Summary
هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات الجراحية للنموذج الماوس من الاوعيه الدموية غير المتجانسة زرع الطحال ، وهو نموذج صعبه من الناحية الفنية التي يمكن ان تكون بمثابه أداه قويه في دراسة مصير وطول العمر من خلايا الطحال ، أليات الطحال متميزة الخلايا السكانية في تطور المرض ، وزرع المناعة.
Abstract
الطحال هو الجهاز اللمفاوية فريدة من نوعها التي تلعب دورا حاسما في التوازن من الجهاز المناعي والاجهزه التي تكون الدم. المرضي الذين خضعوا لاستئصال الطحال بغض السبب عن الأسباب المسببة هي عرضه لتطوير الساحقة بعد استئصال الطحال العدوى والخبرة زيادة مخاطر التخثر الوريدي العميق والأورام الخبيثة. في الاونه الاخيره ، أشارت الدراسات الوبائية إلى ان استئصال الطحال قد يكون مرتبطا بحدوث امراض القلب والاوعيه الدموية ، مما يوحي بان الوظائف الفسيولوجية لطحال لم يتم الاعتراف بها بعد بشكل كامل. هنا ، ونحن نقدم نموذج الماوس من الاوعيه الدموية غير المتجانسة زرع الطحال ، والتي ليس فقط يمكن استخدامها لدراسة وظيفة والنشاط السلوكي لمجموعات فرعيه الخلايا المناعية الطحال في العمليات البيولوجية المختلفة ، ولكن أيضا يمكن ان تكون أداه قويه لاختبار الإمكانيات العلاجية لزراعه الطحال في بعض الامراض. وتشمل الخطوات الجراحية الرئيسية لهذا النموذج حصاد الطحال المتبرع, أزاله الطحال الأصلي المتلقي, والطحال الترقيع التطعيم. باستخدام سلالات الماوس المنشا (علي سبيل المثال ، الفئران مع CD 45.1/CD 45.2 الخلفيات) ، لاحظنا انه بعد الزرع المتزامن ، هاجرت كل من الخلايا الليمفاوية المستمدة من المانحين والخلية النخاعية من الكسب غير المشروع في وقت لاحق من اليوم السابق للجراحة 1 ، يصاحب ذلك تدفق أنواع متعددة من الخلايا المتلقية ، التالي توليد الوهم فريدة من نوعها. وعلي الرغم من التقنيات الصعبة نسبيا ، يمكن تنفيذ هذا الاجراء مع معدل النجاح > 90 ٪. هذا النموذج يسمح تتبع مصير ، وطول العمر ، ووظيفة من الطحال خلال حاله مستقره وفي وضع المرض بعد زرع الطحال ، التالي تقديم فرصه كبيره لاكتشاف دور متميز للخلايا المناعية المستمدة من الطحال في مختلف العمليات المرض.
Introduction
الطحال هو أكبر جهاز لمفاوي ثانوي في الجسم ، وهو أمر بالغ الاهميه في الجهاز المناعي والاجهزه التي تكون الدم. وتضطلع بمهامها في المقام الأول من قبل اثنين من المقصورات المتميزة شكليا, اللب الأحمر واللب الأبيض1. اللب الأحمر هو العمل ثلاثي الابعاد من الجيوب الوريدية والحبال الطحال التي تتكون من ألياف شبكي ، خلايا شبكي ، والضامة المرتبطة بها. هذا الهيكل الفريد يسمح للب الأحمر بالعمل كفلتر دم فعال يزيل المواد الاجنبيه والكريات الحمر القديمة أو التالفة. ويشمل اللب الأبيض بصيلات, منطقه هامشيه, والبيريارتيريولار اللمفاوية (الزملاء) وهو موقع مهم لمحاصره مستضد ومعالجه, اللمفاوية الموجه, التحول, انتشار, ونضوج2. ومع ذلك, وقد اعتبر الطحال عاده كجهاز استغناء عن لان الاجهزه اللمفاوية الأخرى, مثل الغدد الليمفاوية, يمكن أيضا تنفيذ بعض وظائفها وفقدان الطحال لا يؤدي عاده إلى الموت. ولذلك تم اجراء استئصال الطحال علي نطاق واسع كطريقه علاجيه للمرضي الذين يعانون من إصابات الطحال أو امراض الدم الحميدة3. ومع ذلك ، يواجه المرضي الذين يعانون من استئصال الطحال عددا من المضاعفات علي المدى الطويل. التهابات البكتيرية هي أفضل المضاعفات المعترف بها من استئصال الطحال4,5. في الاونه الاخيره ، تم الاعتراف بالإنتان الساحق بعد استئصال الطحال كمضاعفات مكثفه لاستئصال الطحال المرتبطة بارتفاع معدل الوفاات6. وعلاوة علي ذلك ، تشير الدراسات الوبائية الاخيره إلى ان استئصال الطحال قد تترافق مع حدوث امراض القلب والاوعيه الدموية ، مما يوحي بان المزيد من الوظائف الفسيولوجية من الطحال لا تزال لاستكشاف7،8.
