Summary
Ici, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse fraîche (BM) isolée de la souris ou de l'homme pour la cytométrie de masse de haute dimension (Cytométrie par Time-Of-Flight, CyTOF) analyse des cellules de neutrophile-lignée.
Abstract
Dans cet article, nous présentons un protocole qui est optimisé pour préserver des cellules de neutrophile-ligne dans BM frais pour l'analyse entière de CyTOF de BM. Nous avons utilisé un panneau CyTOF de 39 anticorps myéloïde-biaisé pour évaluer le système hématopoïétique avec un foyer sur les cellules de neutrophile-ligne en utilisant ce protocole. Le résultat de CyTOF a été analysé avec un algorithme de réduction dimensionnelle à ressources ouvertes, viSNE, et les données ont été présentées pour démontrer les résultats de ce protocole. Nous avons découvert de nouvelles populations de cellules de neutrophile basées sur ce protocole. Ce protocole de préparation bM entière fraîche peut être employé pour 1), analyse de CyTOF pour découvrir des populations non identifiées de cellules de BM entière, 2), étudiant des défauts entiers de BM pour des patients présentant des désordres de sang tels que la leucémie, 3), aidant l'optimisation de protocoles de cytométrie de débit fluorescence activés qui utilisent BM entier frais.
Introduction
Au cours des dernières décennies, les méthodes de cytométrie ont été un outil puissant pour étudier le système hématopoïétique dans le BM. Ces méthodes comprennent la cytométrie d'écoulement activée par la fluorescence et la nouvelle méthode de CyTOF utilisant des anticorps étiquetés métal lourd. Ils ont mené à la découverte de nombreux types de cellules dans un spécimen biologique hétérogène en identérant leurs profils uniques d'expression de marqueurde de surface. L'augmentation des chevauchements de spectre associés à un plus grand nombre de canaux entraîne une inexactitude accrue des données dans les applications de cytométrie de débit activée par la fluorescence. Par conséquent, les cellules indésirables sont systématiquement enlevées afin d'enrichir les populations cellulaires d'intérêt pour l'analyse de cytométrie de débit activée par fluorescence. Par exemple, Les cellules Ly6G (ou Gr-1) et CD11b sont considérées comme des marqueurs de cellules myéloïdes matures et les cellules Ly6G(ou Gr-1)et CD11b sont systématiquement retirées des échantillons de BM à l'aide de kits d'enrichissement magnétique avant l'analyse de la cytométrie du flux. cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPC) ou en combinant ces marqueurs dans un canal de cocktail à décharge1,2,3. Un autre exemple est que les neutrophiles sont systématiquement retirés du spécimen de sang humain pour enrichir les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMC) pour des études immunologiques. La moelle osseuse entière isolée de la souris ou de l'homme, cependant, est rarement étudiée intacte pour l'analyse de cytométrie.
