Summary
פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הכירורגית של מודל העכבר של השתלת הטחול הטרולפית, מודל מאתגר מבחינה טכנית שיכול לשמש כלי רב עוצמה בחקר הגורל ואריכות החיים של תאי הטחול, מנגנונים של טחול ברורים אוכלוסיות תאים בהתקדמות המחלה, וחסינות להשתלה.
Abstract
הטחול הוא איבר הלימפה ייחודי המשחק תפקיד קריטי הומאוסטזיס של המערכת החיסונית המטתית. מטופלים שעברו כריתת טחול ללא קשר לגורמים מאיצים נוטים לפתח זיהום מוחץ לאחר כריתת הטחול וניסיון מוגבר של פקקת ורידים עמוקים וממאירות. לאחרונה, מחקרים אפידמיולוגיים ציין כי כריתת טחול עשוי להיות קשור להתרחשות של מחלות לב וכלי דם, הרומז כי פונקציות פיזיולוגיות של הטחול עדיין לא הכירו במלואו. כאן, אנו מציגים מודל העכבר של השתלת הטחול הטרולייום, אשר לא רק יכול להיות מנוצל כדי ללמוד את הפונקציה ואת פעילות התנהגותית של קבוצות החיסון של תאים חיסוניים הטחול בתהליכים יולוגי שונים, אבל גם יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לבדוק הפוטנציאל הטיפולי של השתלת הטחול במחלות מסוימות. השלבים העיקריים כירורגי של מודל זה כוללים הקציר הטחול התורם, הסרת טחול יליד הנמען, ו הטחול השתל revascularization. באמצעות זני העכבר הקונגניים (למשל, עכברים עם 45.1 CD/CD 45.2 רקעים), הבחנו כי לאחר השתלת syngeneic, הן לימפוציטים הטחול הנגזר שניהם, התאים מיאלואיד היגרו מתוך השתל מוקדם כמו יום שלאחר הניתוח 1, במקביל עם זרם של סוגים מרובים של תאים הנמען, ובכך לייצר כמירה ייחודית. למרות טכניקות מאתגרות יחסית, הליך זה ניתן לבצע עם > 90% שיעור הצלחה. מודל זה מאפשר מעקב אחר גורל, אריכות ימים, ותפקוד של הטחול במהלך המצב היציב בקביעת המחלה בעקבות השתלת הטחול, ובכך מציע הזדמנות גדולה לגלות את התפקיד הייחודי עבור תאים חיסוניים הנגזרים הטחול ב תהליכי מחלה שונים.
Introduction
הטחול הוא איבר הלימפה המשני הגדול ביותר בגוף, והוא קריטי במערכות החיסונית המטפאות. הפונקציות שלה מתבצעות בעיקר על ידי שני תאים ברורים מורפולוגית, את הציפה האדומה ואת עיסת לבן1. הציפה האדומה היא עבודה תלת ממדית של הסינוסים ורידים ומיתרי הטחול המורכבים מסיבים רשתית, תאי רשתית ומקרופאגים משויכים. זה מבנה ייחודי מאפשר עיסת אדום לפעול כמסנן דם אפקטיבי המסירה חומרים זרים או הישן או ניזוק אריתרופוציטים. הזולה הלבנה כוללת זקיקי, אזור שולי, ומעילי הלימפה periarteriolar (ידידי) והוא אתר חשוב להשמנה ועיבוד אנטיגן, ביות לימפוציטים, טרנספורמציה, התפשטות והתבגרות2. עם זאת, הטחול בדרך כלל נחשב כאיבר מותר כי איברים לימפתיים אחרים, כגון בלוטות הלימפה, יכול גם לבצע כמה פונקציות שלה ואת אובדן הטחול לא בדרך כלל להוביל למוות. כריתת טחול התבצע אפוא באופן נרחב כשיטה טיפולית עבור חולים עם פציעה הטחול או מחלות המטקולוגיות שפיר3. עם זאת, חולים עם כריתת טחול הפנים מספר סיבוכים ארוכי טווח. זיהומים חיידקיים הם הסיבוכים המוכרים ביותר של כריתת טחול4,5. לאחרונה הכירו את אלח-הדם המכריע שלאחר הטחול, כסיבוך אינטנסיבי של כריתת טחול הקשורה לתמותה גבוהה6. יתר על כן, מחקרים אפידמיולוגיים האחרונות מצביעים על כך שניתוח הטחול עשוי להיות קשור להתרחשות של מחלות לב וכלי דם, הרומז כי פונקציות פיזיולוגיות נוספות של הטחול נותרו לחקור7,8.
