Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung von frischem Knochenmark (BM) vor, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, um die analyse von Neutrophilenzellen durch die hochdimensionale Massenzytometrie (Cytometrie durch Time-Of-Flight, CyTOF) zu verarbeiten.
Abstract
In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll vor, das optimiert ist, um Neutrophilen-Linienzellen in frischem BM für die gesamte BM CyTOF-Analyse zu erhalten. Wir nutzten ein myeloisch-voreingenommenes 39-Antikörper-CyTOF-Panel, um das hämatopoetische System mit einem Fokus auf die Neutrophilen-Linienzellen mit diesem Protokoll zu bewerten. Das CyTOF-Ergebnis wurde mit einem Open-Resource-Dimensionsreduktionsalgorithmus viSNE analysiert, und die Daten wurden vorgestellt, um das Ergebnis dieses Protokolls zu demonstrieren. Wir haben neue neutrophil-lineage Zellpopulationen auf der Grundlage dieses Protokolls entdeckt. Dieses Protokoll der frischen gesamten BM-Präparation kann für 1), CyTOF-Analyse verwendet werden, um nicht identifizierte Zellpopulationen aus ganz BM zu entdecken, 2), die Untersuchung ganzer BM-Defekte bei Patienten mit Bluterkrankungen wie Leukämie, 3), fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrieprotokolle, die frische sermierte bm verwenden.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten waren Zytometrie-Methoden ein leistungsfähiges Werkzeug, um das hämatopoetische System im BM zu untersuchen. Zu diesen Methoden gehören fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie und die neue Methode der CyTOF mit schwermetallbeschriftten Antikörpern. Sie haben durch die Identifizierung ihrer einzigartigen Oberflächenmarker-Expressionsprofile zu Entdeckungen vieler Zelltypen in einer heterogenen biologischen Probe geführt. Erhöhte Spektrumüberlappungen, die mit mehr Kanälen verbunden sind, führen zu einer höheren Datenungenauigkeit in fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrieanwendungen. Daher werden unerwünschte Zellen routinemäßig entfernt, um Zellpopulationen von Interesse für die Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanalyse zu bereichern. Beispielsweise gelten Ly6G (oder Gr-1) und CD11b als reife myeloische Zellmarker und Ly6G+ (oder Gr-1+) und CD11b+ Zellen werden routinemäßig aus BM-Proben entfernt, indem magnetische Anreicherungskits verwendet werden, bevor die Durchflusszytometrieanalyse hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) oder durch Kombination dieser Marker in einem Dump-Cocktail-Kanal1,2,3. Ein weiteres Beispiel ist, dass Neutrophile routinemäßig aus menschlichen Blutproben entfernt werden, um periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) für immunologische Studien anzureichern. Ganzes Knochenmark, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, wird jedoch selten intakt für die Zytometrieanalyse untersucht.
In letzter Zeit ist CyTOF zu einem revolutionären Werkzeug geworden, um das hämatopoetische System4,5,6zuuntersuchen. Mit CyTOF werden die fluorophor-markierten Antikörper durch schwere, von Reportern gekennzeichnete Antikörper ersetzt. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung von über 40 Markern ohne die Sorge um die Überlappung des Spektrums. Es hat die Analyse intakter biologischer Proben ohne Vorabbauschritte oder einen Deponiekanal ermöglicht. Daher können wir das hämatopoetische System umfassend mit hoher Content-Dimensionalität aus herkömmlichen 2D-Flow-Zytometrie-Plots betrachten. Zellpopulationen, die in der Vergangenheit während des Erschöpfungs- oder Gatingprozesses weggelassen wurden, können nun mit den von CyTOF4,5erzeugten hochdimensionalen Daten ans Licht gebracht werden. Wir haben ein Antikörper-Panel entwickelt, das gleichzeitig 39 Parameter im hämatopoetischen System misst, mit einem Fokus auf die myeloische Linage7. Im Vergleich zu den herkömmlichen Flow-Zytometrie-Daten ist die Interpretation und Visualisierung der beispiellosen einzelzelligen hochdimensionalen Daten, die von CyTOF generiert werden, eine Herausforderung. Computerwissenschaftler haben Maßalitätsreduktionstechniken zur Visualisierung hochdimensionaler Datensätze entwickelt. In diesem Artikel verwendeten wir den Algorithmus viSNE, der t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) Technik verwendet, um die CyTOF-Daten zu analysieren und das hochdimensionale Ergebnis auf einer 2-dimensionalen Karte zu präsentieren, während die hochdimensionale Struktur konserviert wird. der Daten8,9,10. Im tSNE-Diagramm werden ähnliche Zellen in Teilmengen gruppiert, und die Farbe wird verwendet, um das Feature der Zellen hervorzuheben. In Abbildung 1 werden die myeloischen Zellen z. B. in mehrere Zellteilmengen verteilt, basierend auf den Ähnlichkeiten ihrer Expressionsmuster von 33 Oberflächenmarkern, die aus CyTOF resultieren (Abbildung 1)4. Hier untersuchten wir Mausknochenmark mit unserem zuvor berichteten 39-Marker CyTOF Panel durch viSNE-Analyse7. viSNE-Analyse unserer CyTOF-Daten ergab eine nicht identifizierte Zellpopulation, die sowohl HSPC -(CD117+) als auch Neutrophilen (Ly6G+) Merkmale zeigte (Abbildung 2)7.