Récemment, CyTOF est devenu un outil révolutionnaire pour étudier le système hématopoïétique4,5,6. Avec CyTOF, les anticorps étiquetés fluorophore sont remplacés par des anticorps étiquetés par des journalistes à élément lourd. Cette méthode permet de mesurer plus de 40 marqueurs simultanément sans se soucier du chevauchement du spectre. Il a permis l'analyse d'un spécimen biologique intact sans étapes de pré-épuisement ou d'un canal de vidange. Par conséquent, nous pouvons voir le système hématopoïétique de manière complète avec la dimensionnalité à haute teneur à partir des parcelles conventionnelles de cytométrie de flux 2-D. Les populations cellulaires omises dans le passé lors de l'épuisement ou du processus de gating peuvent maintenant être mises en lumière avec les données de haute dimension générées par CyTOF4,5. Nous avons conçu un panneau d'anticorps qui mesure simultanément 39 paramètres dans le système hématopoïétique avec un accent sur le linage myéloïde7. Par rapport aux données conventionnelles de cytométrie de flux, l'interprétation et la visualisation des données unicellulaires sans précédent à haute dimensionnalité générées par CyTOF est un défi. Les scientifiques computationnels ont développé des techniques de réduction de dimensionnalité pour la visualisation des ensembles de données de haute dimension. Dans cet article, nous avons utilisé l'algorithme, viSNE, qui utilise t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) technique pour analyser les données CyTOF et de présenter le résultat de haute dimension sur une carte en 2 dimensions tout en conservant la structure de haute dimension des données8,9,10. Sur la parcelle tSNE, des cellules similaires sont regroupées en sous-ensembles et la couleur est utilisée pour mettre en évidence la caractéristique des cellules. Par exemple, à la figure 1, les cellules myéloïdes sont réparties dans plusieurs sous-ensembles cellulaires en fonction des similitudes de leurs modèles d'expression de 33 marqueurs de surface résultant de CyTOF (Figure 1)4. Ici nous avons étudié la moelle d'os de souris avec notre panneau précédemment rapporté de 39 marqueurs de CyTOF par l'analysedeviSNE 7. l'analyse viSNE de nos données CyTOF a révélé une population cellulaire non identifiée qui a montré à la fois HSPC (CD117)et neutrophiles (Ly6G)(figure2)7.
En conclusion, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse entière fraîche pour l'analyse de CyTOF. Dans cet article, nous avons utilisé la moelle osseuse de souris comme exemple, tandis que ce protocole peut également être utilisé pour traiter des échantillons de moelle osseuse humaine. Les détails spécifiques aux échantillons de moelle osseuse humaine sont également notés dans le protocole. L'avantage de ce protocole est qu'il contient des détails tels que le temps d'incubation et la température qui ont été optimisés pour préserver les cellules de neutrophile dans toute la moelle osseuse pour permettre l'investigation sur la moelle osseuse entière intacte. Ce protocole peut également être facilement modifié pour les applications de cytométrie de débit activée par fluorescence.
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Protocol
Toutes les expériences ont suivi les directives approuvées du Comité d'allergie et d'immunologie des animaux de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie, et l'approbation de l'utilisation des rongeurs a été obtenue de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie selon les critères décrits dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health.
1. Récolte de la moelle osseuse de souris (BM)
- Achetez des souris C57BL/6J auprès d'un fournisseur commercial. Nourrir le régime standard de chow de rongeur et la maison dans des cages de microisolateur dans une installation exempte d'agent pathogène.
- Utilisez des souris mâles, âgées de 6 à 10 semaines, à des fins expérimentales. Euthanasier par inhalation de CO2 suivie de la luxation cervicale.
- Placez la souris sur un tampon chirurgical stérile avec le côté de l'abdomen vers le haut. Stérilisez la peau de l'abdomen et de la région des membres postérieurs en pulvérisant 70 % d'éthanol. Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux de dissection pour couper la cavité abdominale ouverte.
- Retirez la peau pour exposer les membres postérieurs. Utilisez une paire de forceps d'habillage à pointe émoussée pour tenir le tibia de la souris juste en dessous de la cheville. Utilisez une autre paire de forceps de pansement incurvés pour stabiliser le tibia sous les forceps d'habillage à pointe émoussée. Casser le tibia et exposer l'os en arrachant le muscle avec les forceps de pansement à pointe émoussée.
NOTE: Le tibia est lâchement attaché à l'articulation du genou et peut être facilement choisi en utilisant les forceps de pansement à pointe émoussée. - Placer le tibia dans le froid 1x PBS.
- Ensuite, déplacez les forceps de dressage incurvés stabilisants vers le bas vers le fémur. Faites glisser les forceps d'habillage à pointe émoussée sous l'articulation du genou et maintenez la rotule. Déloger la rotule en la tirant doucement vers le haut. Exposer le fémur en arrachant le muscle attaché à la rotule. Tenez le fémur exposé par les forceps de pansement courbés et coupez le fémur du fond de l'os à l'aide de ciseaux chirurgicaux disséquant.