وقد استخدمت كل من زرع الطحال الذاتي وزراعه الطحال في العيادة. حاليا ، الطحال زرع الذاتي من خلال زرع الأجزاء من الانسجه الطحال في الحقائب التي تم إنشاؤها في مينوتوم أكبر يعتبر الامكانيه الوحيدة للحفاظ علي وظيفة الطحال بعد الصدمة استئصال الطحال9،10. ومع ذلك ، فان فعاليه هذه الجراحة قابله للنقاش كمضاعفات ما بعد الجراحة مثل نخر العقيم للانسجه الطحال وانسداد الأمعاء الدقيقة بسبب التصاقات بعد العملية الجراحية يمكن ان تحدث11. وتشارك زراعه الطحال في زرع متعدد الأحشاء12. تشير الادله السريرية من الزرع المتعدد الأحشاء إلى ان زراعه الطحال قد تلعب دورا وقائيا في رفض الكسب غير المزروع بالأمعاء الصغيرة دون التسبب في مرض الطعم مقابل المضيف (GVHD)12. ومع ذلك ، لا تزال الأدبيات المتعلقة بالتاثير المفيد لزراعه الطحال كمكون للزرع المتعدد الأحشاء محدوده ولا تزال أليات الاساسيه التي يتعين تحديدها. وفي ال2006 ، ذكر ياير راتنر وآخرون ان زرع انسجه الطحال الجنينية التي لا توجد بها خلايا تائية للفئران يمكن ان يشفي الاصابه بالشلل النصفي A ، وهو مرض وراثي دون ان يسبب GVHD13، ودعم ان زرع الطحال يحمل وعدا علاجيا في بعض الامراض. لذلك ، هناك حاجه لمزيد من التحقيقات حول الإمكانيات العلاجية لزراعه الطحال.
النماذج الحيوانية من زرع الطحال هي قيمه لاستكشاف وظيفة غير مقدره من الخلايا المناعية المستمدة من الطحال في تطور المرض وكذلك لاختبار التاثير العلاجي المحتمل لزرع الطحال. تم توثيق نماذج زراعه الطحال الكاملة التجريبية منذ أوائل القرن العشرين ، كما استعرضها كوهين14. في 1969, coburn ريتشارد j. ولي et al. مفصله تقنيه زرع الطحال في الفئران15,16. وفي الاونه الاخيره ، وصفت الدوامات FK وآخرون نموذج الماوس لزرع الطحال17. بالمقارنة مع نماذج الفئران ، نماذج الفار من زرع الطحال هي أكثر جاذبيه بسبب العديد من المزايا المتاصله. علي سبيل المثال ، من خلال استخدام نموذج الماوس ، يمكننا الوصول إلى مجموعه واسعه من الكواشف غير متوفرة لتلك النماذج الفئران. وعلاوة علي ذلك ، باستخدام الفئران الجينية (علي سبيل المثال ، الفئران مع CD 45.1/CD 45.2 الخلفية) ، وزرع الطحال synجينه يجعل من الممكن لتتبع مصير ، وطول العمر ، ووظيفة الطحال18. استنادا إلى العمل الذي تقوم به الدوامات FK وآخرون17، انشانا كذلك هذا البروتوكول المبسط والمعزز لزرع الطحال في الفئران. يجمع البروتوكول الموصوف أدناه بين الموثوقيه والجدوى بطريقه موحده ويمكن استخدامه كاداه لدراسة بيولوجيا الطحال ومناعة الزرع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع الإجراءات واستخدام الحيوانية في هذه الدراسة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة الداخلية للرعاية الحيوانية والاستخدام في جامعه نورث وسترن (IACUC). في هذه الدراسة ، واستخدمت 8 إلى 10 الأسبوع الذكور CD 45.2 و CD 45.1 الفئران (سواء علي الخلفية BALB/c ، من مختبر جاكسون) والمتبرعين الطحال والمتلقيين ، علي التوالي ، لخلق نماذج زرع الطحال synجينه. وكانت جميع الكائنات أليفه في بيئة معقمه في المرافق الحيوانية في جامعه نورث وسترن. تم تطبيق زيوت التشحيم العين علي جميع الفئران بعد التخدير لمنع جفاف.
1. التحضير الجراحي ، التخدير ، ونظام تسكين
- ضع ستاره معقمه يمكن التخلص منها (45.7 سم × 66 سم) علي المنصة الجراحية. انتزاع الماوس برفق ، حقن الكيتامين (50 ملغ/كغ) و اكسيليازين (10 ملغ/كغ) داخل الصفاق (ط. ع) للتخدير ، وحقن 0.05 ملغم/كغ بوبرينورفين جلد لتسكين.
