Summary
여기서, 우리는 호중구 계보 세포의 고차원 질량 세포측정 (비행 시간, CyTOF에 의한 세포 측정) 분석을 위해 마우스 또는 인간으로부터 분리 된 신선한 골수 (BM)를 처리하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
이 문서에서는, 우리는 전체 BM CyTOF 분석을 위한 신선한 BM에 있는 호중구 계보 세포를 보존하기 위하여 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 골수성 편향 된 39 항체 CyTOF 패널을 사용하여이 프로토콜을 사용하여 호중구 혈통 세포에 초점을 맞춘 조혈 시스템을 평가했습니다. CyTOF 결과는 오픈 리소스 차원 감소 알고리즘, viSNE로 분석되었고, 데이터는 이 프로토콜의 결과를 입증하기 위해 제시되었다. 우리는 이 프로토콜에 근거를 둔 새로운 호중구 혈통 세포 인구를 발견했습니다. 신선한 전체 BM 제제의 이 프로토콜은 1), 전체 BM에서 확인되지 않은 세포 집단을 발견하기 위해 CyTOF 분석을 위해 사용될 수 있습니다, 2), 백혈병과 같은 혈액 장애를 가진 환자를 위한 전체 BM 결점을 조사하는, 3), 의 최적화를 지원 신선한 전체 BM을 활용하는 형광 활성화 유동 세포 분석 프로토콜.
Introduction
지난 수십 년 동안, 세포 분석 방법은 BM의 조혈 시스템을 조사하는 강력한 도구되었습니다. 이러한 방법은 중금속 표지 항체를 사용하여 형광 활성화 유동 세포 분석 및 CyTOF의 새로운 방법을 포함한다. 그(것)들은 그들의 유일한 표면 마커 발현 단면도의 확인에 의하여 이기종 생물학 견본에 있는 많은 세포 모형의 발견으로 이끌어 냈습니다. 더 많은 채널과 관련된 스펙트럼 중복이 증가하면 형광 활성화 유동 세포 분석 애플리케이션에서 더 높은 데이터 부정확성이 발생합니다. 따라서, 불순한 세포는 형광 활성화 유동 세포 분석 분석을 위한 관심있는 세포 인구를 풍부하게 하기 위하여 일상적으로 제거됩니다. 예를 들어, Ly6G (또는 Gr-1) 및 CD11b는 성숙한 골수성 세포 마커로 간주되며 Ly6G+ (또는 Gr-1+) 및 CD11b+ 세포는 유세포 분석 전에 자기 농축 키트를 사용하여 BM 샘플에서 일상적으로 제거됩니다. 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 또는 하나의 덤프 칵테일 채널 1,2,3에이러한 마커를 결합하여. 또 다른 예는 호중구가 면역학 연구를 위한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 풍부하게 하기 위하여 인간적인 혈액 견본에서 일상적으로 제거된다는 것입니다. 마우스 또는 인간에서 격리된 전체 골수는, 그러나, 세포 측정 분석을 위해 손상되지 않는 조사되지 않습니다.
