Summary
Her præsenterer vi en protokol til at behandle frisk knoglemarv (BM) isoleret fra mus eller human for high-dimensionelle masse cytometri (flowcytometri af Time-of-Flight, cytof) analyse af neutrofile-Lineage celler.
Abstract
I denne artikel præsenterer vi en protokol, der er optimeret til at bevare neutrofile-Lineage celler i frisk BM for hele BM CyTOF analyse. Vi udnyttede en myeloid-partisk 39-antistof CyTOF panel til at evaluere det hæmatopoietiske system med fokus på neutrofile-Lineage celler ved hjælp af denne protokol. CyTOF-resultatet blev analyseret med en dimensional reduktions algoritme med åben ressource, viSNE, og dataene blev præsenteret for at demonstrere resultatet af denne protokol. Vi har opdaget nye neutrofile-Lineage cellepopulationer baseret på denne protokol. Denne protokol af friske hele BM præparat kan anvendes til 1), CyTOF analyse at opdage uidentificerede cellepopulationer fra hele BM, 2), undersøge hele BM defekter for patienter med blodsygdomme såsom leukæmi, 3), bistå optimering af Fluorescens-aktiverede flow cytometri protokoller, der udnytter frisk hele BM.
Introduction
I de sidste par årtier, cytometri metoder har været et effektivt redskab til at undersøge det hæmatopoietiske system i BM. Disse metoder omfatter fluorescens-aktiveret flow cytometri og den nye metode til CyTOF ved hjælp af heavy metal-mærkede antistoffer. De har ført til opdagelser af mange celletyper i en heterogen biologisk prøve ved identifikation af deres unikke overflade markør udtryks profiler. Øget spektrum overlapninger, der er forbundet med flere kanaler fører til højere data unøjagtighed i fluorescens-aktiverede flow cytometri applikationer. Derfor fjernes uønskede celler rutinemæssigt for at berige cellepopulationer af interesse for fluorescens-aktiverede flow cytometri analyse. For eksempel, Ly6G (eller gr-1) og CD11b betragtes modne myeloid celle markører og Ly6G+ (eller gr-1+) og CD11b+ celler rutinemæssigt fjernes fra BM prøver ved hjælp af magnetisk berigelse kits før flow cytometri analyse af hæmatopoietisk stilk og progenitorceller (hspc'er) eller ved at kombinere disse markører i en dump cocktail Channel1,2,3. Et andet eksempel er, at neutrofiler rutinemæssigt fjernes fra humant blodprøve for at berige perifert blod mononukleære celler (PBMC) til immunologiske undersøgelser. Hele knoglemarv isoleret fra mus eller menneske, dog, er sjældent undersøgt intakt for cytometri analyse.
For nylig er cytof blevet et revolutionerende værktøj til at undersøge det hæmatopoietiske system4,5,6. Med CyTOF erstattes de fluorofore-mærkede antistoffer af tunge element reporter-mærkede antistoffer. Denne metode giver mulighed for måling af over 40 markører samtidig uden bekymring for spektrum overlap. Det har gjort det muligt at analysere intakt biologisk prøvemateriale uden præ-depletering trin eller en dump kanal. Derfor kan vi se det hæmatopoietiske system omfattende med højt indhold dimensionalitet fra konventionelle 2-D flow cytometri plots. Cellepopulationer, der tidligere er udeladt under nedbrydningen eller gating-processen, kan nu bringes i lys med de højdimensionelle data genereret af cytof4,5. Vi har designet et antistof panel, der samtidig måler 39 parametre i det hæmatopoietiske system med fokus på myeloid Linage7. Sammenlignet med de konventionelle flow cytometri data, er fortolkningen og visualiseringen af de hidtil usete encellehøjdimensionelle data genereret af CyTOF udfordrende. Computational forskere har udviklet dimensionalitet reduktionsteknikker til visualisering af High-dimensionelle datasæt. I denne artikel, vi brugte algoritmen, viSNE, som bruger t-Distributed Stochastic nabo Embedding (t-SNE) teknik til at analysere CyTOF data og til at præsentere det høje-dimensionelle resultat på en 2-dimensionelle kort samtidig bevare den høje-dimensionelle struktur af data8,9,10. På tSNE-plottet grupperes lignende celler i undersæt, og farven bruges til at fremhæve cellens funktion. For eksempel, på figur 1 de myeloide celler fordeles i flere celle undergrupper baseret på lighederne i deres udtryks mønstre af 33 overflade markører skyldes cytof (figur 1)4. Her undersøgte vi musens knoglemarv med vores tidligere rapporterede 39-markør CyTOF-panel af viSNE-analyse7. viSNE-analysen af vores CyTOF-data afslørede en uidentificeret cellepopulation, der viste både HSPC (CD117+) og neutrofile (Ly6G+) karakteristika (figur 2)7.