- ضمان عمق التخدير عن طريق قرصه اصبع القدم ، وحلق الشعر في منطقه البطن كله مع الحلاقة ووضع الماوس علي منصة الجراحية العقيمة تحت المجهر التشغيل في التكبير 6-10x.
2. حصاد الطحال المتبرع
- تعقيم البطن مع وساده الاعداديه الكحول ، وتامين أطرافه مع الشريط الجراحية ، وجعل 3-4 سم خط الوسط شق الجلد العمودي من عانة إلى عمليه الخنجري مع مقص.
- اسحب جدار البطن مع الجرارات المعقمة المصنوعة من المشبك. انقل الأمعاء إلى الجانب الأيمن من البطن (يسار الجراح) مع مسحه قطنية معقمه للكشف عن الطحال. الكي الوريد المعدة قصيرة تعلق علي الطحال مع درجه حرارة منخفضه معقمه الحذر (الشكل 1A). وضع قطعه من الشاش المعقمة غارقه مع 37 درجه مئوية المالحة فوق الطحال للحفاظ علي رطبه (الشكل 1B).
- فصل وتعبئة الوريد المدخل من نسيج البنكرياس (الشكل 1C) عن طريق ربط فروع الوريد البابي (الوريد بانكريتيكودودينال العلوي والوريد المعدي الأيمن) ؛ وضع خياطه حول الوريد البوابة البعيدة من الوريد الطحال (الشكل 1D).
- الوجه الطحال إلى الجانب الأيمن لفضح الشريان الابهر والاضطرابات الهضمية مع الشريان الطحال (الشكل 1E). تشريح وتعبئة الشريان الابهري البطني-الطحال عن طريق ربط الشريان الكبدي والشريان المعدي. وضع خياطه حول الشريان الابهر القريب إلى الشريان البطني (الشكل 1F-G).
- حقن 100 الوحدات الدولية (IU) الهيبارين في الوريد الأجوف السفلي (IVC) لبالهيبارين الجسم كله والانتظار 3 دقائق للتاكد من ان الهيبارين اتخاذ الآثار. Ligate الابهر القريب إلى الشريان البطني ، جوال ميداني الوريد المدخل ، ثم حقنت الجسم كله باستخدام 10 مل من heparinized الباردة (4 درجه مئوية) المالحة (10 مل/20 ثانيه) من الشريان الابهر البطني البعيدة إلى الجذع البطني (الشكل 1h).
- جمع الطعم الطحال في كتله مع الجزء المرتبط الابهر-الاضطرابات الهضمية-الطحال والوريد المدخل جنبا إلى جنب مع شريحة من الوريد الطحال وجزء صغير من انسجه البنكرياس. الحفاظ علي الطعم في 5 مل من المحلول الملحي 4 درجه مئوية قبل زرع. موت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
3. المتلقي استئصال الطحال وزرع الترقيع الطحال
- وضع وساده التدفئة علي منصة الجراحية وضبط درجه الحرارة إلى 37 درجه مئوية. ضع ستاره معقمه (45.7 سم × 66 سم) فوق لوحه التسخين لإنشاء منصة جراحيه معقمه. كرر الخطوات 2.1 و 2.2 للتحضير الجراحي والتخدير. جعل شق الخط النصفي 3-4 سم وسحب جدار البطن كما هو موضح في الخطوة 2.1 والخطوة 2.2.
- نقل بعناية الأمعاء إلى الجانب الأيمن من الماوس مع مسحه قطنية معقمه لفضح الطحال المتلقي. Ligate الوريد الطحال والشريان وأزاله الطحال.
- نقل بعناية الأمعاء إلى الجانب الأيسر من الماوس وتغطيه الأمعاء مع الشاش الرطب (غارقه مع معقمه 37 درجه مئوية المالحة). تشريح وربط الفروع القطنية من الشريان الاورطي المتعدي و IVC; عبر المشبك الشريان الاورطي المتعدي و IVC باستخدام اثنين من المشابك ميكرووعائيه 4 مم.
- وضع خياطه النايلون 11-0 من خلال الشريان الاورطي المتعدي (سمك كامل) والتراجع لإنشاء أورتوتومي بيضاوي الشكل بواسطة قطعه واحده مع مقص (الطول يجب ان تتطابق مع قطر الشريان الابهر المتبرع ، الرقم 2A). بيرس IVC باستخدام ابره 30 G لإنشاء بضع القطع البيضاوي وتوسيع الفتحة إلى الجهة المانحة طول الوريد المتطابقة باستخدام المقص الصغير (الشكل 2A).