Abschließend stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung eines frischen ganzen Knochenmarks für die CyTOF-Analyse vor. In diesem Artikel haben wir als Beispiel Mausknochenmark verwendet, während dieses Protokoll auch zur Verarbeitung menschlicher Knochenmarkproben verwendet werden kann. Die spezifischen Details für menschliche Knochenmarkproben sind auch im Protokoll vermerkt. Der Vorteil dieses Protokolls ist, dass es Details wie Inkubationszeit und Temperatur enthält, die optimiert wurden, um Neutrophilen-Linienzellen im gesamten Knochenmark zu erhalten, um eine Untersuchung des intakten gesamten Knochenmarks zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann auch leicht für Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanwendungen geändert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Experimente folgten den anerkannten Richtlinien des La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care and Use Committee, und die Zulassung für die Verwendung von Nagetieren wurde vom La Jolla Institute for Allergy and Immunology nach Kriterien gemäß den der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health.
1. Ernte Maus Knochenmark (BM)
- Kaufen Sie C57BL/6J Mäuse von einem kommerziellen Anbieter. Füttern Sie die Standard-Nagetier-Chow-Diät und beherbergen Sie sie in Mikroisolatorkäfigen in einer pathogenenfreien Anlage.
- Verwenden Sie männliche Mäuse, 6-10 Wochen alt, für experimentelle Zwecke. Euthanisieren durch CO2-Inhalation gefolgt von der Zervixdislokation.
- Legen Sie die Maus auf ein steriles chirurgisches Pad mit der Bauchseite nach oben. Sterilisieren Sie die Haut des Bauch- und Hinterbeinebereichs, indem Sie 70% Ethanol sprühen. Verwenden Sie ein Paar sezierende chirurgische Schere, um die Bauchhöhle zu schneiden.
- Entfernen Sie die Haut, um Hinterbeine freizulegen. Verwenden Sie ein Paar stumpfe Spitze Dressing Zange, um die Maus Tibia direkt unter dem Knöchel zu halten. Verwenden Sie ein weiteres Paar gekrümmte Ankleidezangen, um die Tibia unter den stumpfen, spitzen Ankleidezangen zu stabilisieren. Brechen Sie die Tibia und setzen Sie den Knochen durch Abreißen des Muskels mit der stumpfen Spitze Dressing Zange.
HINWEIS: Die Tibia ist lose am Kniegelenk befestigt und kann mit den stumpfen Klappenzangen leicht herausgepickt werden. - Die Tibia in kalte 1x PBS geben.
- Als nächstes bewegen Sie die stabilisierenden gekrümmten Verbandszangen nach unten zum Oberschenkelknochen. Schieben Sie die stumpfe Spitze Dressing Zange unter dem Kniegelenk und halten Sie die Kniescheibe. Dislozieren Sie die Kniescheibe, indem Sie sie sanft nach oben ziehen. Setzen Sie den Oberschenkelknochen aus, indem Sie den an der Kniescheibe befestigten Muskel abreißen. Halten Sie den freiliegenden Oberschenkelknochen durch die gekrümmten Verbandszangen und schneiden Sie den Oberschenkelknochen von der Unterseite des Knochens mit einer sezierenden chirurgischen Schere ab.