Afslutningsvis præsenterer vi en protokol til at behandle frisk hele knoglemarv til CyTOF analyse. I denne artikel, vi brugte mus knoglemarv som et eksempel, mens denne protokol også kan bruges til at behandle menneskelige knoglemarvsprøver. De oplysninger, der er specifikke for humane knoglemarvsprøver er også noteret i protokollen så godt. Fordelen ved denne protokol er, at den indeholder detaljer såsom inkubationstid og temperatur, der blev optimeret for at bevare neutrofillineceller i hele knoglemarven for at muliggøre undersøgelse af den intakte hel knoglemarv. Denne protokol kan også let ændres for fluorescens-aktiverede flow cytometri applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter fulgte godkendte retningslinjer fra La Jolla Institut for allergi og immunologisk dyrepleje-og Brugsudvalg, og godkendelse af brugen af gnavere blev indhentet fra La Jolla Institute for allergi og Immunologi efter kriterier, der er skitseret i Vejledning til pleje og brug af forsøgsdyr fra de nationale sundhedsinstitutter.
1. høst mus knoglemarv (BM)
- Køb C57BL/6J-mus fra en kommerciel leverandør. Fodre standard gnaver Chow kost og hus i mikroisolator bure i en patogen-fri facilitet.
- Brug hanmus, 6-10 ugers alderen, til eksperimentel formål. Euthanize ved CO2 indånding efterfulgt af den cervikale dislokation.
- Anbring musen på en steril kirurgisk pude med mave siden opad. Steriliser huden på maven og bagekstremiteterne ved at sprøjte 70% ethanol. Brug et par dissekere kirurgiske saks til at skære bughulen åben.
- Fjern huden for at udsætte bagbenene. Brug et par sløv-tip dressing pincet til at holde musen skinneben lige under anklen. Brug et andet par buede dressing pincet til at stabilisere skinneben under den stumpe-tip dressing pincet. Bryd skinneben, og Udsæt knoglen ved at rippe musklen af med den sløv-tip dressing pincet.
Bemærk: Skinneben er løst fastgjort til knæet leddet og kan nemt plukkes ud ved hjælp af stump-tip dressing pincet. - Anbring skinneben i kold 1x PBS.
- Dernæst skal du flytte den stabiliserende buede dressing Tang nedad til femur. Skub den stumpe-tip dressing pincet under knæet leddet og hold knæskallen. Affind knæet ved forsigtigt at trække det op. Udsæt lårbenet ved at rippe de muskler, der er fastgjort til knæet. Hold den eksponerede femur af den buede dressing pincet og skær femur fra bunden af knoglen ved hjælp af dissekere kirurgiske saks.
- Anbring lårbenet i kold 1x PBS.
- Punch et hul i 0,5 mL mikrocentrifugerør med en 18 G nål.
- Anbring både skinneben og femur i det samme 0,5 mL mikrocentrifugerør med den åbne ende af knoglerne vendt nedad til hullet.
- Anbring 0,5 mL-røret, der indeholder både skinneben og femur, i et 1,7 mL mikrocentrifugerings glas.
- Drej dobbeltlags rørene, der indeholder både skinneben og femur, på 5.510 x g i 30 s i mikro-centrifugen.
- Sørg for, at BM ekstraheres fra knoglerne og pelleteret i bunden af røret. Smid 0,5 mL-røret, der indeholder de haløjede knogler. Musen BM er klar til næste skridt.
Bemærk: Human BM høstes ved kliniske ressourcer som tidligere beskrevet11.
2. Stain BM celler for CyTOF
- BM gensuspenderes i 1 mL 1x røde blodlegemer (RBC) lysis buffer. For human BM, gensuspendere hele BM i en 10x volumen af 1x røde blodlegemer (RBC) lysis buffer. Inkuperer i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Drej røret ved 350 x g i 5 min ved 4 °c. For human BM skal du gentage trin 2,1 og 2,2, før du fortsætter til trin 2,3.
- Forsigtigt aspirerer supernatanten og lad pellet ubrudt. Opslæbe pellet med 1 mL kold 1x PBS. Pillen filtreres i et 15 mL konisk rør gennem en 70 μm celle Strainer. BM-cellerne er nu helt isoleret i røret fra musklen og knoglerester. Vask cellerne ved at tilsætte 9 mL kold 1x PBS i røret.
- Drej 15 mL røret ved 350 x g i 5 min ved 4 °c.
- Forsigtigt aspirerer supernatanten og genudsætter BM-cellerne med 10 mL kold PBS. Tag en alikvot celler til optælling. Tæl celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Aliquot 5 x 106 BM-celler i et nyt 15 ml-rør til cytof-farvning.