- مسح الدم داخل ألومنيوم أو تجلط الدم (في الشريان الابهر و IVC) مع 500 μL من المحلول الملحي heparinized (10 وحدات/مل).
- ضع طعم الطحال في الجناح الأيمن من بطن الفار المتلقي. تحديد بعناية كفه المتبرع الاورطي والوريد المدخل المتبرع. بعد التاكد من ان الاوعيه الدموية ليست ملتوية ، وتغطيه الطعم الطحال مع الشاش غارقه مع البرد (4 درجه مئوية) المالحة.
- قم بتوصيل كفه المتبرع بالشريان الابهري بالقمة القريبة والبعيدة لأورتاوتومي الخاصة بالمتلقي مع غرزين للبقاء (11-0 خيط من النايلون ، كما هو الحال أدناه) (الشكل 2 ب، ج). جعل الانسمام مع 2-3 لدغات من الخيوط النايلون المستمر 11-0 بين الكفة المتبرع الشريان الابهري وأورتاوتومي المتلقي (الجدار الامامي) (الشكل 2D). تحويل الطعم الطحال إلى الجانب الأيسر من المتلقي. جعل الانسمام بين الكفة الابهري المتبرع وأورتوتومي المتلقي (الجدار الخلفي) (الشكل 2E).
- قم باجراء العملية الجراحية لتوصيل وريد بوابه المتبرع بالجدار الخلفي لل IVC الخاص بالمستلم ، وذلك باستخدام 4 إلى 5 لدغات من الغرز المستمرة في داخل الجهاز ومن ثم إغلاق الخيط علي الجهة الخارجية لل IVC (الشكل 2F، G).
- الإفراج عن المشابك السفينة واستخدام مسحه القطن المعقمة إلى النزيف تاملونيد حتى يتم استرداد لون الطحال (الشكل 2H).
- إغلاق البطن مع خياطه vicryl الاصطناعية 5-0 قابل للامتصاص في نمط مستمر. إغلاق طبقه الجلد مع خياطه النايلون 5-0 في نمط توقف.
ملاحظه: بالنسبة للخطوات 4.7-4.8 ، بدلا من ذلك ، جعل الانسمام بين الوريد المدخل المتبرع والمتلقي IVC الاولي (الخطوة 4.8) ؛ ثم اجراء الانسمام بين الكفة الابهري المتبرع والجدار الخلفي لأورتوتومي المتلقي ، وذلك باستخدام 2 إلى 3 الغرز المستمر في داخل الشريان الابهر وإغلاق خياطه علي الخارج من الشريان الابهر.
4. الانتعاش الحيواني
- حقن 1 مل من جلد المالحة الدافئة عبر 4 مواقع منفصلة (0.25 mL/الموقع) بعد إغلاق البطن.
- الحفاظ علي الماوس في حاضنه التي تسيطر عليها درجه الحرارة (30 درجه مئوية) للساعات القليلة الاولي بعد العملية ، ومراقبه الماوس حتى استعاد وعيه كافيه ، ومن ثم نقل الماوس إلى قفص نظيف جديد مع الطعام العادي والماء ، مع وساده التدفئة (30 درجه مئوية ) تحت القفص. الحفاظ علي الماوس بعد الجراحة في قفص منفصل.
5. أداره الم بعد الجراحة
- حقن 0.05 ملغ/كغ البوبرينورفين جلد 24 h و 48 h بعد الجراحة للحفاظ علي نظام تسكين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن إكمال الاجراء بأكمله من زراعه الطحال الفئران في غضون 90 دقيقه من قبل الجراحين المجهريين ذوي الخبرة. وقد أجريت لدينا مختبر أكثر من 100 زرع الطحال في الفئران. معدل النجاح هو أكثر من 90 ٪ ، كما هو محدد من قبل بقاء كل من الماوس المتلقي والطعم الطحال ليوم ما بعد الجراحة (POD) 1 أو POD 7 (نقطه النهاية دراستنا). وأكد بقاء الطعم الطحال من قبل المظهر المجهري وتحليل تدفق الخلوي للخلايا الطحال. استنادا إلى تجربتنا ، وتحليل تدفق الخلوي (لايف/الميت اختبارات البقاء الخلية) حساسة جدا لتحديد ما إذا كان قد نجا من الترقيع الطحال ، كما ان غالبيه خلايا الطحال ستكون ميتة إذا كانت ترقيع الطحال نخريه. ويلخص الجدول 1التحديات التقنية لهذا الاجراء ، والتعقيدات الشائعة ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