- Den Oberschenkelknochen in kalte 1x PBS geben.
- Lochen Sie ein Loch in 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit einer 18 G Nadel.
- Legen Sie sowohl Tibia als auch Oberschenkelknochen in das gleiche 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit dem offenen Ende der Knochen nach unten zum Loch.
- Legen Sie das 0,5 ml-Rohr mit Tibia und Oberschenkelknochen in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Drehen Sie die doppelschichtigen Rohre, die sowohl Tibia als auch Oberschenkelknochen bei 5.510 x g für 30 s in der Mikrozentrifuge enthalten.
- Stellen Sie sicher, dass der BM aus den Knochen extrahiert und an der Unterseite des Rohres gepelt wird. Den 0,5 ml-Schlauch mit den heiligen Knochen. Die Maus BM ist bereit für die nächsten Schritte.
HINWEIS: Human BM wird zu klinischen Ressourcen geerntet, wie zuvor beschrieben11.
2. Flecken BM-Zellen für CyTOF
- Setzen Sie den BM in 1 mL 1x Red Blood Cell (RBC) Lysepuffer aus. Für humane BM, resuspendieren Sie die gesamte BM in einem 10x Volumen von 1x Red Blood Cell (RBC) LysePuffer. 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- Drehen Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Wiederholen Sie für humanes BM Schritt 2.1 und 2.2, bevor Sie mit Schritt 2.3 fortfahren.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet ungestört lassen. Das Pellet mit 1 ml kalt1x PBS aussetzen. Filtern Sie das Pellet in ein 15 ml konisches Rohr durch ein 70 m Zellsieb. Die BM-Zellen sind nun vollständig in die Röhre aus dem Muskel- und Knochenrest isoliert. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 9 ml kalte 1x PBS in das Rohr geben.
- Drehen Sie das 15 ml-Rohr bei 350 x g für 5min bei 4 °C.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und die BM-Zellen mit 10 ml kaltem PBS wieder aufsetzen. Nehmen Sie ein Aliquot von Zellen zum Zählen. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.
- Aliquot 5 x 106 BM Zellen in ein neues 15 ml Rohr für CyTOF Färbung.
- Drehen Sie das 15 ml Rohr aliquot bei 350 x g für 5 min bei 4 °C.
- Sorgsam den Überstand ansaugen und die BM-Zellen mit 125 nM Cisplatin in 1 ml CyTOF Staining Buffer als Lebensfähigkeitsindikator für die Probe wieder aussetzen. 5 min bei RT inkubieren.
- Nach der Inkubation 4 ml CyTOF-Färbepuffer in das Rohr geben. Drehen Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Für menschlicheBM, fügen Sie 10% menschliches AB-Serum in den CyTOF-Färbungspuffer.
- Sorgsam den Überstand ansaugen und die BM-Zellen mit einer 50-L-Fc-Rezeptor-Blockierlösung wieder aussetzen. 10 min bei 4 °C inkubieren. Überspringen Sie diesen Schritt für human BM.
- Fügen Sie der Probe 50 L des hausgemachten CyTOF-Antikörpercocktails5 hinzu, so dass das Gesamtfärbevolumen 100 l beträgt. Sanft Pipette zu mischen. 30 min bei 4 °C inkubieren. Das Endvolumen des Antikörpercocktails beträgt 100 l für Maus-BM- und Human-BM-Proben.
- Fügen Sie 2 ml CyTOF-Färbepuffer in jedes Rohr nach der Inkubation, um die Zellen zu waschen, drehen Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min bei 4 °C.
- Wiederholen Sie Schritt 2.12 für insgesamt zwei Wähbe.
- Bereiten Sie eine frische 1,6% Formaldehydlösung aus dem 16% Stock ampule vor. 1 Teil des Vorrats formaldehyd mit 9 Teilen von 1x PBS verdünnen.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet mit 1 ml frischer 1,6% FA-Lösung wieder aufhängen. 15 min bei RT inkubieren.
- Drehen Sie das Rohr bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet mit 125 nM Interkalationslösung in 1 ml Fix/Perm-Puffer wieder aufhängen.
- Inkubieren Sie die Probe in Interkalationslösung über Nacht bei 4 °C.
3. Bereiten Sie Zellen für die CyTOF-Akquisition vor
- Sanft Wirbel und Spin-Zellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.