- Drej 15 ml røret alikvot til 350 x g i 5 min ved 4 °c.
- Supernatanten aspirerer omhyggeligt, og BM-cellerne resuspenderes med 125 nM Cisplatin i 1 mL CyTOF-STAINING-buffer som en rentabilitetsindikator for prøven. Inkubeter i 5 min ved RT.
- Efter inkubation tilsættes 4 mL CyTOF-farvnings buffer til røret. Drej røret ved 350 x g i 5 min ved 4 °c. For human BM tilsættes 10% humant AB serum i CyTOF-farvnings bufferen.
- Forsigtigt aspirerer supernatanten og resuspender BM-cellerne med 50 μL FC receptor blokerende opløsning. Inkubeter i 10 min ved 4 °C. Spring dette trin over for menneskelige BM.
- Der tilsættes 50 μL af den hjemmelavede CyTOF-antistof cocktail5 til prøven, så den totale farvnings volumen er 100 μl. Pipetter forsigtigt for at blande. Der inkubeeres i 30 min ved 4 °C. Den endelige mængde af antistof cocktail er 100 μL for både mus BM og humane BM prøver.
- Der tilsættes 2 mL CyTOF-farvnings buffer til hvert rør efter inkubationen for at vaske cellerne, centrifuger røret ved 350 x g i 5 min ved 4 °c.
- Gentag trin 2,12 for i alt to skyller.
- Forbered en frisk 1,6% formaldehyd-opløsning fra 16%-lager ampullens. 1 del af lager formaldehyd fortyndes med 9 dele af 1x PBS.
- Forsigtigt aspirerer supernatanten og opslæl pellet med 1 mL frisk 1,6% FA opløsning. Inkubeter i 15 minutter ved RT.
- Drej røret ved 800 x g i 5 min ved 4 °c.
- Supernatanten aspirerer forsigtigt, og celle pillen resuspenderes med 125 nM-interkaleringsvæske i 1 mL Fix/Perm-buffer.
- Prøven inkubeeres i interkaleringsvæske natten over ved 4 °C.
3. Forbered celler til CyTOF erhvervelse
- Hvirvlet vortex og spin celler ved 800 x g i 5 min ved 4 °c.
- Vask cellerne ved at tilsætte 2 mL CyTOF-farvnings buffer, spin celler ved 800 x g i 5 min ved 4 °c og Fjern supernatanten ved aspiration.
- Gensuspension af celler i 1 mL diH2O. reserver en lille mængde (ca. 10 μl) fra hvert rør for at tælle cellerne.
- Spin celler ved 800 x g i 5 min ved 4 °c.
- Gentag trin 3,3 og 3,4.
- Forsigtigt aspirerer supernatanten og lad cellerne i pellet. BM-cellerne er nu klar til opblanding til koncentrationen af 1 x 106 celler/ml til erhvervelse af cytof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er et eksempel på resultaterne af cytof-forsøgene. På dette tSNE plot cellerne på tværs af flere muse væv blev grupperet i undersæt baseret på ligheden mellem deres overflade markør udtryks profiler målt ved en 33-parameter CyTOF panel. Celler med flere lignende egenskaber blev automatisk grupperet sammen, såsom neutrofiler, makrofager eller DCs baseret på udtrykket af 33-mærkerne på hver celle.
Figur 2 er præsenteret som et eksempel resultat for mus BM cytof eksperiment ved hjælp af protokollen præsenteret i dette studie. Protokollen bevarede integriteten af hele BM, hvilket førte til opdagelsen af en tidligere ukendt cellepopulation, der co-udtrykker neutrofile (Ly6G+, figur 2a) og HSPC (CD117+, figur 2b) signaturoverflade markører Samtidig. Denne cellepopulation viser et tydeligt mønster af overfladen markør udtryk målt ved vores CyTOF panel (figur 2c) og blev udeladt af tidligere myeloid progenitorceller forskning på grund af Ly6G+ cellenedbrydning1,2, 3. i. Endnu vigtigere, dette resultat førte til opdagelsen af den lille delmængde af klyngen til venstre side af viSNE kort, der ikke udtrykker Ly6G men blev grupperet tæt til CD117+Ly6G+ celler, hvilket tyder på ligheden mellem disse celler til neutrofillinealderen baseret på udtrykket af de 39 markører, der anvendes til dette CyTOF-eksperiment.
Vi brugte markør udtrykket profil fra cytof data vist i figur 2c til at bygge en 13-farve FACS (Fluorescens-aktiveret celle sortering) panel, der giver os mulighed for at isolere neutrofile forfædre ved flow cytometri for downstream funktionelle analyser ( Figur 3).