لاختبار الشكل الترقيع بعد الزرع ، تم اجراء تلطيخ هيتوكيللين وايوسين (H & E) في ايزوترقيع الطحال من الفئران BALB/c في POD 1 و POD 7. وترد الصور التمثيلية في الشكل 3. ظلت الهندسة المعمارية للايزولات الطحال سليمه خلال الأسبوع الأول بعد الجراحة. وكان اللب الأحمر ، واللب الأبيض ، والمنطقة الهامشية لا تزال واضحة ومميزه. للتحقيق في هجره الخلايا بعد زراعه الطحال ، تم اجراء قياس التدفق الخلوي في POD 1 و POD 7 لفحص الأنماط الظاهرية لكريات الدم البيضاء في ايزوترقيع الطحال ، والغدد الليمفاوية ، والدماء ، ونخاع العظم. كما هو مبين في الشكل 4A، في POD 1 ، 51 ± 7 ٪ (يعني ± SD ، نفسه علي النحو التالي) من خلايا الطحال كانت مشتقه من المانحين و 46 ± 3 ٪ المستمدة من المتلقي. في POD 7 ، كانت الكريات البيضاء المشتقة من المتبرعين تمثل 32 ± 10 ٪ من إجمالي خلايا الطحال ، وكانت الخلايا المشتقة من المتلقي تصل إلى 56 ± 13 ٪. لاحظنا أيضا ان الكريات البيضاء الطحال هاجرت إلى الغدد الليمفاوية, الدم, ونخاع العظم في وقت مبكر من اليوم 1 والحفاظ عليها في اليوم 7 (الشكل 4B), توليد الوهم فريدة من نوعها قيمه للبحوث الاتجار بالخلايا الطحال.
الجدول 1: أساليب استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
الشكل 1: حصاد الطحال المتبرع. (ا) كوي الوريد المعدي القصير المرفق بالطحال. (B) وضع قطعه صغيره من الشاش الرطب الدافئة المعقمة علي الطحال للحفاظ علي رطبه. (ج) تشريح وعزل الوريد المدخل وراء البنكرياس. (د) ligate الفروع الجانبية لوريد البوابة ووضع خياطه جولة الوريد البوابة البعيدة إلى الوريد الطحال. الخطوط المتقطعة تمثل الموقع يقطع في وقت لاحق ل اناستاوسيس مع ivc المستلم. (ه) اقلب الطحال إلى الجانب الأيمن من البطن (يسار الجراح) للكشف عن الشريان الابهر والجذع البطني مع فروعه بما في ذلك الشريان الطحال. (و) تشريح وتعبئة الشريان الابهري-البطني-الطحال عن طريق ربط الفرعين الآخرين. (ز) وضع خياطه حول الشريان الابهر القريب إلى الشريان البطني. تمثل الخطوط المتقطعة الموقع الذي تم استخدامه لاحقا للانسمام مع الابهر البطني المتلقي. (ح) بعد ربط الشريان الابهر والوريد المدخل ، حقنت الطعم الطحال مع 10 مل من المحلول الملحي heparinized من خلال الشريان الابهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: زرع الطحال. (ا) بعد العزلة وعبر لقط الشريان الابهر و ivc ، وجعل أورتوتومي طوليه وبضع البطن في الشريان الابهر و ivc ، علي التوالي. (ب-د) ضع طعم الطحال علي الجانب الأيمن من البطن (الجانب الأيسر للجراح). جعل من النهاية إلى الجانب الانسمام بين الجهة المانحة الكفة الابهري والجدار الامامي لأورتوتومي المتلقي ، وذلك باستخدام 2-3 لدغات من خياطه مستمرة. (ه) تحويل الطعم الطحال إلى الجناح الأيسر من المتلقي ؛ تكرار الاجراء السابق بين الكفة الابهري المتبرع والجدار الخلفي لأورتوتومي المتلقي وإغلاق خياطه علي الخارج من الابهر. (واو-زاي) جعل من النهاية إلى الجانب الانسمام بين الوريد المدخل المتبرع والجدار الخلفي من IVC المتلقي ، وذلك باستخدام 4 إلى 5 لدغات من النايلون المستمر 11-0 خياطه في داخل IVC ومن ثم إغلاق خياطه علي الجزء الخارجي من IVC. (ح) بعد الانتهاء من الانسمام ، الإفراج عن المشابك السفينة ووضع بعض براعم القطن للمساعدة في وقف النزيف. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الانسجه التمثيلية من ايزوترقيع الطحال في اليوم 1 واليوم 7 بعد العملية. وأجريت مزارع الطحال synجينه باستخدام الفئران BALB/c. تم حصاد ايزوترقيع الطحال في اليوم 1 واليوم 7 بعد زرع والثابتة في فورالين 10 ٪ ل 48 h. H & E تلطيخ تم تنفيذها باستخدام البارافين جزءا لا يتجزا من الانسجه. وتبين الانسجه التمثيلية ان ايزوطعوم الطحال تبقي سليمه في 1 أسبوع بعد زرع. شريط مقياس = 250 μm. جراب ، يوم ما بعد العملية الجراحية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الوهم الذي خلقه زرع الطحال المتزامن. وأجريت ثلاثه مزارع الطحال المتزامنة باستخدام BALB/c CD 45.2 الفئران