שניהם השתלת הטחול autotransplantation שתלת טחול השתמשו במרפאה. כיום, הטחול השתלת אוטומטית על ידי שתילת חלקים של רקמת הטחול לתוך שקיות שנוצרו במנטום הגדול נחשב האפשרות היחידה לשימור תפקוד הטחול לאחר כריתת טחול טראומטי9,10. עם זאת, את היעילות של ניתוח זה הוא במחלוקת כמו לאחר הניתוח סיבוכים כמו נמק אספטי של רקמת הטחול ואת חסימת המעי הקטן עקב הידקויות לאחר הניתוח יכול להתרחש11. השתלת הטחול מעורבת. בהשתלה מרובת הקרביים12 ראיות קליניות מפני השתלת מרובת הקרביים מציע כי השתלת הטחול עשוי לשחק תפקיד המגן דחייה קטנה אלוגרפט המעי ללא גרימת השתל-מול-מארחים מחלה (gvhd)12. עם זאת, ספרות לגבי ההשפעה המועילה של השתלת הטחול כרכיב של השתלת רב הקרביים עדיין מוגבל והמנגנונים הבסיסיים נשארים להיות מוגדרים. בשנת 2006, יאיר רייזנר ואח ' דיווחו כי שתילת רקמת הטחול מתחלקים חזיר כי אין תאי T לעכברים יכול לרפא המופיליה A, מחלה גנטית מבלי לגרום GVHD13, תמיכה השתלת הטחול מחזיקה הבטחה טיפולית מחלות מסוימות. לכן, יש צורך בחקירות נוספות על הפוטנציאל הטיפולי של השתלת הטחול.
מודלים של בעלי חיים של השתלת הטחול הם יקרי ערך כדי לחקור את תפקוד לא מוערך של תאים החיסון נגזר הטחול בהתקדמות המחלה, כמו גם כדי לבדוק את ההשפעה הטיפולית הפוטנציאלית של השתלת הטחול. השתלת הטחול המלא הדגמים תועדו מאז תחילת 1900, כפי שנבדקו על ידי כהן14. בשנת 1969, קובורן ריצ'רד ג'יי ולי ואח ' מפורטים הטכניקה של השתלת הטחול בחולדות15,16. לאחרונה, מסוויסקי FK אל. תיאר מודל העכבר של השתלת טחול17. לעומת מודלים חולדה, העכבר מודלים של השתלת הטחול הם אטרקטיביים יותר בשל היתרונות הטבועים שלה מספר. לדוגמה, על ידי ניצול מודל העכבר, אנחנו יכולים לגשת למגוון רחב של ריאגנטים לא זמין זה של מודלים חולדה. יתר על כן, באמצעות עכברים הקונגניים (למשל, עכברים עם CD 45.1/CD 45.2 רקע), השתלת הטחול syngeneic מאפשר לעקוב אחר הגורל, אריכות-החיים, ותפקוד של הטחול18. בהתבסס על העבודה על ידי מערבולות FK et al.17, הקמנו את הפרוטוקול הזה פשוט ומשופר של השתלת הטחול בעכברים. הפרוטוקול המתואר להלן משלב אמינות והיתכנות באופן מתוקננת ויכול להיות מנוצל ככלי למחקר ביולוגיה הטחול וחסינות השתלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים ואת השימוש בעלי חיים במחקר זה נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי האוניברסיטה הצפון מערבי טיפול בעלי חיים והוועדה השתמש (IACUC). במחקר זה, 8 כדי 10 שבוע בן זכר 45.2 CD ו-CD 45.1 עכברים (שניהם על רקע BALB/c, מ מעבדה ג'קסון) שימשו תורמים הטחול והנמענים, בהתאמה, כדי ליצור מודלים השתלת הטחול syngeneic. כל החיות שוכנו בסביבה סטרילית במתקני החי של אוניברסיטת נורת'ווסטרן. חומר הסיכה של העין הוחל על כל העכברים שלאחר ההרדמה כדי למנוע יובש.
1. הכנה כירורגית, הפחתות ומשטר כאבים
- מניחים העטוף סטרילי חד פעמי (45.7 ס מ x 66 ס מ) על פלטפורמת כירורגית. בעדינות לתפוס את העכבר, להזריק קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally (i. p) עבור הרדמה, ולהזריק 0.05 mg/ק"ג בופרנורפין תת-עורי עבור כאבים.
