Summary
जीवाणु फिटनेस का निर्धारण करने के लिए यह आणविक आधारित दृष्टिकोण अद्वितीय जीनोमिक डीएनए बारकोड का उपयोग कर सूक्ष्मजीवों का सटीक और सटीक पता लगाने की सुविधा देता है जो डिजिटल पीसीआर के माध्यम से परिमाणित होते हैं। प्रोटोकॉल साल्मोनेला उपभेदों के लिए प्रतिस्पर्धी सूचकांक की गणना का वर्णन करता है; हालांकि, प्रौद्योगिकी आसानी से किसी भी आनुवंशिक रूप से मैले करने योग्य जीव के पूर्ण परिमाणीकरण की आवश्यकता प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है.
Abstract
एक प्रतिस्पर्धी सूचकांक एक आम तरीका है जीवाणु फिटनेस और / इस दृष्टिकोण की उपयोगिता प्रदर्शन करने के लिए अपनी आसानी और एक जंगली प्रकार के जीव के लिए कई उपभेदों की फिटनेस मानकीकृत करने की क्षमता से उदाहरण है. तकनीक सीमित है, तथापि, उपलब्ध phenotypic मार्करों और उपभेदों कि एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है की संख्या से, दोहराने प्रयोगों की एक बड़ी संख्या के लिए की जरूरत पैदा. प्रयोगों की बड़ी संख्या के साथ समवर्ती, phenotypic मार्करों के आधार पर बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए श्रम और सामग्री की लागत नगण्य नहीं हैं. सकारात्मक पहलुओं को बनाए रखते हुए इन नकारात्मक पहलुओं पर काबू पाने के लिए, हमने जीवाणु गुणसूत्रों पर आनुवंशिक मार्करों को इंजीनियरिंग के बाद सीधे सूक्ष्मजीवों की मात्रा निर्धारित करने के लिए आणविक-आधारित दृष्टिकोण विकसित किया है। अद्वितीय, 25 आधार जोड़ी डीएनए बारकोड जंगली प्रकार और साल्मोनेलाके उत्परिवर्ती उपभेदों के गुणसूत्र पर एक अहानिकर टिड्डी पर डाला गया था। इन विट्रो प्रतियोगिता प्रयोगों में पूल्ड उपभेदों से मिलकर inocula का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. प्रतियोगिता के बाद, प्रत्येक तनाव की निरपेक्ष संख्या डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित की गई थी और प्रत्येक तनाव के लिए प्रतिस्पर्धी सूचकांक उन मूल्यों से गणना की गई. हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि Salmonella मात्रा निर्धारित करने के लिए इस दृष्टिकोण बेहद संवेदनशील है, सटीक, और दोनों अत्यधिक प्रचुर मात्रा में (उच्च फिटनेस) और दुर्लभ (कम फिटनेस) सूक्ष्मजीवों का पता लगाने के लिए सटीक. इसके अतिरिक्त, इस तकनीक को आसानी से संशोधन करने में सक्षम गुणसूत्रों के साथ लगभग किसी भी जीव के लिए अनुकूल है, साथ ही विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन है कि सूक्ष्मजीवों की पूर्ण परिमाणीकरण की आवश्यकता है.