- Placer le fémur dans le froid 1x PBS.
- Percer un trou dans un tube de microcentrifuge de 0,5 ml à l'aiguille de 18 G.
- Placez le tibia et le fémur dans le même tube de microcentrifuge de 0,5 ml avec l'extrémité ouverte des os faisant face vers le bas au trou.
- Placez le tube de 0,5 ml contenant à la fois le tibia et le fémur dans un tube de microcentrifuge de 1,7 ml.
- Faites tourner les tubes à double couche contenant à la fois le tibia et le fémur à 5 510 x g pour 30 s dans la microcentrifuge.
- Assurez-vous que le BM est extrait des os et granulé au fond du tube. Jere le tube de 0,5 ml contenant les os sacrés. La souris BM est prête pour les prochaines étapes.
REMARQUE : La BM humaine est moissonnée aux ressources cliniques comme décrit précédemment11.
2. Cellules De Tache BM pour CyTOF
- Resuspendre le BM en 1 mL 1x Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse. Pour la BM humaine, resuspendre l'ensemble bM dans un volume de 10x de 1x Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse. Incuber pendant 10 min à température ambiante (RT).
- Faire tourner le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Pour le BM humain, répétez les étapes 2.1 et 2.2 avant de passer à l'étape 2.3.
- Aspirez soigneusement le supernatant et laissez la pastille intacte. Suspendre le granule avec 1 mL de froid 1x PBS. Filtrer la pastille dans un tube conique de 15 ml à travers une passoire cellulaire de 70 m. Les cellules BM sont maintenant complètement isolées dans le tube à partir des débris musculaires et osseux. Laver les cellules en ajoutant 9 ml de froid 1x PBS dans le tube.
- Faire tourner le tube de 15 ml à 350 x g pour 5min à 4 oC.
- Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez les cellules BM avec 10 ml de PBS froid. Prenez un aliquot de cellules pour le comptage. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre.
- Aliquot 5 x 106 cellules BM dans un nouveau tube de 15 ml pour la coloration CyTOF.
- Faire tourner l'aliquot à tube de 15 ml à 350 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez les cellules BM avec 125 nM Cisplatin dans 1 mL de CyTOF Staining Buffer comme indicateur de viabilité pour l'échantillon. Incuber pendant 5 min à RT.
- Après l'incubation, ajouter 4 ml de tampon de coloration CyTOF au tube. Faire tourner le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Pour la BM humaine, ajouter 10 % de sérum AB humain dans le tampon de coloration CyTOF.
- Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez les cellules BM avec 50 L de solution de blocage du récepteur Fc. Incuber pendant 10 min à 4 oC. Passer cette étape pour l'homme BM.
- Ajoutez 50 l du cocktail d'anticorps CyTOF maison5 à l'échantillon de sorte que le volume total de coloration est de 100 L. Mélanger délicatement la pipette. Incuber pendant 30 min à 4 oC. Le volume final du cocktail d'anticorps est de 100 l pour les échantillons de BM de souris et de BM humain.
- Ajouter 2 ml de tampon de coloration CyTOF à chaque tube après l'incubation pour laver les cellules, faire tourner le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Répétez l'étape 2.12 pour un total de deux lavages.
- Préparer une nouvelle solution de formaldéhyde de 1,6 % à partir de l'ampule de 16 % des actions. Diluer 1 partie du formaldéhyde de stock avec 9 parties de 1x PBS.
- Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez le granule avec 1 ml de solution FA fraîche de 1,6%. Incuber pendant 15 min à RT.
- Faire tourner le tube à 800 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez le granule de cellule avec la solution d'intercalation de 125 nM dans le tampon de correction/perm de 1 ml.
- Incuber l'échantillon dans une solution d'intercalation pendant la nuit à 4 oC.