- Waschen Sie Zellen durch Zugabe von 2 ml CyTOF-Färbepuffer, Spinzellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
- Resuspend Zellen in 1 ml diH2O. Reservieren Sie ein kleines Volumen (ca. 10 l) von jedem Rohr, um Zellen zu zählen.
- Spinzellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.
- Wiederholen Sie Schritt 3.3 und 3.4.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und die Zellen im Pellet lassen. Die BM-Zellen sind nun bereit für die Resuspension auf die Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml für die CyTOF-Erfassung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 1 wird als Beispiel aus CyTOF-Experimenten dargestellt. Auf diesem tSNE-Diagramm wurden die Zellen über mehrere Mausgewebe basierend auf der Ähnlichkeit ihrer Oberflächenmarker-Expressionsprofile, die von einem CyTOF-Panel mit 33 Parametern gemessen wurden, in Teilmengen gruppiert. Zellen mit ähnlichen Eigenschaften wurden automatisch gruppiert, z. B. Die Neutrophile, Makrophagen oder die DCs basierend auf der Expression der 33 Marker auf jeder Zelle.
Abbildung 2 wird als Beispiel für das Maus-BM-CyTOF-Experiment unter Verwendung des in dieser Studie vorgestellten Protokolls dargestellt. Das Protokoll bewahrte die Integrität des gesamten BM, was zur Entdeckung einer bisher unbekannten Zellpopulation führte, die Neutrophil (Ly6G+, Abbildung 2A) und HSPC (CD117+, Abbildung 2B) Signatur-Oberflächenmarker mitdrückt. Gleichzeitig. Diese Zellpopulation zeigt ein deutliches Muster der Oberflächenmarkerexpression, gemessen durch unser CyTOF-Panel (Abbildung 2C) und wurde von früheren myeloischen Vorläuferforschungen aufgrund von Ly6G+ Zellerschöpfung1,2, 3. Noch wichtiger ist, dass dieses Ergebnis zur Entdeckung der kleinen Teilmenge des Clusters auf der linken Seite der viSNE-Karte führte, die Ly6G nicht ausdrückt, jedoch eng an die CD117+Ly6G+ Zellen gruppiert wurde, was auf die Ähnlichkeit dieser Zellen der Neutrophilen-Linie basierend auf der Expression der 39 Marker, die für dieses CyTOF-Experiment verwendet werden.
Wir verwendeten das Markerexpressionsprofil aus den CyTOF-Daten in Abbildung 2C, um ein 13-farbiges FACS-Panel (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) zu erstellen, das es uns ermöglicht, die neutrophilen Vorläufer durch Durchflusszytometrie für nachgeschaltete funktionelle Assays zu isolieren ( Abbildung 3).
Abbildung 1: Beispiel für das tSNE-Diagramm, das aus CyTOF stammt. Aggregierte tSNE-Dimensionalität reduzierte einzelzellige Daten aus allen analysierten Mäusegeweben wurden von den 28 "unbeaufsichtigten" Clustern geplottet und farbcodiert. Die groben Identitäten der einzelnen Cluster wurden auf der Grundlage verschiedener veröffentlichter Analysen kommentiert. Diese Zahl wurde ab Referenz4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Automatisierte einzellige Analyse von Lin-CD117+Ly6A/E- HSPC-Zellen im Knochenmark identifiziert eine ausgeprägte neutrophile Vorläuferpopulation. viSNE-Karten von Lin-CD117+Ly6A/E- HSPC-Zellen werden als Punkt-Overlays angezeigt, um die 5 automatisierten Cluster anzuzeigen. (A) Ly6G und (B) CD117 Expressionsmusterwird auf viSNE-Karte von Lin - CD117+Ly6A/E- HSPC-Zellen als Spektrum farbige Punkte angezeigt. (C) Die Ausdrucksmuster der angegebenen Marker werden als Histogramm-Overlays jedes Clusters angezeigt. Diese Zahl wurde ab Referenz7geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : FACS-Gating-Strategie mit CyTOF-Dataset (Mass Cytometry) demonstriert. Die manuell abgegrenzte Zielpopulation wurde zur Validierung an die automatisierte viSNE-Karte zurückgegnet. Diese Zahl wurde ab Referenz7geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In den vergangenen Jahrzehnten wurde die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie als Hauptmethode zur Untersuchung zellulärer Abstammungundlzeichen und Heterogenität1,2,3verwendet. Obwohl die Durchflusszytometrie mehrdimensionale Daten lieferte, ist diese Methode durch die Auswahl von Parametern und spektralen Überlappungen eingeschränkt. Um die Schwäche der Durchflusszytometrie zu überwinden, nutzten wir CyTOF, das schwere Metallisotope anstelle von Fluorophoren verwendet, um Antikörper zu kennzeichnen, die Übersprechen zwischen Detektorkanälen oder Autofluoreszenz der Zellen eliminieren, daher können viele mehr Parameter gleichzeitig auf Einzelzellebene und erzeugen eine viel tiefere Bewertung der zellulären Vielfalt12. Zellpopulationen, die in der Vergangenheit während des Erschöpfungs- oder Gatingprozesses weggelassen wurden, insbesondere wichtige Immunzellen wie Neutrophilen-Linienzellen, die lange als homogen galten13,14, können besser durch CyTOF 2 charakterisiert werden ,3,7.
