Summary
Burada, fare veya insan yüksek boyutlu kitle sitometri için izole taze kemik iliği (BM) işlemek için bir protokol sunuyoruz (zaman-of-Flight ile sitometri, CyTOF) nötrofil-köklü hücrelerin analizi.
Abstract
Bu makalede, tüm BM CyTOF analizi için taze BM nötrofil-Lineage hücreleri korumak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü kullanarak nötrofil-köklü hücrelere odaklanarak hematopoetik sistemi değerlendirmek için bir myeloid-önyargılı 39-antikor CyTOF panelini kullandık. CyTOF sonucu bir açık kaynak boyutlu azaltma algoritması ile analiz edildi, viSNE, ve veri bu protokol sonucunu göstermek için sunuldu. Bu protokole dayanarak yeni nötrofil-köklü hücre nüfusu keşfettik. Yeni tüm BM hazırlık bu protokol 1 için kullanılabilir), CyTOF Analizi tüm BM 'den tanımlanamayan hücre nüfusu keşfetmek için, 2), lösemi gibi kan bozuklukları olan hastalar için tüm BM kusurlarını araştırmak, 3), optimizasyon yardımcı Yeni tüm BM kullanan floresans aktif akış sitometri protokolleri.
Introduction
Son yıllarda, sitometri yöntemleri BM 'de hematopoetik sistemi araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu yöntemler arasında floresan aktif akış sitometri ve ağır metal etiketli antikorlar kullanarak yeni CyTOF yöntemi yer aldı. Benzersiz yüzey Marker ifade profillerinin tanımlanması ile heterojen bir biyolojik örnekten birçok hücre türünün keşiflerine yol açtı. Daha fazla kanal ile ilişkili olan artan spektrumlu çakışmalar, floresan aktif akış sitometri uygulamalarında daha yüksek veri doğruluğunu sağlar. Bu nedenle, floresan aktif akış sitometri analizi için ilgi hücre nüfusunu zenginleştirmek amacıyla istenmeyen hücreler rutin olarak kaldırılır. Örneğin, Ly6G (veya gr-1) ve CD11b olgun miyeloid hücre işaretçileri olarak kabul edilir ve Ly6G+ (veya gr-1+) ve CD11b+ hücreler rutin olarak BM örneklerinden kaldırılır ve akış sitometri analizinden önce Manyetik Zenginleştirme kitleri kullanılarak hematopoetik kök ve progenitör hücreler (hspcs) veya bir döküm kokteyl kanalı1,2,3bu işaretçileri birleştirerek. Diğer bir örnek ise nötrofiller, immünolojik çalışmalar için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) zenginleştirmek için insan kanı örneğinden rutin olarak kaldırılmalıdır. Tüm kemik iliği fare veya insan izole, ancak, nadiren sitometri analizi için bozulmamış incelenmiştir.
Son zamanlarda, cytof hematopoetik sistemi araştırmak için devrimci bir araç haline gelmiştir4,5,6. CyTOF ile fluorophore etiketli antikorlar ağır eleman muhabiri etiketli antikorlarla değiştirilir. Bu yöntem, spektrum örtüşme endişe olmadan aynı anda 40 üzerinde işaretçileri ölçümü için izin verir. Önceden tükenme adımları veya bir döküm kanalı olmadan bozulmamış biyolojik numunenin analizini sağladı. Bu nedenle, geleneksel 2-b akış sitometri grafiklerden yüksek içerik boyutallık ile hematopoetik sistemi kapsamlı bir şekilde görebilirsiniz. Tükenme veya gating süreci sırasında geçmişte atlanacak hücre nüfusu artık cytof4,5tarafından oluşturulan yüksek boyutlu verilerle ışığa getirilebilir. Hemopoetik sistemde 39 parametreleri aynı anda ölçen bir antikor paneli tasarladık, miyeloid astar7' ye odaklanarak. Geleneksel akış sitometri verilerine kıyasla, CyTOF tarafından oluşturulan eşsiz tek hücreli yüksek boyutlu verilerin yorumlama ve görselleştirilmesi zordur. Hesaplamalı Bilim adamları, yüksek boyutlu veri kümeleri görselleştirme için dimensionality azaltma teknikleri geliştirdik. Bu yazıda, CyTOF verilerini analiz etmek ve yüksek boyutlu yapısı koruyarak 2 boyutlu harita üzerinde yüksek boyutlu sonuç sunmak için t-dağıtılmış Stochastic komşu katıştırma (t-SNE) tekniği kullanır algoritma, viSNE, kullanılan veri8,9,10. TSNE arsa, benzer hücreler alt kümeleri içine kümelenmiş ve renk hücrelerin özelliğini vurgulamak için kullanılır. Örneğin, Şekil 1 ' de miyeloid hücreler, 33 yüzey işaretleyicilerinin ifade desenlerinin benzerliklerini temel alarak birkaç hücre alt setine dağıtılır (Şekil 1)4. Burada daha önce bildirilen 39-Marker CyTOF panel viSNE analiz tarafından fare kemik iliği araştırıldı7. CyTOF verilerimizin viSNE analizi, HSPC (CD117+) ve nötrofil (Ly6G+) özelliklerini (Şekil 2)7gösteren tanımlanamayan bir hücre popülasyonunu ortaya koydu.