3. Préparer les cellules pour l'acquisition de CyTOF
- Vortex et cellules de rotation doucement à 800 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Laver les cellules en ajoutant 2 ml de tampon de coloration CyTOF, faire tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min à 4 oC et enlever le supernatant par aspiration.
- Resuspendre les cellules en 1 mL de diH2O. Réservez un petit volume (environ 10 L) de chaque tube pour compter les cellules.
- Spin cellules à 800 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Répétez les étapes 3.3 et 3.4.
- Aspirez soigneusement le supernatant et laissez les cellules dans la pastille. Les cellules BM sont maintenant prêtes à être suspendues à la concentration de 1 x 106 cellules/mL pour l'acquisition de CyTOF.
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Representative Results
La figure 1 est présentée comme un exemple résultant d'expériences CyTOF. Sur cette parcelle tSNE les cellules à travers plusieurs tissus de souris ont été regroupés en sous-ensembles basés sur la similitude de leurs profils d'expression de marqueur de surface mesurés par un panneau CyTOF de 33 paramètres. Les cellules avec des propriétés plus semblables ont été automatiquement regroupées comme les neutrophiles, les macrophages, ou les DC s'appuyant sur l'expression des 33 marqueurs sur chaque cellule.
La figure 2 est présentée comme un exemple de résultat pour l'expérience de souris BM CyTOF utilisant le protocole présenté dans cette étude. Le protocole a préservé l'intégrité de l'ensemble de la BM, ce qui a mené à la découverte d'une population cellulaire jusque-là inconnue qui co-exprime le neutrophile (Ly6G, Figure 2A) et HSPC (CD117, Figure 2B) marqueurs de surface signature simultanément. Cette population cellulaire montre un modèle distinct de l'expression du marqueur de surface mesurée par notre panel CyTOF ( Figure 2C) et a été omise par la recherche précédente progénitrice myéloïde en raison de l'épuisement des cellules Ly6G1,2, 3. Plus important encore, ce résultat a conduit à la découverte du petit sous-ensemble de l'amas sur le côté gauche de la carte viSNE qui n'exprime pas Ly6G cependant a été regroupé étroitement à la CD117-Ly6G- cellules, ce qui suggère la similitude de ces cellules à la lignée neutrophile basée sur l'expression des 39 marqueurs utilisés pour cette expérience CyTOF.
Nous avons utilisé le profil d'expression des marqueurs des données CyTOF présentées à la figure 2C pour construire un panneau FACS (tri cellulaire activé par fluorescence) de 13 couleurs qui nous permet d'isoler les progéniteurs de neutrophiles par cytométrie d'écoulement pour les analyses fonctionnelles en aval ( Figure 3).
Figure 1 : Exemple de la parcelle tSNE a résulté de CyTOF. La dimensionnalité tSNE globale a réduit les données unicellulaires de tous les tissus de souris analysés ont été tracées et codées par les 28 groupes « non supervisés ». Les identités grossières de chaque grappe ont été annotées sur la base de diverses analyses publiées. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : L'analyse unitaire automatisée de Lin-CD117-Ly6A/E- les cellules HSPC dans la moelle osseuse identifie une population distincte d'ancêtres neutrophiles. les cartes viSNE de Lin-CD117-Ly6A/E- les cellules HSPC sont affichées sous forme de superlays de points pour afficher les 5 clusters automatisés. (A) Ly6G et (B) CD117 modèle d'expression est montré sur la carte viSNE de Lin-CD117-Ly6A/ E- cellules HSPC comme points de couleur spectre. (C) Les motifs d'expression des marqueurs indiqués sont représentés sous forme de superlays histogrammes de chaque groupe. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence7. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : La stratégie de gating FACS démontrée avec l'ensemble de données de cytométrie de masse (CyTOF). La population cible fermée manuellement a été rétromenée à la carte viSNE automatisée pour validation. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence7. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Au cours des dernières décennies, la cytométrie à base de fluorescence a été utilisée comme méthode principale pour étudier les lignées cellulaires et l'hétérogénéité1,2,3. Bien que la cytométrie de flux ait fourni des données multidimensionnelles, cette méthode est limitée par des choix de paramètres et de chevauchement spectral. Pour surmonter la faiblesse de la cytométrie d'écoulement, nous avons profité de CyTOF, qui utilise des isotopes de métaux lourds au lieu de fluorophores pour étiqueter les anticorps qui élimine la conversation croisée entre les canaux de détection ou l'autofluorescence des cellules, par conséquent, peut mesurer de nombreux plus de paramètres simultanément au niveau unicellulaire et génèrent une évaluation beaucoup plus profonde de la diversité cellulaire12. Les populations cellulaires omises dans le passé lors de l'épuisement ou du processus de gating, en particulier les cellules immunitaires importantes comme les cellules de neutrophile-lignée qui ont été pendant longtemps considérées homogènes13,14, peuvent être mieux caractérisées par CyTOF 2 ,3,7.