최근 CyTOF는 조혈 계 4,5,6을조사하는 혁신적인 도구가되었습니다. CyTOF를 사용하면 불소 표지 된 항체가 무거운 원소 리포터 표지 된 항체로 대체됩니다. 이 방법을 사용하면 스펙트럼 중복의 염려 없이 동시에 40개 이상의 마커를 측정할 수 있습니다. 사전 고갈 단계 또는 덤프 채널없이 그대로 생물학적 시편의 분석을 가능하게했다. 따라서, 우리는 기존의 2차원 유동 세포분석 플롯에서 고함량 치수성으로 조혈계를 종합적으로 볼 수 있습니다. 고갈 또는 게이팅 공정 동안 과거에 생략된 세포 집단은 이제 CyTOF4,5에의해 생성된 고차원 데이터로 빛을 가져올 수 있다. 우리는 동시에 골수성 보리 7에 초점을 맞춘 조혈 시스템에서 39 개의 매개 변수를측정하는 항체 패널을 설계했습니다. 기존의 유세포분석 데이터와 비교할 때 CyTOF에 의해 생성된 전례 없는 단세포 고차원 데이터의 해석과 시각화는 매우 까다롭습니다. 전산 과학자들은 고차원 데이터 세트의 시각화를 위한 차원 감소 기술을 개발했습니다. 이 문서에서는 T-분산 형 핵 종자 포함 (t-SNE) 기술을 사용하여 CyTOF 데이터를 분석하고 고차원 구조를 보존하면서 2 차원지도에 고차원 결과를 제시하는 알고리즘 viSNE을 사용했습니다. 데이터 8,9,10. tSNE 플롯에서 유사한 셀이 하위 집합으로 클러스터되고 색상이 셀의 특징을 강조 표시하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 도 1에 대해 골수성 세포는 CyTOF(도1)4로부터 유래된 33개의 표면 마커의발현 패턴의 유사성에 기초하여 여러 세포 서브세트로 분포된다. 여기에서 우리는 viSNE 분석 7에 의하여 우리의 이전에 보고된 39마커 CyTOF 패널을 가진 마우스 골수를 조사했습니다. 우리의 CyTOF 데이터의 viSNE 분석은 HSPC (CD117 ++) 및 호중구 (Ly6G+) 특성 을 모두 보여 준 미확인 세포 집단을 밝혀냈다 (도2)7.
결론적으로, 우리는 CyTOF 분석을 위한 신선한 전체 골수를 처리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 문서에서는, 우리는 예를 들면 마우스 골수를 이용했습니다, 이 프로토콜은 또한 인간적인 골수 견본을 가공하기 위하여 이용될 수 있는 동안. 인간 골수 견본에 특정한 세부 사항은 또한 프로토콜에서 또한 주의됩니다. 이 프로토콜의 장점은 전체 골수에 대한 조사를 가능하게하기 위해 전체 골수에서 호중구 혈통 세포를 보존하도록 최적화 된 인큐베이션 시간 및 온도와 같은 세부 사항을 포함하고 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 또한 형광 활성화 유동 세포 분석 응용 프로그램에 대해 용이하게 수정될 수 있다.
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Protocol
모든 실험은 라호야 알레르기 및 면역학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 된 지침을 따랐으며, 설치류 사용에 대한 승인은 라 호야 알레르기 및 면역학 연구소에서 설명 된 기준에 따라 획득되었습니다. 건강의 국가 학회에서 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드.
1. 수확 마우스 골수 (BM)
- 상업 공급 업체에서 C57BL /6J 마우스를 구입. 병원균이 없는 시설에서 마이크로이솔레이터 케이지에 표준 설치류 차우 식단과 집을 먹이라.
- 실험 목적으로 생쥐 6-10주를 사용하십시오. CO2 흡입에 의해 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.
- 마우스를 복부 쪽을 위로 올려 놓고 멸균 수술 패드에 놓습니다. 70 % 에탄올을 분사하여 복부와 뒷다리 부위의 피부를 살균하십시오. 복강을 열어 절단해 해부 수술 가위 한 쌍을 사용합니다.
- 뒷다리를 노출하기 위해 피부를 제거합니다. 무딘 팁 드레싱 포셉을 사용하여 마우스 경골을 발목 바로 아래에 고정시됩니다. 또 다른 한 쌍의 커브드레싱 집게를 사용하여 무딘 팁 드레싱 집게 아래의 경골을 안정시보세요. 경골을 부수고 무딘 팁 드레싱 집게로 근육을 찢어 뼈를 노출하십시오.
참고: 경골은 무릎 관절에 느슨하게 부착되어 무딘 팁 드레싱 집게를 사용하여 쉽게 선택할 수 있습니다. - 차가운 1x PBS에 경골을 놓습니다.
- 다음으로, 안정화 된 곡선 드레싱 집게를 대퇴골으로 아래로 이동합니다. 무딘 팁 드레싱 집게를 무릎 관절 아래로 밀어 내고 슬개골을 잡습니다. 슬개골을 부드럽게 당겨 탈비합니다. 슬개골에 부착 된 근육을 찢어 서 대퇴골을 노출. 구부러진 드레싱 집게에 의해 노출 된 대퇴골을 잡고 해부 수술 가위를 사용하여 뼈바닥에서 대퇴골을 잘라냅니다.