Sonuç olarak, CyTOF analizi için taze tüm kemik iliği işlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu yazıda, bir örnek olarak fare kemik iliği kullandık, bu protokol de insan kemik iliği örneklerini işlemek için kullanılabilir iken. İnsan kemik iliği örneklerine özgü detaylar da protokolde belirtilmiştir. Bu protokolün avantajı, tüm kemik iliğinde nötrofil-köklü hücreleri korumak için optimize edilmiş olan inkübasyon süresi ve sıcaklığı gibi ayrıntıları içerdiğinden, tüm kemik iliği üzerinde soruşturma sağlamak. Bu protokol floresans aktif akış sitometri uygulamalarında da kolayca değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler La Jolla alerji ve Immünoloji hayvan bakımı ve kullanım Komitesi için onaylı yönergeler takip ve kemirgenler kullanımı için onay belirtilen kriterlere göre alerji ve Immünoloji için La Jolla Enstitüsü 'nden elde edildi Ulusal Sağlık Enstitüleri 'nden laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kılavuz.
1. hasat fare kemik Iliği (BM)
- Ticari bir satıcıdan C57BL/6J fareler satın alın. Mikroizolatör kafeslerinde standart kemirgen Chow diyetini ve evini patojen içermeyen bir tesiste besleyin.
- Kullanım erkek fareler, 6-10 hafta yaş, deneysel amaç için. CO2 inhalasyon tarafından ötenize servikal dislocation izledi.
- Fare, karın tarafı kadar steril bir cerrahi ped üzerine yerleştirin. % 70 etanol püskürterek karın ve hindekstremite alanı cildi sterilize. Karın boşluğu açık kesmek için bir çift diseksiyon cerrahi makas kullanın.
- Hindekstremite ortaya çıkarmak için cilt çıkarın. Fare Tibia sağ ayak bileği altında tutmak için künt uçlu soyunma forseps bir çift kullanın. Sivri uçlu soyunma forseps altında Tibia stabilize etmek için kavisli soyunma forseps başka bir çift kullanın. Tibia kırmak ve künt-ucu soyunma forseps ile kas kesmek tarafından kemik açığa.
Not: Tibia gevşek diz eklemine bağlı ve kolayca künt-ucu soyunma forseps kullanılarak seçilebilir. - Soğuk 1x PBS Tibia yerleştirin.
- Sonra, dengeleyen kavisli soyunma forseps aşağı femur taşıyın. Künt-ucu soyunma forseps diz eklemin altına kaydırın ve diz kapağı tutun. Hafifçe çekerek diz kapağını çıkarın. Diz kapağı bağlı kas sökük tarafından femur açığa. Kavisli soyunma forseps tarafından maruz femur tutun ve diseksiyon cerrahi makas kullanarak kemik altındaki femur kesilmiş.
- Femur soğuk 1x PBS yerleştirin.
- 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 18 G iğne ile bir delik delin.