Introduction
रोगजनक जीवों की फिटनेस और उग्रता का आकलन माइक्रोबायोलॉजी अनुसंधान का एक मूलभूत पहलू है। यह उपभेदों के बीच या उत्परिवर्तित जीवों के बीच तुलना करने के लिए सक्षम बनाता है, जो शोधकर्ताओं विशिष्ट परिस्थितियों के तहत कुछ जीन के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. परंपरागत रूप से, उग्र मूल्यांकन विभिन्न जीवाणु उपभेदों का उपयोग कर संक्रमण के एक पशु मॉडल का इस्तेमाल करता है और संक्रमित जानवर के परिणाम को देख (जैसे संक्रामक खुराक50, घातक खुराक50, मौत के लिए समय, लक्षण गंभीरता, की कमी लक्षण, आदि). इस प्रक्रिया उग्रता के मूल्यवान विवरण प्रदान करता है, लेकिन यह क्रम में जंगली प्रकार से विविधताओं का पता लगाने के लिए परिणामों में काफी मतभेद पैदा करने के लिए उपभेदों की आवश्यकता है. इसके अलावा, परिणाम अर्द्ध मात्रात्मक हैं क्योंकि जबकि रोग प्रगति और लक्षण गंभीरता व्यक्तिपरक समय के साथ परिमाणित किया जा सकता है, जंगली प्रकार की तुलना में उग्रता की व्याख्या अधिक गुणात्मक है (यानी अधिक, कम, या समान रूप से उग्र). पशु infectivity परख प्रदर्शन करने के लिए एक आम विकल्प प्रतिस्पर्धी सूचकांक (सीआईए) उत्पन्न करने के लिए है, मूल्यों है कि सीधे फिटनेस या एक मिश्रित संक्रमण1में एक जंगली प्रकार समकक्ष करने के लिए एक तनाव की उग्रता की तुलना. इस तकनीक को एक जंगली प्रकार तनाव के लिए उग्रता मानकीकृत और क्षीणन की डिग्री को प्रतिबिंबित करने के लिए एक परिमाणात्मक मूल्य का निर्धारण द्वारा संक्रमण के एक पारंपरिक पशु मॉडल पर कई फायदे हैं. इस तकनीक को बैक्टीरिया में जीन इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जो रद्द प्रतिस्पर्धी सूचकांक (सीओआई)2का निर्धारण करके किया जा सकता है। उत्परिवर्तित जीवों के एक समूह के लिए एक सीओआई की गणना शोधकर्ताओं को निर्धारित करने के लिए कि क्या दो जीन स्वतंत्र रूप से रोगजनन में योगदान या यदि वे एक ही उग्रता मार्ग में शामिल हैं और एक दूसरे पर निर्भर करने की अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, सीआई की गणना करने के लिए बैक्टीरिया की गणना की आवश्यकता होती है जो जीवों के रोगजनन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। CIs और COIs भी शोधकर्ताओं avirulent उपभेदों कि नैदानिक रोग का कारण नहीं है, लेकिन अभी भी फिटनेस में मतभेद है का आकलन करने के लिए अनुमति देते हैं. इस तकनीक को पारंपरिक एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों के उपयोग के लिए उपभेदों की पहचान द्वारा सीमित है, जिससे एक समय में केवल एक या दो के लिए इनपुट उपभेदों की संख्या सीमित. इस सीमा के कारण, प्रयोगात्मक समूहों और प्रतिकृति की बड़ी संख्या की आवश्यकता है, जो श्रम और सामग्री की लागत को जोड़ने के अलावा, भी प्रयोगात्मक स्थितियों और गलत परिणामों में परिवर्तनशीलता के लिए अवसर बढ़ जाती है. (उग्रता, फिटनेस, और जीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए मिश्रित संक्रमण का उपयोग करने के लाभों और अनुप्रयोगों की पूरी तरह से समीक्षा के लिए, C.R. Beuzn और D.W. Holden 1) देखें
इस सीमा को दूर करने के प्रयास किए गए हैं, जैसे प्रवाह साइटोमेट्री3,4,5के माध्यम से मात्रा निर्धारित फ्लोरोसेंट-लेबल कोशिकाओं का उपयोग । इस तकनीक या तो का उपयोग कर कोशिकाओं की मात्रा 1) phenotypic मार्करों या 2 के लिए एंटीबॉडी लेबल अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन किया. लेबल किए गए एंटीबॉडी के उपयोग में 1,000 कोशिकाओं/एमएल का पता लगाने की सीमा होती है, और इसलिए3का विश्लेषण करने के लिए उच्च संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में शरीर क्रिया विज्ञान बदल जाता है और उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति6के परिणामस्वरूप फिटनेस परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं . दोनों तरीकों प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने का पता लगाने योग्य फ्लोरोसेंट मार्करों की संख्या द्वारा सीमित कर रहे हैं. आण्विक परिमाणीकरण में प्रगति एक माइक्रोरेरे तकनीक के विकास के माध्यम से प्राप्त की गई थी , जिसने एक म्यूरीन मॉडल7में 1,000 से अधिक उपभेदों के प्रारंभिक मिश्रित संक्रमण से 120 उपभेदों में क्षीणन का पता लगाया था . इस तकनीक उत्परिवर्तित उपभेदों से आरएनए के एक microarray विश्लेषण का उपयोग किया, जो परिणाम में काफी परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व. फिर भी, यह स्थापित किया है कि मिश्रित संक्रमण