- 대퇴골을 차가운 1x PBS에 놓습니다.
- 18G 바늘로 0.5 mL 미세 원심 분리튜브에 구멍을 뚫습니다.
- 경골과 대퇴골을 동일한 0.5 mL 미세 원심 분리튜브에 넣고 뼈의 열린 끝이 구멍에 아래쪽을 향하도록 합니다.
- 경골과 대퇴골을 모두 포함하는 0.5 mL 튜브를 1.7 mL 미세 원심 분리튜브에 넣습니다.
- 경골과 대퇴골을 모두 포함하는 이중 층 튜브를 마이크로 원심 분리기에서 30 초 동안 5,510 x g에서 돌십시오.
- BM이 뼈에서 추출되어 튜브 바닥에 펠릿되었는지 확인합니다. 신성한 뼈를 포함하는 0.5 mL 튜브를 버팅합니다. 마우스 BM이 다음 단계에 대한 준비가 되었습니다.
참고: 인간 BM은 앞서 설명한바와같이 임상 자원에서 수확된다 11.
2. CyTOF를 위한 얼룩 BM 세포
- 1 mL 1x 적혈구 (RBC) 매착 완충액에서 BM을 다시 중단하십시오. 인간 BM의 경우, 10x 적혈구 (RBC) 용해 완충액의 10 배 부피로 전체 BM을 다시 중단하십시오. 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
- 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 튜브를 회전시면 됩니다. 인간 BM의 경우, 2.3단계로 진행하기 전에 2.1 단계 및 2.2단계를 반복한다.
- 조심스럽게 상류를 흡인하고 펠렛을 중단없이 둡니다. 차가운 1x PBS 의 1 mL로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 펠릿을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 15 mL 원엽 튜브로 필터링합니다. BM 세포는 지금 완전히 근육과 뼈 파편에서 관으로 격리됩니다. 튜브에 차가운 1x PBS 9 mL을 추가하여 세포를 씻습니다.
- 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 15 mL 튜브를 회전시면됩니다.
- 상월체를 조심스럽게 흡인하고 10 mL 콜드 PBS로 BM 세포를 다시 중단하십시오. 계산을 위한 셀의 별표를 가져 가라. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
- Aliquot 5 x 106 BM 세포를 CyTOF 염색을 위한 새로운 15 mL 튜브로 넣습니다.
- 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 15 mL 튜브 aliquot를 돌십시오.
- 시료에 대한 생존 성 지표로서 1 mL의 CyTOF 염색 버퍼에서 125 nM 시스플라틴으로 상류를 조심스럽게 흡인하고 BM 세포를 다시 중단합니다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 배양 후, 튜브에 CyTOF 염색 완충제 4 mL를 추가합니다. 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 튜브를 회전시면 됩니다. 인간 BM의 경우, CyTOF 염색 완충액에 10% 인간 AB 세럼을 추가합니다.
- 상월체를 조심스럽게 흡인하고 FC 수용체 차단 용액의 50 μL로 BM 세포를 다시 중단합니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 인간 BM에 대한 이 단계를 건너뜁니다.
- 수제 CyTOF 항체 칵테일 50 μL을 샘플에 추가하여 총 염색 량이 100 μL이 되도록 합니다. 부드럽게 파이펫을 섞어 주세요. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 항체 칵테일의 최종 부피는 마우스 BM 및 인간 BM 샘플 모두에 대해 100 μL이다.
- 세포를 세척하기 위해 인큐베이션 후 각 튜브에 CyTOF 염색 완충액 2 mL을 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 튜브를 돌십시오.
- 총 2회 2회 를 반복하여 2.12단계를 반복합니다.
- 16 % 스톡 앰벌에서 신선한 1.6 % 포름 알데히드 용액을 준비하십시오. 1x PBS의 9 부분으로 주식 포름알데히드의 1 부분을 희석.
- 조심스럽게 상류를 흡인하고 1 mL 신선한 1.6 % FA 용액으로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. RT에서 15 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 튜브를 회전시면 됩니다.