Um dieses leistungsstarke Zytometrie-Tool von CyTOF zur Untersuchung der Zellheterogenität und zur Charakterisierung seltener Zellpopulationen unterzubringen, sind Protokolle, die die Integrität biologischer Proben bewahren, äußerst praktisch für Heterogenitätsstudien. Hier beschrieben wir ein Protokoll zur Verarbeitung ganzer BM für CyTOF, das eine umfassende Charakterisierung neuer Zellpopulationen in intakten ganzen BM ermöglicht, die für Maus- oder Humanstudien verwendet werden können. Das ganze Knochenmark, das von Maus und Mensch isoliert ist, enthält Zellpopulationen, insbesondere Neutrophilenzellen, die sehr zerbrechlich und empfindlich auf Umweltveränderungen wie Temperatur- und Kulturbedingungen reagieren. In diesem Protokoll haben wir die Temperatur- und Inkubationsbedingungen für jeden Schritt optimiert, um diese empfindlichen Populationen auf ein höchstmögliches Niveau zu halten. Dadurch ist die Integrität der gesamten Knochenmarkzellen gut geschützt. Mit personalisierten Marker Panel in dieses Protokoll integriert, Forscher können mehr Zellen von Interesse in verschiedenen Forschungsbereichen identifizieren.
Obwohl CyTOF ein leistungsfähiges Endpunkt-Analysewerkzeug für die Entdeckung neuer Zellpopulationen ist und in der Lage ist, die Funktion der neuen Populationen anhand ihrer Markereigenschaften vorherzusagen, ist diese Technologie für weitere nachgelagerte funktionelle Studien begrenzt. Um nachgelagerte Funktionsstudien zu ermöglichen, haben wir viSNE verwendet, um jeden Cluster umfassend zu charakterisieren, indem wir deren Expressionsniveau der einzelnen 39 Marker untersuchten und die unterschiedlichen Markerkombinationen fanden, wie in Abbildung 2Cdargestellt. Obwohl CyTOF-Daten nicht auf aktuelle Sortiertechnologien angewendet werden konnten, könnte ihr Vorteil bei der gleichzeitigen Messung vieler Parameter uns helfen, die beste Kombination von Markern innerhalb begrenzter Parameter zu identifizieren. Dieser kritische Schritt der Datenanalyse half uns, die CyTOF-Ergebnisse voll auszuschöpfen, um ein FACS-kompatibles fluoreszenzbasiertes Sortierpanel zu entwerfen. In diesem Experiment haben wir diese Informationen beispielsweise in Abbildung 2C verwendet, um ein 13-farbiges FACS-Panel zu erstellen, das es uns ermöglicht, den neutrophilen Vorläufer (NeP) durch Durchflusszytometrie für nachgeschaltete funktionelle Assays zu isolieren (Abbildung 3). Durch die Verwendung von CyTOF und FACS in einer Pipeline könnten diese Methoden zusammen die Isolierung neu entdeckter Zelltypen für funktionelle Studien wie Morphologie, Vielseitigkeit, In-vitro-Assays und In-vivo-Studien ermöglichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken dem LJI Flow Cytometry Kern für die Unterstützung bei der Massenzytometrie. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R01HL134236, P01HL136275 und R01CA202987 (alle an C.C.H) und ADA7-12-MN-31 (04) (zu C.C.H. und Y.P.Z) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G.
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A.