के बड़े पूल एक उपयोगी उपकरण हो सकता है और संवेदनशील पता लगाने की तकनीक का उपयोग करके, जीवाणु उग्रता में मतभेद की पहचान की जा सकती है. अगली पीढ़ी अनुक्रमण के विकास के साथ, Tn-सेक transposon उत्परिवर्तनों की उपयोगिता का विस्तार, बैक्टीरिया हैकि बेतरतीब ढंग से उत्परिवर्तित 8,9,10थे परिमाणित करने के लिए एक शक्तिशाली विधि को सक्षम करने, 11| हाल ही में एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था जो ट्रांसपोसन की आवश्यकता को समाप्त करताहै और इसके बजाय डीएनए बारकोड का उपयोग जीनोमिक परिवर्तनों की और फिटनेस पर उनके प्रभाव को आसानी से पहचानने और ट्रैक करने के लिए करता है . यह तकनीक एक प्रमुख प्रगति है, लेकिन जीनोमिक बारकोड की प्रविष्टि अभी भी एक यादृच्छिक प्रक्रिया है. पिछले प्रयोगों की randomness पर काबू पाने के लिए, Yoon एट अल. बैक्टीरिया13के गुणसूत्रों पर सटीक स्थानों पर डाला अद्वितीय डीएनए बारकोड का उपयोग कर Salmonella उपभेदों के CIs की गणना करने के लिए एक विधि विकसित की है। अद्वितीय बारकोड उपभेदों प्रत्येक अद्वितीय बारकोड के लिए विशिष्ट SYBR हरे और प्राइमर के साथ एक QPCR आधारित विधि का उपयोग कर पाया गया. तकनीक QPCR द्वारा लगाए गए बाधाओं द्वारा सीमित किया गया था, प्राइमर क्षमता और कम संवेदनशीलता में मतभेद सहित, नेस्टेड-पीसीआर के लिए की आवश्यकता से पहले द्वारा सबूत QPCR. फिर भी, इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया है कि लक्षित जीनोमिक संशोधनों का पता लगाने और कई जीवाणु उपभेदों के संभावित परिमाणात्मक पूल के लिए शोषण किया जा सकता है.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम मिश्रित inocula के बड़े पूल के साथ जीवाणु प्रतियोगिता प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक उपन्यास पद्धति का वर्णन एक अत्यधिक संवेदनशील डिजिटल पीसीआर तकनीक का उपयोग कर सटीक परिमाणीकरण के बाद. प्रोटोकॉल में गुणसूत्र के अहानिकर क्षेत्र पर सम्मिलित एक अद्वितीय डीएनए बारकोड के साथ आनुवंशिक रूप से लेबल जीवाणु उपभेदों शामिल है। इस संशोधन उपभेदों जल्दी और सही पारंपरिक धारावाहिक कमजोर पड़ने के बजाय आधुनिक आणविक प्रौद्योगिकी का उपयोग कर मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है, प्रतिकृति चढ़ाना, और गिनती कॉलोनी बनाने इकाइयों है कि phenotypic मार्करों पर भरोसा करते हैं (यानी एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रतिरोध ). संशोधनों एक एकल पूल inoculum में कई उपभेदों के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, काफी हद तक प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की संभावना को कम करने क्योंकि सभी उपभेदों सटीक एक ही स्थिति को उजागर कर रहे हैं. इसके अलावा, जबकि इस तकनीक Salmonella enterica serovar Typhimurium में विकसित किया गया था, यह अत्यधिक किसी भी आनुवंशिक रूप से आघात करने योग्य जीव और लगभग किसी भी प्रयोगात्मक डिजाइन जहां सटीक जीवाणु गिनती की आवश्यकता है के लिए अनुकूलनीय है, एक नया प्रदान उपकरण पिछले तरीकों द्वारा लगाए गए बाधाओं के बिना सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में सटीकता और थ्रूपुट बढ़ाने के लिए।
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Protocol
1. एक प्लासमिड पर अद्वितीय डीएनए बारकोड शामिल करें जिसमें एलीलिक एक्सचेंज के लिए आवश्यक घटक शामिल हैं
नोट: एक नया प्लाज्मिड, नाम pSKAP, एक उच्च प्रतिलिपि संख्या और मौजूदा pKD13 allelic विनिमय प्लाज्मिड की तुलना में वृद्धि हुई परिवर्तन दक्षता के साथ बनाया गया था. यह चरण 1-1-1-12 में वर्णित है (चित्र 1)। एलाइजा एक्सचेंज के लिए अद्वितीय डीएनए बारकोड और घटकों वाले अंतिम ीकृत प्लाज्मिड एक प्लाज्मिड भंडार (सामग्री तालिका) के माध्यम से उपलब्ध हैं ।
- एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करना, pKD1314 और pPCR स्क्रिप्ट कैम एसके+ रात भर से बैक्टीरिया संस्कृतियों से Luria-Bertani (LB) शोरबा के साथ पूरक 50g/ एस.के.+, क्रमशः) (सारणी 1)।
- निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक प्रतिबंध एंजाइमों HindIII और BamHI का उपयोग कर दोनों प्लाज्मिड पर प्रतिबंध पाचन प्रदर्शन करते हैं।
- प्रतिबंध एंजाइमों निकालें और pPCR स्क्रिप्ट कैम एस के+ प्रतिक्रिया से डीएनए excised और 3,370 आधार जोड़ी (बीपी) प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी को शुद्ध निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए सफाई किट का उपयोग कर.