- להבטיח את עומק ההרדמה על ידי הבוהן, לגלח את השיער באזור כל הבטן עם תער ולמקם את העכבר על פלטפורמת כירורגי סטרילי תחת מיקרוסקופ ההפעלה בהגדלה 6-10x.
2. קציר הטחול התורם
- לחטא את הבטן עם כרית הכנה לאלכוהול, לאבטח את הגפיים עם הקלטת כירורגית, ולעשות 3-4 ס מ העור באמצע חתך ביניים אנכי מהערווה לתהליך xiphoid עם מספריים.
- למשוך את קיר הבטן עם רטרקטורים סטרילי עשוי מחסניות. הזז את המעיים לאגף הימני של הבטן (שמאל של המנתח) בצד עם מנקי כותנה סטרילית כדי לחשוף את הטחול. לצרוב את הווריד הקיבה קצר מוצמד הטחול עם החום סטרילי נמוכה הטמפרטורה (איור 1A). מניחים פיסת גזה סטרילית ספוגה 37 ° c מלוחים מעל הטחול כדי לשמור אותו לח (איור 1B).
- להפריד ולהניע את הווריד של הפורטל מרקמת הלבלב (איור 1C) על ידי ליגדירוג הענפים וריד הפורטל (pancreaticoduodenal וריד מעולה וריד הקיבה); מניחים תפר סביב וריד השער מתוך הווריד הטחול (איור 1D).
- הפוך את הטחול לצד ימין כדי לחשוף את עורק העורקים והגזע הצ עם עורק הטחול (איור 1E). ניתוח והניוד של עורק אבי העורקים-בחלל-הטחול על-ידי ליגולי עורק הכבד ועורק הקיבה; מסביב לעורק הראשי (איור 1F-G).
- הכנס 100 יחידות בינלאומיות (IU) הפארין לתוך הבנה הריק הנחותים (IVC) כדי heparinize את הגוף כולו ולחכות 3 דקות כדי להבטיח את הפארין לקחת אפקטים. לישער את אבי העורקים הנמצא מתחת לעורק הבטן, מעבר לווריד השער, ולאחר מכן מבשם את הגוף כולו באמצעות 10 מ ל של heparinized קר (4 ° c) תמיסת מלח (10 מ ל/20 s) מהאבי העורקים הבטני הגזע צליאק רייניאק (איור 1h).
- לאסוף את השתל הטחול en בלוקים עם הקשורים האבי העורקים בקטע הטחול ואת הווריד הפורטל יחד עם קטע של וריד הטחול וחלק קטן של רקמת הלבלב. שמור על השתל ב 5 מ ל של 4 ° c מלוחים לפני ההשתלה. המתת החסד של העכבר על ידי פריקה צוואר הרחם.
3. כריתת טחול המטופל השתל השרשה
- מניחים משטח חימום על הרציף הכירורגי ומתאימים את הטמפרטורה ל-37 ° c. מניחים את העטוף סטרילי (45.7 ס"מ x 66 ס מ) על גבי משטח החימום כדי ליצור פלטפורמה כירורגית סטרילית. חזור על שלבים 2.1 ו-2.2 להכנה כירורגית ולהרדמה. לעשות חתך 3-4 ס מ באמצע החיתוך ולמשוך את קיר הבטן כמתואר בשלב 2.1 צעד 2.2.
- בזהירות להעביר את המעי בצד ימין של העכבר עם מנקי כותנה סטרילית כדי לחשוף את הטחול של המטופל. . ולהסיר את הטחול
- בזהירות להעביר את המעי בצד שמאל של העכבר ולכסות את המעיים עם גזה רטוב (ספוגה עם סטרילי 37 מלוחים צלזיוס). מנתחים ומשערים את ענפי המותניים של העורקים המותני ואת האגודה העברית; באמצעות שני מלחציים מיקרוכלי-דם של 4 מ"מ.
- מניחים 11-0 ניילון תפר דרך העורקים למטה (עובי מלא) ולבטל כדי ליצור aortotomy אליפטי על ידי חתך אחד עם מיקרו מספריים (האורך צריך להתאים את קוטר העורקים של התורם, איור 2A). לנקב את ה-IVC באמצעות מחט של 30 גרם כדי ליצור בנייה אליפטית ולהאריך את הפתיחה לתוך וריד הפורטל תורם אורך בהתאמה באמצעות מיקרו מספריים (איור 2A).