- Hem Tibia ve femur aynı 0,5 mL mikrosantrifüjü tüp içine kemiklerin açık ucunu deliğe aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
- 0,5 mL tüpünü, hem Tibia hem de femur içeren 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
- Mikro-santrifüjde 30 s için 5.510 x g 'de hem Tibia hem de femur içeren çift katmanlı tüpleri döndürün.
- BM 'nin kemiklerden çıkarıldığından ve tüpün alt kısmında peletlenmiş olduğundan emin olun. At 0,5 ml tüp kutsal kemikler içeren Toss. Fare BM sonraki adımlara hazırdır.
Not: Insan BM, daha önce açıklanan11klinik kaynaklarda hasat edilir.
2. CyTOF için leke BM hücreler
- 1 mL 1x kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponunun içinde BM 'yi resuspend. İnsan BM için, 1x kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponunun 10X hacminde tüm BM 'yi pelletini. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca inküye yapın.
- 350 x g 'de tüpü 4 °c ' de 5 dakikaya döndürün. İnsan BM için, adım 2,3 devam etmeden önce 2,1 ve 2,2 adım tekrarlayın.
- Dikkatle süpernatant Aspire ve Pelet kırıldı bırakın. 1 ml soğuk 1x PBS ile Pelet resuspend. Bir 70 μm hücreli süzgeç aracılığıyla 15 ml konik tüp içine Pelet filtre. BM hücreleri şimdi tamamen kas ve kemik enkaz tüp içine izole edilmiştir. Tüpün içine 9 mL soğuk 1x PBS ekleyerek hücreleri yıkayın.
- 4 °C ' de 5dk için 350 x g 'de 15 ml tüp döndürün.
- Dikkatle süpernatant Aspire ve 10 ml soğuk PBS ile BM hücreleri pelletini. Sayma için hücrelerin bir kısım alın. Bir hemokytometer kullanarak hücreleri saymak.
- Aliquot 5 x 106 BM hücrelerinin içine yeni bir 15 ml tüp Için CyTOF boyama.
- 350 x g 'de 15 ml 'lik tüp kısım 'u 4 °c ' de 5 dakikaya döndürün.
- Dikkatle süpernatant Aspire ve 125 nm Cisplatin ile BM hücreleri pelletini 1 ml cytof boyama tampon örnek için bir canlılığı göstergesi olarak. RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın.
- Kuluçkten sonra, tüp için 4 mL CyTOF boyama tamponu ekleyin. 350 x g 'de tüpü 4 °c ' de 5 dakikaya döndürün. İnsan BM için, CyTOF boyama tampon içine% 10 insan AB serum ekleyin.
- Dikkatle süpernatant Aspire ve FC reseptör engelleme çözeltisi 50 μL ile BM hücreleri pelletini. 4 °C ' de 10 dak. İnsan BM için bu adımı atlayın.
- Ekle 50 μL ev yapımı CyTOF antikor kokteyl5 örnek için toplam boyama hacmi 100 μL. Karıştırın hafifçe pipet. 4 °C ' de 30 dakika boyunca inkübe. Antikor kokteylinin son hacmi, hem fare BM hem de insan BM örnekleri için 100 μL 'dir.
- Hücreleri yıkamak için inkübasyon aşağıdaki her tüp için 2 mL CyTOF boyama tampon ekleyin, 4 °C ' de 5 dakika için 350 x g tüp spin.
- Toplam iki yıkanıyor için adım 2,12 yineleyin.
- % 16 stok ampüden taze 1,6% formaldehit solüsyonu hazırlayın. 1x PBS 9 parçaları ile stok formaldehit 1 parçası seyreltmeli.
- Dikkatle süpernatant Aspire ve 1 ml taze 1,6% FA çözeltisi ile Pelet pelletini. RT 'de 15 dakika boyunca inküye yapın.
- 800 x g 'de tüpü 4 °c ' de 5 dakikaya döndürün.
- Dikkatle süpernatant Aspire ve 1 ml Fix/Perm tampon 125 nm ardalaması çözeltisi ile hücre Pelet pelletini.