- 상월체를 조심스럽게 흡인하고 1 mL 픽스 /파마 버퍼에서 125 nM 간 칼레이션 솔루션으로 셀 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
- 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 인터칼레이션 용액으로 인큐베이션합니다.
3. CyTOF 수집을 위한 세포 준비
- 4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 부드럽게 소용돌이 및 스핀 셀.
- CyTOF 염색 완충액 2 mL을 첨가하여 세포를 세척하고, 4°C에서 5분 동안 800 x g에서 세포를 스핀하고 흡인에 의해 상수체를 제거한다.
- diH2O. 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단하여 각 튜브에서 작은 부피(약 10 μL)를 예약하여 세포를 계산합니다.
- 4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 세포를 회전시다.
- 3.3 단계와 3.4단계를 반복합니다.
- 조심스럽게 상류를 흡인하고 펠릿에 세포를 둡니다. BM 세포는 이제 CyTOF 수집을 위해 1 x 106 셀/mL의 농도로 재서스펜션할 준비가 되었습니다.
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Representative Results
도 1은 CyTOF 실험으로부터의 예로 제시된다. 이러한 tSNE 플롯상에서 여러 마우스 조직에 걸친 세포는 33-파라미터 CyTOF 패널에 의해 측정된 그들의 표면 마커 발현 프로파일의 유사성에 기초하여 서브세트로 군집되었다. 더 유사한 특성을 가진 세포는 각 세포상에 33개의 마커의 발현에 기초하여 호중구, 대식세포, 또는 DC와 같은 함께 자동으로 클러스터되었다.
도 2는 본 연구에 제시된 프로토콜을 이용하여 마우스 BM CyTOF 실험에 대한 예로서 제시된다. 이 프로토콜은 전체 BM의 무결성을 보존하여 호중구(Ly6G +, 도 2A)및 HSPC(CD117+,도 2B)시그니처 표면 마커를 공동 발현하는 이전에 알려지지 않은 세포 집단의 발견으로 이어졌습니다. 동시. 이 세포 집단은 우리의 CyTOF 패널에 의해 측정된 표면 마커 발현의 뚜렷한 패턴을 나타내며(그림2C)Ly6G+ 세포 고갈로 인해 이전 골수성 전구 연구에 의해 생략되었다1,2, 3. 더 중요한 것은, 이 결과는 Ly6G를 표현하지 않는 viSNE 지도의 좌측에 있는 클러스터의 작은 부분 집합의 발견으로 이끌어 냈습니다 그러나 CD117+Ly6G+ 세포에 밀접하게 군집되었습니다, 이는 이들의 유사성을 건의합니다 세포는 이러한 CyTOF 실험에 사용되는 39개의 마커의 발현에 기초하여 호중구 계보를 한다.
우리는 그림 2C에 표시된 CyTOF 데이터에서 마커 발현 프로파일을 사용하여 다운스트림 기능 분석의 흐름 세포 측정에 의해 호중구 전구체를 분리할 수 있는 13가지 색상의 FACS(형광 활성화 세포 선별) 패널을 구축했습니다. 그림3).