- נקה את דם intraluminal או קריש דם (ב העורקים ו-IVC) עם 500 μL של מלוחים heparinized (10 יחידות/mL).
- מניחים את שתל הטחול באגף הימני של הבטן העכבר המטופל; זהות בזהירות את השרוול של אבי העורקים של התורם ואת וריד השער של התורם. לאחר שהבטיח כי כלי הדם אינם מעוותים, לכסות את שתל הטחול עם גזה ספוגה קר (4 ° c) תמיסת מלח.
- חבר את השרוול של אבי העורקים של התורם האבותיים והמרוחק של aortaotomy של המטופל עם שני תפרים להישאר (11-0 ניילון תפר, כמו להלן) (איור 2B, ג). הפוך השקה עם 2-3 עקיצות של התפרים ברציפות של 11-0 ניילון בין השרוול של אבי העורקים של התורם לבין aortaotomy של המטופל (הקיר הקדמי) (איור 2D). הפוך את שתל הטחול לצד השמאלי של הנמען; להפוך את החיבור בין השרוול אבי העורקים של התורם לבין הaortotomy של המטופל (הקיר האחורי) (איור 2E).
- בצעו השקה כדי לחבר את וריד הפורטל של התורם לקיר האחורי של המטופל, באמצעות 4 עד 5 עקיצות של תפרים מתמשכים בחלק הפנימי של ה-IVC ולאחר מכן סגרו את התפר בצד החיצוני של ה-IVC (איור 2F, G).
- שחררו את התפסים והשתמשו בספוגית כותנה סטרילית עד לדימום בטמפונאדה עד לשחזור צבע הטחול (איור 2H).
- סגרו את הבטן בעזרת מ5-0. סגור את שכבת העור עם תפר ניילון 5-0 בדפוס קטוע.
הערה: עבור השלבים 4.7-4.8, לחילופין, לבצע השקה בין וריד הפורטל של התורם לבין IVC של המטופל תחילה (שלב 4.8); לאחר מכן השתמש בחיבור בין השרוול אבי העורקים של התורם לבין הקיר האחורי של הaortotomy, תוך שימוש ב -2 עד 3 תפרים רציפים בתוך החלק הפנימי של אבי העורקים ולסגור את התפר בחלק החיצוני של אבי העורקים.
4. שחזור בעלי חיים
- הכנס 1 מ ל של תת-עורי מלוחים חמים דרך 4 מיקומים נפרדים (0.25 mL/מיקום) לאחר סגירת הבטן.
- שמור את העכבר בחממה מבוקרת טמפרטורה (30 ° c) עבור השעות הראשונות שלאחר הפעולה, לפקח על העכבר עד שהוא חזר להכרה מספקת, ולאחר מכן להעביר את העכבר לכלוב נקי חדש עם מזון רגיל ומים, עם משטח חימום (30 ° c ) מתחת לכלוב. לשמור על העכבר לאחר הניתוח בכלוב נפרד.
5. ניתוח לאחר כירורגי הכאב
- הכנס 0.05 mg/ק"ג בופרנורפין תת-עורי 24 h ו 48 h לאחר ניתוח כדי לשמור על משטר כאבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההליך כולו של השתלת הטחול העכבר ניתן להשלים בתוך 90 דקות על ידי מיקרו מנתחים מנוסים. המעבדה שלנו הופיעה על 100 השתלות הטחול בעכברים. שיעור ההצלחה הוא מעל 90%, כפי שהוגדר על ידי ההישרדות של שני העכבר הנמען ואת שתל הטחול ליום לאחר הניתוח (POD) 1 או POD 7 (נקודת הקצה של המחקר שלנו). ההישרדות של שתל הטחול אושרה על ידי המראה המקסקופי והזרימה cy, לנסות ניתוח של הטחול. בהתבסס על הניסיון שלנו, הזרימה cy, לנסות ניתוח (הכדאיות חי/מת תאים) הוא רגיש מאוד כדי לקבוע אם שתל הטחול הוא שרד, כמו רוב התאים הטחול יהיה מת אם שתלי הטחול היו נקרוטיק. האתגרים הטכניים של הליך זה, סיבוכים נפוצים, ופתרון בעיות שלהם מסוכמים בטבלה 1.