Figur 1: Eksempel på tSNE-plottet er resultatet af CyTOF. Samlet tSNE dimensionalitet reducerede single-celledata fra alle mus væv analyseret blev plottet og farvekodet af 28 ' uovervågede ' klynger. De grove identiteter for hver klynge blev kommenteret på grundlag af forskellige publicerede analyser. Dette tal er blevet ændret fra reference4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Automatiseret enkeltcelleanalyse af Lin-CD117+Ly6A/E- HSPC-celler i knoglemarv identificerer en tydelig neutrofilprogenitorpopulation. viSNE-kort over Lin-CD117+Ly6A/E-HSPC- celler vises som dot overlays for at vise de 5 automatiserede klynger. (A) Ly6G og (B) CD117 udtryks mønster vises på visne kort over Lin-CD117+Ly6A/E- HSPC-celler som spektrum farvede prikker. (C) udtryks mønstrene for de angivne markører vises som histogram overlejringer for hver klynge. Dette tal er blevet ændret fra reference7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : FACS gating-strategi demonstreret med et masse cytometri-datasæt (CyTOF). Manuelt gated Target befolkning var tilbage gated til automatiseret viSNE kort til validering. Dette tal er blevet ændret fra reference7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de seneste årtier, fluorescens-baserede flow cytometri blev anvendt som den vigtigste metode til at studere cellulære slægter og heterogenitet1,2,3. Selvom flow cytometri har givet flerdimensionelle data, er denne metode begrænset af valg af parametre og spektral overlap. For at overvinde den svage flow cytometri udnyttede vi CyTOF, som bruger tungmetaller isotoper i stedet for fluorophores til at mærke antistoffer, der eliminerer krydstale mellem detektor kanaler eller autofluorescens af cellerne, derfor kan måle mange flere parametre samtidig på enkelt celleniveau og generere en langt dybere vurdering af cellulære mangfoldighed12. Cellepopulationer udeladt i fortiden under nedbrydning eller gating proces, især vigtige immunceller som neutrofile-Lineage celler, der var for længe betragtet homogen13,14, kan være bedre karakteriseret ved cytof 2 ,3,7.
For at imødekomme dette kraftfulde cytometri værktøj af CyTOF til at studere celle heterogenitet og karakterisere sjældne cellepopulationer, protokoller, der bevarer integriteten af biologiske prøver er yderst praktisk for heterogenitet undersøgelser. Her beskrev vi en protokol til at behandle hele BM for CyTOF, der muliggør omfattende karakterisering af nye cellepopulationer i intakt hele BM, som kan anvendes til mus eller humane undersøgelser. Hele knoglemarv isoleret fra mus og menneske indeholder cellepopulationer, især neutrofile-Lineage celler, der er meget skrøbelige og følsomme over for miljømæssige ændringer såsom temperatur og kulturforhold. I denne protokol har vi optimeret temperatur-og inkubations betingelserne for hvert trin for at bevare disse følsomme populationer til det maksimale niveau. Ved at gøre det er integriteten af hele knoglemarvs cellerne godt beskyttet. Med personlig markør panel indarbejdet i denne protokol, forskere kan identificere flere celler af interesse i forskellige forskningsområder.
Selv om CyTOF er et kraftfuldt slutpunkt analytisk værktøj til opdagelse af nye cellepopulationer og er i stand til at forudsige de nye befolkningers funktion ved deres markør egenskaber, denne teknologi er begrænset til yderligere downstream funktionelle undersøgelser. For at muliggøre downstream funktionelle undersøgelser brugte vi viSNE til at karakterisere hver enkelt klynge ved at undersøge deres udtryksniveau for hver 39 markører og fandt de forskellige markør kombinationer som vist i figur 2c. Selvom CyTOF-data ikke kunne anvendes på aktuelle sorterings teknologier, kunne fordelen ved målingen af mange parametre samtidig hjælpe os med at identificere den bedste kombination af markører inden for begrænsede parametre. Dette kritiske trin af dataanalyse hjalp os til at drage fuld fordel af CyTOF resultater til at designe en FACS-kompatibel fluorescens-baseret sortering panel. For eksempel, i dette eksperiment, vi brugte disse oplysninger i figur 2c til at bygge en 13-farvet FACS panel, der giver os mulighed for at isolere neutrofilprogenitor (NeP) ved flow cytometri for downstream funktionelle analyser (figur 3). Ved at bruge CyTOF og FACS i en rørledning kan disse metoder tilsammen gøre det muligt at isolere nyopdagede celletyper for funktionelle undersøgelser som morfologi, alsidighed, in vitro-assays og in vivo-undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke lji flow flowcytometri kerne for hjælp med masse cytometri procedure. Dette arbejde blev støttet af NIH Grants R01HL134236, P01HL136275 og R01CA202987 (alle til C. C. H) og ADA7-12-MN-31 (04) (til C.C.H. og Y. P. Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G.
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A.