그림 1: CyTOF에서 유래한 tSNE 플롯의 예. 분석된 모든 마우스 조직으로부터의 단일 세포 데이터를 감소시켜 28개의 '감독되지 않은' 클러스터에 의해 플롯및 색상코딩하였다. 각 클러스터의 거친 ID는 게시된 다양한 분석을 기반으로 추가되었습니다. 이 그림은 참조4에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 린-CD117+Ly6A/E- 골수의 HSPC 세포에 대한 자동 단세포 분석은 뚜렷한 호중구 전구 집단을 식별한다. 린의 viSNE 맵-CD117+Ly6A/E- HSPC 셀은 5개의 자동화된 클러스터를 표시하는 도트 오버레이로 표시됩니다. (A) Ly6G 및 (B) CD117 발현 패턴은 린-CD117+Ly6A/E-HSPC 셀의 viSNE 맵에 스펙트럼 컬러 도트로서 도시되어 있다. (C) 표시된 마커의 발현 패턴은 각 클러스터의 히스토그램 오버레이로 표시됩니다. 이 그림은 참조7에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 대량 세포분석(CyTOF) 데이터셋으로 입증된 FACS 게이팅 전략. 수동으로 게이트된 대상 모집단은 유효성 검사를 위해 자동화된 viSNE 맵으로 다시 게이트되었습니다. 이 그림은 참조7에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지난 수십 년 동안, 형광 계류 세포측정은 세포 혈통 및 이질성을 연구하는 주요방법으로 사용되었다 1,2,3. 유세포측정법이 다차원 데이터를 제공했지만 이 방법은 매개 변수 와 스펙트럼 중복의 선택에 의해 제한됩니다. 유세포 분석의 약점을 극복하기 위해 우리는 형광단 대신 중금속 동위원소를 사용하여 검출기 채널 또는 세포의 자가 형광 사이의 누화를 제거하는 항체에 라벨을 붙이는 CyTOF를 활용했습니다. 단일 세포 수준에서 동시에 더 많은 매개 변수를 생성하고 세포 다양성12의훨씬 더 깊은 평가를 생성합니다. 고갈 또는 게이팅 과정에서 과거에 생략된 세포 집단, 특히 호중구 계보 세포와 같은 중요한 면역 세포는 오랫동안 균질한 것으로 여겨졌던13,14,CyTOF 2를 특징으로 할 수 있습니다. ,3,7.
세포 이질성을 연구하고 희귀 한 세포 집단을 특성화하는 CyTOF의 이 강력한 세포 분석 도구를 수용하기 위해 생물학적 표본의 무결성을 보존하는 프로토콜은 이질성 연구에 매우 실용적입니다. 여기에서 우리는 마우스 또는 인간 연구 결과를 위해 이용될 수 있는 온전한 전체 BM에 있는 새로운 세포 집단의 포괄적인 특성화를 가능하게 하는 CyTOF를 위한 전체 BM을 가공하는 프로토콜을 기술했습니다. 마우스와 인간으로부터 분리된 전체 골수는 세포 집단, 특히 온도 및 배양 조건과 같은 환경 변화에 매우 취약하고 민감하며 호중구 계보 세포를 포함합니다. 이 프로토콜에서는 이러한 민감한 인구를 최대 수준으로 유지하기 위해 각 단계의 온도 및 배양 조건을 최적화했습니다. 이렇게함으로써 전체 골수 세포의 무결성이 잘 보호됩니다. 이 프로토콜에 통합 된 개인화 된 마커 패널으로, 연구원은 다른 연구 분야에서 관심의 더 많은 세포를 식별 할 수 있습니다.
CyTOF는 새로운 세포 집단의 발견을 위한 강력한 종점 분석 도구이며 마커 특성에 의해 새로운 집단의 기능을 예측할 수 있지만, 이 기술은 추가 다운스트림 기능 연구에 제한적입니다. 다운스트림 기능 연구를 가능하게 하기 위해 viSNE를 사용하여 각 39개의 마커의 발현 수준을 검사하여 각 클러스터를 포괄적으로 특성화하고 그림 2C에나타난 바와 같이 뚜렷한 마커 조합을 발견했습니다. CyTOF 데이터는 현재 의 선별 기술에 적용할 수 없었지만, 많은 파라미터의 측정에 대한 이점은 제한된 파라미터 내에서 마커의 최상의 조합을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 중요한 데이터 분석 단계는 CyTOF 결과를 최대한 활용하여 FACS 호환 형광 기반 선별 패널을 설계하는 데 도움이 되었습니다. 예를 들어, 본 실험에서는 도 2C에서 이 정보를 사용하여 다운스트림 기능 분석실험에 대한 유세포분석으로 호중구 전구체(NeP)를 분리할 수 있는13가지 색상의 FACS 패널을 구축했습니다(그림 3). 파이프라인에 CyTOF와 FACS를 사용하여 이러한 방법을 함께 사용하면 형태학, 다기능성, 시험관 내 세포 학및 생체 내 연구와 같은 기능적 연구를 위해 새로 발견된 세포 유형을 분리할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 대량 세포 분석 절차에 도움을 LJI 흐름 세포 분석 코어에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01HL134236, P01HL136275 및 R01CA202987 (모두 C.C.H) 및 ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. 및 Y.P.Z)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
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