כדי לבדוק את מורפולוגיה השתל לאחר ההשתלה, Haemotoxylin ו אאוזין (H & E) כתמים בוצע הטחול איזושתלים של BALB/c עכברים ב POD 1 ו POD 7. התמונות הייצוגיות מוצגות באיור 3. הארכיטקטורה של איזושתלים בטחול נשארה שלמה במהלך השבוע הראשון של הפוסט-פעיל. הציפה האדומה, הציפה הלבנה, והאזור השולי היו עדיין ברורים וברורים. כדי לחקור את הגירה התא לאחר השתלת הטחול, הזרימה cy, לנסות להתבצע על POD 1 ו-POD 7 כדי לבחון את פנוטיפים של לוקיציטים בטחול, בלוטות הלימפה, דם, מח עצם. כפי שמוצג באיור 4A, ב POD 1, 51 ± 7% (ממוצע ± SD, כמו להלן) של תאי הטחול היו תורם-נגזר ו 46 ± 3% היו הנמען נגזר. ב POD 7, תורם-נגזר לוקיציטים שנספרו 32 ± 10% של תאי הטחול הכולל, ואת התאים נגזר המטופל היו עד 56 ± 13%. ראינו גם כי לוקיציטים הטחול הועברו לתוך בלוטות הלימפה, דם, מח עצם כמו מוקדם ביום 1 ומתוחזק ביום 7 (איור 4B), יצירת כמירה ייחודית בעלת ערך לחקר הטחול הסחר.
טבלה 1: שיטות פתרון בעיות.
איור 1: קציר הטחול של התורם. (א) מצרוב את וריד הקיבה הקצר המחובר לטחול. (ב) המקום פיסת קטן של גזה סטרילי חם רטוב על הטחול כדי לשמור אותו לח. (ג) לנתח ולבודד את הווריד של השער מאחורי הלבלב. (ד) ליגייט את הענפים הצדדיים של וריד השער והניחו תפר מסביב לווריד השער. הקווים המוקוורים מייצגים את המיקום מאוחר יותר עבור החיבור עם ה-IVC של הנמען. (ה) הפוך את הטחול לצד הימני של הבטן (שמאל של המנתח) כדי לחשוף את עורק העורקים והגזע הצ עם ענפיו כולל עורק הטחול. (ו) לנתח ולגייס עורק של אבי העורקים-הטחול, על-ידי ליגיית שני הענפים האחרים. (G) מניחים תפר סביב העורקים האבובית לעורק הקלאני. הקווים המקווקו מייצגים את המיקום המשמש מאוחר יותר להשקה עם אבי העורקים הבטן המטופל. (ח) לאחר ליגגף העורקים והעברת הווריד הפורטל, מבשם שתל הטחול עם 10 מ ל של המלח החיניאד דרך העורקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השתלת שתל הטחול. (א) לאחר בידוד ולחצות את העורקים ו-ivc, לעשות aortotomy האורך והחיתוך של העורקים ו-ivc, בהתאמה. (B-D) מניחים את שתל הטחול בצד ימין של הבטן (צד שמאל של המנתח). הפוך את החיבור הסופי בין השרוול של אבי העורקים לבין הקיר הקדמי של הaortotomy של המטופל, תוך שימוש ב-2-3 עקיצות של תפר מתמשך. (ה) הפוך את שתל הטחול אל האגף השמאלי של הנמען; חזור על ההליך הקודם בין השרוול של אבי העורקים התורם לבין הקיר האחורי של הaortotomy של המטופל ולסגור את התפר על החלק החיצוני של אבי העורקים. (F-G) הפוך את החיבור מהסוף לקצה בין הווריד של שער התורם לבין הקיר האחורי של הנמען, תוך שימוש ב -4 עד 5 עקיצות של תפר מתמשך 11-0 ניילון בתוך ה-IVC ולאחר מכן סגור את התפר בצד החיצוני של ה-IVC. (ח) לאחר השלמת החיבור, שחרר את מלחציים כלי הקיבול והניחו כמה ניצנים כותנה כדי לסייע בעצירת הדימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: נציג היסטולוגיה של הטחול איזושתלים ביום 1 ויום 7 לאחר הפעולה. הספעות הטחול הסינאיות בוצעו באמצעות עכבר BALB/c. איזושתלים הטחול נקצרו ביום 1 ויום 7 לאחר ההשתלה וקבוע ב 10% פורמלין עבור 48 h. h & E כתמים בוצע באמצעות פרפין מוטבע מקטע רקמות. היסטולוגיה נציג מראה כי הטחול איזושתלים נשארים ללא פגע בשבוע 1 post-השתלת. סרגל קנה מידה = 250 μm. . תרמיל, יום אחרי הניתוח אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הכימרה שנוצרה ע י. השתלת טחול סינמית שלושה השתלים הטחול synic בוצעו באמצעות BALB/c תקליטור 45.2 עכברים כמו תורמים ו BALB/c CD 45.1 עכברים כנמענים. שתלי הטחול, דם, הלימפה (LN), ואת מח העצם (BM) בעכברים הנמען נקצרו ביום 1 ויום 7 לאחר ההשתלה. בידוד תא בודד הניתוח cy, מנתחים בוצעו כדי לנתח את הפנוטיפים של התאים. (א) מגרשים מייצגים (הנובעים משידור חי) מראה את אחוזי התורם או המקבל-לוקיציטים נגזרות בדגימות שצוינו. (ב) אחוזים (פירושו ± SEM) של האוכלוסיות המסומנות בתאים הנגזרים מתורמים בדגימות שצוינו ביום 1 וביום 7. POD = יום לאחר הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: מגרשים מייצגים (n = 3) מראה את האחוזים של תורם נגזר לעומת לימפוציטים נגזר המטופל בטחול המושתלים, בצומת הלימפה, דם, מח עצם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: מגרשים מייצגים (n = 3) מראה את אחוזי התורמים הנגזרים לעומת המטופל נגזר CD11b + Ly6C + מונוציטים בטחול המושתלים, בצומת לימפה, דם, מח עצם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ראיות משכנעות עולה כי הטחול נגזר מונוציטים לשחק תפקיד חשוב בתהליכים דלקתיים סטרילי כגון טרשת עורקים19, המוח האיסכמי חריפה20 או פציעה בריאה18, כמו גם שריר הלב I/R פציעה . שיפוץ21,22,23 דוחות אלה להדגיש את תפקיד תחת הכרה של הטחול במחלות כרוניות רבות, אשר מחלות לב וכלי דם היא אחת חשובה (במיוחד בהתחשב בכך הוא הרוצח מספר אחד ברחבי העולם). מודל העכבר של השתלת הטחול מציע הזדמנות גדולה לגלות את התפקיד של תאים חיסוניים הנגזרים הטחול במחלות שונות, כמו גם איך הם מוכן הטחול. לדוגמה, באמצעות מודלים העכבר של השתלת הטחול, מערבולות ואח ' נמצא כי בתגובה לפציעה באוטם שריר הלב, הטחול נגזר מונוציטים להגדיל את התנועתיות שלהם, להגר מתוך הטחול, לדבוק ברקמה פצועה, ולתרום ל פצע הריפוי17. יתר על כן, מודל זה שימושי כדי לטפל בlongevities של תאים חיסוניים בוגרים בטחול המנגנון הבסיסי כדי לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של השתלת הטחול.
יש לקחת בחשבון מספר היבטים כדי לשפר את הצלחת הפרוטוקול. ראשית, זה קריטי לבחור את החיות ניסיוני הנכון במהלך תהליך העיצוב מאז משקל העכבר, המתח, מצב בריאותי יכול להשפיע על הקושי של צעדים כירורגיים ותוצאות ניסיוני. המעבדה שלנו ממליצה להשתמש 8 כדי 12 שבועות עכברים ישנים עם מעל 25 גרם משקל כדי להקטין את התמותה שעשוי להיגרם על ידי דימום. שנית, במהלך הליך הקציר הטחול, מניפולציה יותר מדי של כלי הטחול יכול בקלות להוביל להתרבות או התכווצות והתוצאה עלולה לגרום פקקת מיקרו בשתל הטחול. היכרות עם האנטומיה של הבטן העכבר לפני הניתוח יהיה מועיל להאיץ את תהליך הלמידה. שלישית, במהלך ניתוח הנמען, שתל הטחול צריך תמיד להישמר לח וקריר. הגנה מתאימה של שתלי הטחול יכול להפחית את איסכמיה השתלת/reperfusion (I/R) פציעה ולמנוע כשל שתל לאחר ההשתלה. בנוסף לכך, בהתחשב בכך שכלי התורם להשקה הינו ארוך יחסית, ממקמים את שתלי הטחול כראוי לפני שהחיבור הוא קריטי כדי למנוע פיתול של כלי הדם. יתר על כן, הקטרים של aortotomy המטופל והניתוח של IVC צריך להיות תמיד דומה לאלה של היום העורקים התורם ואת הווריד הפורטל כדי להבטיח את זרימת הדם הנכונה ולמנוע פקקת.