- Numuneyi bir gecede 4 °C ' de intercalasyon çözeltisi içinde kuluçat.
3. CyTOF edinme için hücreleri hazırlayın
- 800 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika yavaşça girdap ve spin hücreleri.
- 2 ml cytof boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın, 4 °c ' de 5 dakika için 800 x g 'de spin hücreleri ve aspirasyon ile süpernatant çıkarın.
- 1 mL diH içinde resuspend hücreler2O. hücreleri saymak için her tüpten küçük bir hacim (yaklaşık 10 μL) ayırın.
- 800 x g 'de 4 °c ' de 5 dakikaya kadar spin hücreleri.
- 3,3 ve 3,4 adım yineleyin.
- Dikkatle süpernatant Aspire ve pellet içinde hücreleri bırakın. BM hücreleri şimdi 1 x 106 hücreler/ml cytof edinme konsantrasyonu için Resuspension için hazırdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 , CyTOF deneylerinden örnek bir sonuç olarak sunulmuştur. Bu tsne arsa üzerinde birden fazla fare dokularında hücreler bir 33-parametre cytof paneli ile ölçülen kendi yüzey Marker ifade profilleri benzerlik dayalı alt kümeleri içine kümelenmiş. Daha benzer özelliklere sahip hücreler, nötrofiller, makrofajlar veya her hücrede 33 işaretçileri ifadesine dayanan DCs gibi otomatik olarak birlikte kümelenir.
Şekil 2 Bu çalışmada sunulan protokol kullanarak fare BM CyTOF deneme için örnek bir sonuç olarak sunulmuştur. Protokol, nötrofil (Ly6G+, Şekil 2a) ve hspc (CD117+, Şekil 2B) imza yüzey işaretçileri ile ortak ifade eden daha önce bilinmeyen bir hücre popülasyonunun keşfine yol açan tüm BM bütünlüğünü korudu Aynı anda. Bu hücre nüfus bizim cytof panel tarafından ölçülen yüzey Marker ifade ayrı bir desen gösterir (Şekil 2C) ve önceki miyeloid progenitör araştırma Ly6G+ hücre tükenmesi nedeniyle atlanmıştı1,2, 3' ü yapın. Daha da önemlisi, bu sonuç Ly6G ifade etmeyen viSNE haritanın sol tarafına kümenin küçük bir alt kümesinin keşfi yol açtı CD117+Ly6G+ hücreler, bu benzerlik öneriyor Bu CyTOF deneyi için kullanılan 39 işaretleyicilerinin ifadesine dayanan nötrofil-kemerine hücreleri.
Biz bir 13-renk FACS (floresan-aktif hücre sıralama) oluşturmak için Şekil 2C içinde gösterilen cytof veri Marker ifade profili kullanılan akış sitometri tarafından nötrofil ProGen Şekil 3).
Şekil 1: TSNE Arsa örneği CyTOF sonuçlandı. Toplu tSNE dimensionality tüm fareler dokulardan tek hücreli veriler azaltılmış çizilmiş ve 28 ' denetimsiz ' kümeleri tarafından kodlanmış renk yapıldı. Her kümenin kaba kimlikleri, yayınlanmış çeşitli analizlere göre detaylandırıldı. Bu rakam referans4' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Lin-CD117+Ly6A/E- hspc hücrelerinin kemik iliğinde otomatik tek hücreli analizi, farklı bir nötrofil progenitör nüfus tanımlar. Lin-CD117+Ly6A/E- hspc hücrelerinin visne haritaları, 5 otomatik kümeyi görüntülemek için nokta kaplamaları olarak gösterilir. (A) Ly6G ve (B) CD117 ifade deseni, Lin-CD117+Ly6A/E- hspc hücrelerinin visne haritasında spektrum renkli noktalar olarak gösterilir. (C) belirtilen işaretçilerin ifade desenleri her kümenin histogram kaplamaları olarak gösterilir. Bu rakam referans7' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Kütle sitometri (CyTOF) DataSet ile gösterilen FACS gating stratejisi. El ile Gated hedef nüfus doğrulama için otomatik viSNE harita geri döndü. Bu rakam referans7' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda, hücresel sırların ve heterojenlik1,2,3çalışma için ana yöntem olarak floresans bazlı akış sitometri kullanılmıştır. Akış sitometri çok boyutlu veriler sağlasa da, bu yöntem Parametreler ve spektral örtüşme seçenekleriyle sınırlıdır. Akış sitometri zayıflığının üstesinden gelmek için biz, bu nedenle, dedektör kanalları veya hücrelerin otofloresans arasındaki çapraz ortadan kaldıran antikorlar etiketlemek için fluorophores yerine ağır metal izotopları kullanan cytof yararlanarak, birçok ölçmek olabilir aynı anda tek hücreli düzeyde daha fazla parametre ve hücresel çeşitlilik çok daha derin bir değerlendirme oluşturmak12. Hücre nüfus tükenmesi veya gating süreci sırasında geçmişte atlanıyor, özellikle önemli immün hücreler nötrofil-Lineage hücreler gibi uzun homojen düşünülen için oldu13,14, daha iyi karakterize edilebilir cytof 2 ,3,7.
