una amplia variedad de reactivos no disponibles para los modelos de ratas. Por otra parte, mediante el uso de ratones Congénicos (por ejemplo, ratones con CD 45.1/CD 45.2 fondo), un trasplante singénico de bazo hace posible rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos18. Basado en el trabajo de SWIRSKI FK et al.17, también establecimos este protocolo simplificado y mejorado de trasplante de bazo en ratones. El protocolo descrito a continuación combina la confiabilidad y la viabilidad de una manera estandarizada y se puede utilizar como una herramienta para estudiar la biología del bazo y la inmunidad al trasplante.
Una evidencia convincente sugiere que los monocitos derivados del bazo desempeñan un papel importante en los procesos inflamatorios estériles como la aterosclerosis19, el cerebro isquémico agudo20 o la lesión pulmonar18, así como la lesión I/R miocárdica y Remodelación21,22,23. Estos informes destacan el papel de subreconocimiento del bazo en muchas …
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen el centro integral de trasplantes de Northwestern University y el programa de núcleos de investigación de Medicina Feinberg para apoyo de recursos y financiamiento. Concretamente, la citometría de flujo y los servicios de histología fueron proporcionados por el centro de citometría de flujo de la Universidad Northwestern y el laboratorio de histología y fenotipos de ratones, respectivamente, ambos apoyados por el NCI P30-CA060553 otorgado al Robert H Centro de cáncer integral de Lurie. Agradecemos al Sr. Nate Esparza la revisión de este manuscrito.
Ketamine | Wyeth | 206205-01 | |
Xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | |
Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
Injection grade normal saline | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-20 | |
70% Ethanol | Pharmco Products Inc. | 111000140 | |
ThermoCare Small Animal ICU System | Thermocare, Inc. | ||
Adson Forceps | Roboz Surgical Instruments | RS-5230 | |
Derf Needle Holder | Roboz Surgical Instruments | RS-7822 | |
Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instruments | RS-5881 | |
Micro-clip | Roboz Surgical Instruments | RS-5420 | |
7-0 silk | Braintree Scientific | SUT-S 103 | |
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle | Sharpoint DR4 | AK-2119 | |
Ms CD45.2 antibody | BD Bioscience | 553772 | |
Ms CD45.1 antibody | BD Bioscience | 553776 | |
Ms CD11b antibody | BD Bioscience | 557657 | |
Ms B220 antibody | BD Bioscience | 553089 | |
Ms Ly6C antibody | eBioscience | 48-5932-80 | |
Ms Ly6G antibody | BD Bioscience | 561236 | |
Ms F4/80 antibody | BD Bioscience | 565614 | |
Ms CD11c antibody | BD Bioscience | 558079 | |
Ms CD3 antibody | eBioscience | 48-0032-82 | |
Ms CD4 antibody | BD Bioscience | 552051 | |
Ms CD8 antibody | BD Bioscience | 563786 | |
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L34955 |