Pour s'adapter à ce puissant outil de cytométrie de CyTOF pour étudier l'hétérogénéité cellulaire et caractériser les populations de cellules rares, les protocoles qui préservent l'intégrité des spécimens biologiques sont extrêmement pratiques pour les études d'hétérogénéité. Ici, nous avons décrit un protocole pour traiter bM entier pour CyTOF qui permet une caractérisation complète de nouvelles populations cellulaires dans BM entier intact, qui peut être utilisé pour des études de souris ou humaines. La moelle osseuse entière isolée de la souris et de l'homme contient des populations cellulaires, en particulier des cellules de lignée de neutrophiles qui sont très fragiles et sensibles aux changements environnementaux tels que la température et les conditions de culture. Dans ce protocole, nous avons optimisé les conditions de température et d'incubation pour chaque étape afin de préserver ces populations sensibles au niveau maximum. Ce faisant, l'intégrité de l'ensemble des cellules de la moelle osseuse est bien protégée. Grâce à l'intégration d'un panneau de marqueur personnalisé à ce protocole, les chercheurs peuvent identifier davantage de cellules d'intérêt dans différents domaines de recherche.
Bien que CyTOF soit un puissant outil d'analyse de point final pour la découverte de nouvelles populations cellulaires et qu'il soit capable de prédire la fonction des nouvelles populations en fonction de leurs caractéristiques de marqueur, cette technologie est limitée pour d'autres études fonctionnelles en aval. Pour permettre des études fonctionnelles en aval, nous avons utilisé viSNE pour caractériser de façon exhaustive chaque grappe en examinant leur niveau d'expression de chaque 39 marqueurs et avons trouvé les combinaisons de marqueurs distinctes comme indiqué dans la figure 2C. Bien que les données CyTOF n'aient pas pu être appliquées aux technologies de tri actuelles, son avantage sur la mesure simultanée de nombreux paramètres pourrait nous aider à identifier la meilleure combinaison de marqueurs dans des paramètres limités. Cette étape cruciale de l'analyse des données nous a aidés à tirer pleinement parti des résultats de CyTOF pour concevoir un panneau de tri basé sur la fluorescence compatible FACS. Par exemple, dans cette expérience, nous avons utilisé cette information dans la figure 2C pour construire un panneau FACS de 13 couleurs qui nous permet d'isoler l'ancêtre neutrophile (NeP) par cytométrie de débit pour les essais fonctionnels en aval (figure 3). En utilisant CyTOF et FACS dans un pipeline, ces méthodes pourraient permettre l'isolement des types de cellules nouvellement découverts pour des études fonctionnelles telles que la morphologie, la polyvalence, les essais in vitro et les études in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le noyau de cytométrie de flux de LJI pour l'aide avec la procédure de cytométrie de masse. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01HL134236, P01HL136275, et R01CA202987 (tous à C.C.H) et ADA7-12-MN-31 (04) (à C.C.H. et Y.P.Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
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