Hücre heterojenliği incelemek ve nadir hücre popülasyonları karakterize etmek için CyTOF bu güçlü sitometri aracı karşılamak için, biyolojik numunelerin bütünlüğünü koruyan protokoller heterojenite çalışmaları için son derece pratiktir. Burada, fare veya insan çalışmaları için kullanılabilecek, tamamen BM 'de yeni hücre nüfuslarının kapsamlı karakterizasyonu sağlayan CyTOF için tüm BM 'i işlemek için bir protokol açıklanmıştır. Fare ve insan izole tüm kemik iliği hücre nüfusu içerir, son derece kırılgan ve sıcaklık ve kültür koşulları gibi çevresel değişikliklere duyarlı özellikle nötrofil-soy hücreleri. Bu protokolde, bu hassas nüfusu maksimum seviyeye korumak için her adım için sıcaklık ve inkübasyon koşullarını optimize ettik. Böylece tüm kemik iliği hücrelerinin bütünlüğü iyi korunur. Bu protokole dahil kişiselleştirilmiş Marker paneli ile, araştırmacılar farklı araştırma alanlarında ilgi daha fazla hücre tanımlayabilir.
CyTOF yeni hücre nüfusunun keşfi için güçlü bir son nokta analitik araçtır ve kendi marker özellikleri ile yeni nüfusun fonksiyonunu tahmin edebiliyoruz rağmen, bu teknoloji daha fazla aşağı fonksiyonel çalışmalar için sınırlıdır. Aşağı akış işlevsel etütler etkinleştirmek için, her 39 işaretçileri kendi ifade düzeyini incelemek ve Şekil 2Cgösterildiği gibi farklı işaret kombinasyonları bulundu her küme kapsamlı karakterize etmek Için visne kullanılır. CyTOF verileri geçerli sıralama teknolojilerine uygulanamadı olsa da, aynı anda birçok parametre ölçümü üzerindeki avantajı sınırlı parametreler içinde işaretçilerin en iyi kombinasyonu belirlemek için bize yardımcı olabilir. Veri analizinin bu kritik adımı, FACS uyumlu floresan tabanlı bir sıralama paneli tasarlamak için CyTOF sonuçlarının tam olarak avantajlarından yararlanmamıza yardımcı oldu. Örneğin, bu denemede, bu bilgileri Şekil 2C 'de, nötrofil progenitör (NeP) ile akış sitometri (Şekil 3) için akım cytometre ile yalıtmamızı sağlayan 13 renkli FACS paneli inşa etmek için kullandık. Bir boru hattında CyTOF ve FACS kullanarak, bu yöntemler birlikte morfoloji gibi fonksiyonel çalışmalar için yeni keşfedilen hücre türlerinin yalıtımını olanaklı kılmak, çok yönlülük, in vitro asder, ve in vivo çalışmalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Kitle sitometri prosedüründe yardım almak için LJı Flow sitometri çekirdeğine teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma NıH hibe R01HL134236, P01HL136275 ve R01CA202987 (tüm C. C. H) ve ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. ve Y. P. Z) tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G.
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A.