זמן אחסון ממוצע של שתלי הטחול ב 4 מלוחים ° c הוא סביב 10 דקות. הזמן הכולל איסכמי צריך להיות מוגבל פחות מ 50 דקות כדי להבטיח כשל השתלה מינימלי. אנו ממליצים על שימוש באוניברסיטת ויסקונסין (UW) פתרון אחסון קר כדי לשמר את השתל הטחול, אם מעל 1 h קר, איסכמי זמן נדרש במחקרים. יש לציין כי חלק קטן של הלבלב באופן אינטימי לצרף עם הטחול, ולנסות להסיר את כל שתלי הטחול יהיה בקלות להוביל השתלת או בעיות כלי דם ולהגדיל בצורה ניכרת את זמן הפעולה. הבחנו כי הרקמה הלבלב מחוברת השתל הטחול יעבור ניוון ב POD 7 למרות כמה נשארו קיימא עם שתלי הטחול. האם להסיר את רקמת הלבלב מחוברת עם שתלי הטחול תלוי במטרות מחקר.
זמינות של עכברים הקונגניים הפכה את האפשרות לעקוב אחר המקור של תאי הטחול, תורם לעומת הנמען לאחר ההשתלה. במחקר זה, השתמשנו BALB/c CD 45.2 ו BALB/c CD 45.1 העכברים הקונגניים כמו תורמים הטחול ואת הנמענים ליצור מודל השתלת הטחול syngeneic. השתלת איברים או רקמה בין זנים אלה העכבר הקונגניים השתמשו נרחב כדי לעקוב אחר המקור ופיתוח של מערכת החיסון. למרות הדו ח האחרון לגבי מוטציה נקודה הקשורים CD 45.1 המשפיעים על תגובה תא NK24, לא דווחה דחייה השתלת בין אלה שילובים הזנים. הבחנו זרם משמעותי של תאי הנמען לתוך שתלי הטחול שהתרחשו ברגע POD 1. סביר להניח שתאי הנמען הגיבו לפציעת I/R של ההשתלה כרוב תאי הנמען היו גרנולוציטים. התוצאות שלנו הראו כי אחוז גבוה יחסית של לימפוציטים הטחול נשאר ממקור תורם. מעניין יותר, לימפוציטים אלה הועברו (לאכלס מחדש) בתאי הלימפה אחרים (הלימפה, מח עצם, ומחזור). ממצאים אלה מציגים לנו לשער כי לימפוציטים שמקורם טחולים הם חשובים מאוד חסינות אדפטיבית. עם זאת, החקירות יותר נדרשים כדי להתוות את התפקידים הייחודיים של לימפוציטים הטחול בתוך החסינות הטבועה לעומת מולדים (איור 4, איור משלים 1 ואיור המשלים 2).
המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא כי היא דורשת הכשרה מיקרוכירורגית נרחבת עבור אנשים עם ניסיון מיקרו כירורגי מוגבל לשלוט בטכניקה זו. בהתבסס על חווית הלמידה שלנו בכלל העכבר מוצק מודלים השתלת איברים (g., לב העכבר, ריאות, או השתלת כליה), זה יכול לקחת 6-10 חודשים עבור אדם מיומן החדש (ללא כל טכניקה מיקרו כירורגית ניסיוני) כדי לשלוט במיומנות זו טכניקה. לעומת מודלים העכבר של הלב, או השתלת כליה, מודל זה יכול להיות מאתגר יותר מאז הוא כרוך תוספת לניתוח שלבים נוספים כדי לבודד את שתל הטחול במהלך הליכי תורם. יתר על כן, קוטר הווריד של שער התורם (סביב 0.6 מ"מ) קטן יותר מ-IVC, מה שמקשה על ההשקה. מגבלה נוספת היא כי לא ברור אם הטחול מושתל יהיה פלש מאסיבית על ידי המטופל ' תאים בשלב מאוחר יותר השתלת (למשל, POD 60). עם זאת, מודל זה גם אטרקטיבי עבור היתרונות הטבועים שלה מספר. ראשית, עכברים ובני אדם חולקים מגוון משמעותי של genomes דומים, ובכך מאפשר ייצוג מדויק יחסית של יישום ריאליסטי. יתר על כן, השוואת המודל העכבר של השתלת הטחול שאינם השתל באמצעות סעיפים של רקמת הטחול, זה השתלת ואצלב הטחול המודל הוא פחות סביר לפתח סיבוכים כגון נמק של רקמת הטחול ו חסימת מעיים קטנה. עקב הידקויות פוסט-אופרטיביות
המודל של העכבר של השתלת הטחול דווחה בעבר על ידי הסווידסקי ועוד אל. עם זאת, המידע המפורט לא תואר. המחקר שלנו מספק פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף של השתלת הטחול העכבר עבור חוקרים מעוניינים לעקוב ולאחר מאטר טכניקה זו. יתר על כן, פרוטוקול זה מבטלת מספר שלבים מיותרים המתוארים בדו ח על ידי הסווינסקי FK אל. (למשל, צינור המרה) ומציג את תפר 11-0 לחיבור, אשר יסייע לקצר את הזמן כירורגי ולמנוע את הדימום.