كجات مانحه و BALB/c CD 45.1 الفئران كمتلقيين. تم حصاد ترقيع الطحال ، والدم ، والعقدة الليمفاوية (LN) ، ونخاع العظم (BM) في الفئران المتلقية في اليوم 1 واليوم 7 بعد الزرع. تم اجراء العزل الخلوي المفرد وتحليل التدفق الخلوي لتحليل النمط الظاهري للخلايا. (ا) القطع التمثيلية النقطية (التي يتم الحصول عليها من المفردات الحية) التي تبين نسب الكريات البيضاء المشتقة من المتبرع أو المتلقي في العينات المشار اليها. (ب) النسب المئوية (المتوسطة ± SEM) للسكان المشار اليهم في الخلايا المستمدة من المانحين في العينات المشار اليها في اليوم 1 واليوم 7. جراب = يوم ما بعد العملية الجراحية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: المؤامرات التمثيلية (العدد = 3) التي تبين النسب المئوية للمفاويات مشتقه من الجهات المانحة في الطحال المزروع والعقدة الليمفاوية والدم ونخاع العظم. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: المؤامرات التمثيلية (العدد = 3) التي تبين النسب المئوية لCD11b المشتقة من الجهات المانحة مقابل المستفيدين + Ly6C + الخلايا الاحاديه في الطحال المزروع والعقدة الليمفاوية والدم ونخاع العظم. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أدله دامغه تشير إلى ان الخلايا الاحاديه المستمدة من الطحال تلعب دورا هاما في العمليات التهابيه العقيمة مثل تصلب الشرايين19, الدماغ نقص التروية الحاد20 أو أصابه الرئة18, وكذلك عضله القلب I/R أصابه أعاده عرض21,22,23. تسلط هذه التقارير الضوء علي دور الطحال الناقص في العديد من الامراض المزمنة ، والتي يعد مرض القلب والاوعيه الدموية فيها مهما (خاصه بالنظر إلى انه القاتل رقم واحد علي الصعيد العالمي). نموذج الماوس لزرع الطحال يوفر فرصه كبيره لاكتشاف دور الخلايا المناعية المستمدة من الطحال في الامراض المختلفة ، وكذلك كيف انها تستعد في الطحال. علي سبيل المثال ، باستخدام نماذج الماوس لزرع الطحال ، الدوامة وآخرون وجدت انه في استجابه للاصابه بعضله القلب الدماغية ، والخلايا الاحاديه المستمدة من الطحال زيادة حركتها ، والهجرة من الطحال ، والتمسك الانسجه المصابة ، والمساهمة في التئام الجروح17. وعلاوة علي ذلك ، هذا النموذج هو مفيد لمعالجه الميول من الخلايا المناعية الناضجة في الطحال واليات الكامنة واستكشاف الإمكانيات العلاجية لزرع الطحال.
وينبغي أخذ عده جوانب في الاعتبار لتحسين نجاح هذا البروتوكول. أولا ، من المهم لاختيار الحيوانية التجريبية السليمة اثناء عمليه التصميم منذ وزن الماوس ، وسلاله ، والحالة الصحية يمكن ان تؤثر علي صعوبة الخطوات الجراحية والنتائج التجريبية. ويوصي مختبرنا باستخدام الفئران القديمة 8 إلى 12 أسبوعا مع أكثر من 25 غرام من الوزن لإنقاص الوفاات التي قد تكون ناجمه عن النزيف. ثانيا ، خلال اجراء حصاد الطحال ، الكثير من التلاعب في الاوعيه الطحال يمكن ان يؤدي بسهوله إلى تربيه أو تشنج ويحتمل ان يؤدي إلى تجلط الدقيقة في الطعم الطحال. الحصول علي دراية تشريح البطن الماوس قبل الجراحة سيكون من المفيد لتسريع عمليه التعلم. ثالثا ، خلال عمليه جراحيه المتلقي ، يجب الحفاظ علي الطعم الطحال دائما رطبه وبارده. الحماية المناسبة لترقيع الطحال يمكن ان تقلل من الاصابه بنقص التروية/ضخ الدم (I/R) ومنع فشل الكسب غير السليم بعد الزرع. الاضافه إلى ذلك ، النظر إلى ان السفن المانحة لل اناستاوسيس طويلة نسبيا ، وضع ترقيع الطحال بشكل صحيح قبل الانسمام أمر بالغ الاهميه لمنع التواء الاوعيه. وعلاوة علي ذلك ، فان أقطار الأورتوتومي المتلقي وبضع البطن من IVC يجب ان تكون دائما مماثله لتلك التي من الشريان الاورطي المتبرع والوريد المدخل لضمان تدفق الدم السليم ومنع تخثر.
متوسط وقت التخزين من ترقيع الطحال في المحلول الملحي 4 ° c حوالي 10 دقيقه. وينبغي ان يقتصر الوقت الإجمالي الدماغية إلى اقل من 50 دقيقه لضمان الحد الأدنى من فشل زرع. ونحن نوصي باستخدام جامعه ويسكونسن (UW) حل التخزين البارد للحفاظ علي الطعم الطحال ، إذا كان أكثر من 1 ساعة الباردة ، وهناك حاجه إلى الوقت الدماغي في الدراسات. وتجدر الاشاره إلى ان جزءا صغيرا من البنكرياس نعلق بشكل وثيق مع الطحال ، ومحاولة أزاله كامل من ترقيع الطحال سيؤدي بسهوله إلى الطعم أو مضاعفات الاوعيه الدموية وزيادة ملحوظة في وقت العملية. لاحظنا ان الانسجه البنكرياس المرتبطة بالطعم الطحال سوف تخضع لضمور في جراب 7 علي الرغم من ان بعض بقيت قابله للحياة مع ترقيع الطحال. ما إذا كان لأزاله الانسجه البنكرياس المرفقة مع ترقيع الطحال يعتمد علي أغراض البحث.
توافر الفئران المولدة جعل من الممكن لتتبع أصل خلايا الطحال ، المتبرع مقابل المتلقي بعد الزرع. في هذه الدراسة ، استخدمنا BALB/c CD 45.2 و BALB/c CD 45.1 الفئران المتبرعين الطحال والمتلقيين لإنشاء نموذج زرع الطحال المتزامن. وقد تم زرع الأعضاء أو الانسجه بين هذه سلالات الماوس المولدة علي نطاق واسع لتتبع المنشا وتطوير الجهاز المناعي. وعلي الرغم من التقرير الأخير فيما يتعلق بطفرة النقطة المرتبطة بالقرص المضغوط 45.1 الذي يؤثر علي استجابه الخلايا NK24، لم يتم الإبلاغ عن اي رفض زرع بين هذه التركيبات سلاله. لاحظنا تدفقا كبيرا من الخلايا المتلقية إلى ترقيع الطحال التي وقعت في أقرب وقت في POD 1. ومن المحتمل ان تكون الخلايا المتلقية قد استجابت للاصابه بالاصابه الناجمة عن عمليه الزرع لان غالبيه الخلايا المتلقية كانت محببه. وأظهرت نتائجنا ان نسبه عاليه نسبيا من الخلايا الليمفاوية الطحال ظلت من أصل المانحين. ومن المثير للاهتمام ، ان هذه الخلايا الليمفاوية هاجرت إلى (أعيد ملؤها) في المقصورات اللمفاوية الأخرى (العقدة الليمفاوية ، نخاع العظم ، والدورة الدموية). هذه النتائج تدفعنا إلى التكهن بان الخلايا الليمفاوية التي نشات من طحال مهمة جدا في المناعة التكيفيه. ومع ذلك ، يلزم اجراء مزيد من التحقيقات لتحديد الأدوار المتميزة للمفاويات الطحال في المناعة التكيفيه مقابل الحصانة الفطرية (الشكل4، الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2).
ويتمثل الحد الرئيسي لهذا البروتوكول في انه يتطلب تدريبا مكثفا علي الجراحة المجهرية للافراد ذوي الخبرة الجراحية الدقيقة المحدودة لإتقان هذه التقنية. استنادا إلى تجربتنا التعلم في العام الماوس نماذج زرع الأعضاء الصلبة (علي سبيل المثال ، قلب الماوس ، الرئة ، أو زرع الكلي) ، فانه قد يستغرق 6-10 أشهر لشخص مدرب حديثا (دون اي تقنيه الجراحة المجهرية التجريبية) لإتقان هذا بمهارة تقنيه. بالمقارنة مع نماذج الماوس من القلب ، أو زرع الكلي ، وهذا النموذج يمكن ان يكون أكثر تحديا لأنه ينطوي علي خطوات اضافيه تشريح الانسجه لعزل الطعم الطحال خلال إجراءات المانحين. وعلاوة علي ذلك ، فان قطر الوريد المدخل المتبرع (حوالي 0.6 ملم) أصغر من IVC ، مما يجعل من الصعب علي الانسمام. وهناك قيد آخر هو انه ليس من الواضح ما إذا كان سيتم غزو الطحال المطعمة علي نطاق واسع من قبل الخلايا المتلقية في مرحله لاحقه زرع (علي سبيل المثال ، جراب 60). ومع ذلك ، هذا النموذج هو أيضا جذابة للغاية بالنسبة لها العديد من المزايا المتاصله. أولا ، تشترك الفئران والبشر في مجموعه كبيره من الجينوم المماثل ، مما يسمح بتمثيل دقيق نسبيا لتطبيق واقعي. وعلاوة علي ذلك ، مقارنه مع نموذج الماوس من غير الاوعيه الدموية الطحال زرع تلقائي باستخدام أقسام الانسجه الطحال ، وهذا النموذج زرع الطحال الاوعيه الدموية هو اقل عرضه لتطوير مضاعفات مثل نخر العقيم من الانسجه الطحال انسداد الأمعاء الصغيرة بسبب التصاقات ما بعد الجراحة.