לסיכום, מודל זה יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור את המנגנונים של האוכלוסייה תא הטחול בתגובות פתוגנים, פציעה, דלקת, או דחייה השתלת והוא בעל ערך למבחן הפוטנציאל התרפויטי של הטחול שתלת. עם הכשרה נכונה ותרגול, הליך זה יכול להתבצע עם > 90% הצלחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחברים תודה נורת'ווסט המרכז להשתלות מקיף ובית הספר פיינברג לחקר הרפואה תוכנית ליבות לתמיכה משאבים ומימון. במיוחד, הזרימה Cy, היסטולוגיה שירותים סופקו על-ידי האוניברסיטה הצפון מערבי זרימה Cy, מתקן ליבה המכון והיסטולוגיה העכבר המעבדה פנוטיפים, בהתאמה, שניהם נתמכים על ידי NCI P30-CA060553 הוענק רוברט H מרכז לוריא לסרטן מקיף. אנו מודים למר נייט אגספזה. על הגהה של כתב היד
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Wyeth | 206205-01 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | |
| Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Injection grade normal saline | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-20 | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc. | 111000140 | |
| ThermoCare Small Animal ICU System | Thermocare, Inc. | ||
| Adson Forceps | Roboz Surgical Instruments | RS-5230 | |
| Derf Needle Holder | Roboz Surgical Instruments | RS-7822 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instruments | RS-5881 | |
| Micro-clip | Roboz Surgical Instruments | RS-5420 | |
| 7-0 silk | Braintree Scientific | SUT-S 103 | |
| 11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle | Sharpoint DR4 | AK-2119 | |
| Ms CD45.2 antibody | BD Bioscience | 553772 | |
| Ms CD45.1 antibody | BD Bioscience | 553776 | |
| Ms CD11b antibody | BD Bioscience | 557657 | |
| Ms B220 antibody | BD Bioscience | 553089 | |
| Ms Ly6C antibody | eBioscience | 48-5932-80 | |
| Ms Ly6G antibody | BD Bioscience | 561236 | |
| Ms F4/80 antibody | BD Bioscience | 565614 | |
| Ms CD11c antibody | BD Bioscience | 558079 | |
| Ms CD3 antibody | eBioscience | 48-0032-82 | |
| Ms CD4 antibody | BD Bioscience | 552051 | |
| Ms CD8 antibody | BD Bioscience | 563786 | |
| LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L34955 |
References
- Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34 (5), 455-465 (2006).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9 (9), 428-437 (2017).
- Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99 (2), 392-398 (2014).
- Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95 (48), e5098 (2016).
- Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12 (12), 1314-1316 (2014).
- Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102 (8), 1333-1341 (2017).
- Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114 (14), 2861-2868 (2009).
- Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19 (2), 156-161 (2012).
- Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78 (3), 270-278 (1991).
- Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73 (2), 83-86 (1991).
- Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246 (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
- Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (50), 19075-19080 (2006).
- Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69 (6), 777-784 (1954).
- Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8 (1), 86-88 (1969).
- Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65 (3), 436-439 (1969).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325 (5940), 612-616 (2009).
- Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2833-2847 (2018).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
- Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), 1411-1419 (2014).
- Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39 (5), 806-818 (2013).
- Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18 (2), 1470320317706653 (2017).
- Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 62 (2016).
- Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200 (6), 1982-1987 (2018).