وقد تم الإبلاغ عن نموذج الماوس لزرع الطحال سابقا من قبل الدوامات FK et al. ومع ذلك ، لم يتم وصف المعلومات التفصيلية. لدينا دراسة توفر بروتوكول خطوه بخطوه شامله من الفئران زرع الطحال للباحثين المهتمين لمتابعه والماتر هذه التقنية. وعلاوة علي ذلك ، يلغي هذا البروتوكول العديد من الخطوات غير الضرورية الموصوفة في التقرير من قبل الدوامات FK وآخرون. (علي سبيل المثال ، ربط القناة الصفراوية) ويقدم خياطه 11-0 للانسمام ، والتي من شانها ان تساعد علي تقصير الوقت الجراحي ومنع النزيف.
في الختام ، يمكن ان يكون هذا النموذج أداه قويه لاستكشاف أليات الخلايا الطحال السكان في الاستجابات لمسببات الامراض ، والإصابات ، والتهاب ، أو رفض زرع وقيمه لاختبار القدرات العلاجية للطحال زرع. مع التدريب المناسب والممارسة ، ويمكن تنفيذ هذا الاجراء مع النجاح > 90 ٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفون المركز الشامل لزراعه الكليات في جامعه نورث وسترن وبرنامج مدرسه فاينبرغ للبحوث الطبية لدعم الموارد والتمويل. علي وجه التحديد, تدفق الخلوي والانسجه الخدمات التي قدمتها جامعه نورث وسترن التدفق الخلوي الاساسيه مرفق والماوس الانسجه ومختبر التنميط, علي التوالي, ويدعم كل منها من قبل P30 CA060553 منحت لروبرت H مركز لوري الشامل للسرطان. نشكر السيد نيت اسبارزا علي تصحيح هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Wyeth | 206205-01 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | |
| Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Injection grade normal saline | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-20 | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc. | 111000140 | |
| ThermoCare Small Animal ICU System | Thermocare, Inc. | ||
| Adson Forceps | Roboz Surgical Instruments | RS-5230 | |
| Derf Needle Holder | Roboz Surgical Instruments | RS-7822 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instruments | RS-5881 | |
| Micro-clip | Roboz Surgical Instruments | RS-5420 | |
| 7-0 silk | Braintree Scientific | SUT-S 103 | |
| 11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle | Sharpoint DR4 | AK-2119 | |
| Ms CD45.2 antibody | BD Bioscience | 553772 | |
| Ms CD45.1 antibody | BD Bioscience | 553776 | |
| Ms CD11b antibody | BD Bioscience | 557657 | |
| Ms B220 antibody | BD Bioscience | 553089 | |
| Ms Ly6C antibody | eBioscience | 48-5932-80 | |
| Ms Ly6G antibody | BD Bioscience | 561236 | |
| Ms F4/80 antibody | BD Bioscience | 565614 | |
| Ms CD11c antibody | BD Bioscience | 558079 | |
| Ms CD3 antibody | eBioscience | 48-0032-82 | |
| Ms CD4 antibody | BD Bioscience | 552051 | |
| Ms CD8 antibody | BD Bioscience | 563786 | |
| LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L34955 |
References
- Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34 (5), 455-465 (2006).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9 (9), 428-437 (2017).
- Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99 (2), 392-398 (2014).
- Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95 (48), e5098 (2016).
- Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12 (12), 1314-1316 (2014).
- Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102 (8), 1333-1341 (2017).
- Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114 (14), 2861-2868 (2009).
- Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19 (2), 156-161 (2012).
- Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78 (3), 270-278 (1991).
- Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73 (2), 83-86 (1991).
- Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246 (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
- Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (50), 19075-19080 (2006).
- Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69 (6), 777-784 (1954).
- Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8 (1), 86-88 (1969).
- Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65 (3), 436-439 (1969).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325 (5940), 612-616 (2009).
- Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2833-2847 (2018).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
- Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), 1411-1419 (2014).
- Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39 (5), 806-818 (2013).
- Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18 (2), 1470320317706653 (2017).
- Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 62 (2016).
- Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200 (6), 1982-1987 (2018).