- एक 1% agarose जेल पर pKD13 प्रतिबंध पाचन से टुकड़े अलग एक electrophoresis कक्ष का उपयोग कर.
- नीले प्रकाश ट्रांसलियुमिनेटर का उपयोग करके बैंडों को विज़ुअलाइज़ करें और जेल से 1,333 बीपी का टुकड़ा निकाल दें (चित्र 1C) ।
नोट: इस टुकड़े में गुणसूत्र एलाइजा प्रतिस्थापन के लिए आवश्यक एफआरटी-फ्लैंक्ड कानामाइसिन प्रतिरोध जीन होता है। - एक वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर कदम 1.5 से excised डीएनए को शुद्ध करें।
- pSKAP बनाने के लिए, pKD13 से शुद्ध टुकड़ा ligate (चरण 1.6 से) pPCR स्क्रिप्ट कैम एसकेमें + (चरण 1.3 से) निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक T4 डीएनए ligase का उपयोग कर.
- निर्माता के प्रोटोकॉल (तालिका 1) के बाद ligated pSKAP प्लाज्मिड के साथ रासायनिक रूप से सक्षम DH5 ] कोशिकाओं को बदलना।
- एलबी आगर प्लेटों पर फैले ट्रांसफार्मरों को रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 ग्राम/एमएल कानामाइसिन और इनक्यूबेट के साथ पूरक किया गया।
- प्लेट से एक कॉलोनी उठाओ और इसे एक नई एलबी आगर प्लेट पर लकीर 50 ग्राम/एमएल कानामाइसिन के साथ पूरक और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। इस प्लेट से एक कॉलोनी उठाओ और एलबी शोरबा टीका करने के लिए उपयोग 50 g/ निरंतर आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृति इनक्यूबेट करें।
- रात भर जीवाणु संस्कृति से pSKAP शुद्ध करने के लिए एक वाणिज्यिक प्लाज़्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करें।
- निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार हिंद III और Bam HI का उपयोग कर चरण 1.11 से प्लाज्मिड का नैदानिक प्रतिबंध पाचन करें। कदम 1.4-1.5 में के रूप में एक 1% agarose जेल पर टुकड़े कल्पना.
नोट: PSKAP कुल आकार 4,703 बीपी होना चाहिए. खंड चरण 1.12 के बाद 3,370 और 1,333 बीपी होना चाहिए। - सम्मिलित साइट-निर्देशित मटजनन (एसडीएम) (तालिका 2 और एस 1) के लिए डिजाइन पीसीआर प्राइमर इस तरह से है कि pSKAP की स्थिति 725 पर एक अद्वितीय 25-आधारीय डीएनए अनुक्रम सम्मिलित करने के लिए ( चित्र2)।
नोट: बारकोड डीएनए बस FRT-फ्लैंक बंद kanamycin प्रतिरोध जीन के बाहर प्लाज्मिड में डाला जाता है, तो बारकोड kanamycin प्रतिरोध कैसेट के बाद हटाने के दौरान खो नहीं है. यदि नए बारकोड दृश्यों को उत्पन्न कर रहा है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए ऑनलाइन टूल का उपयोग करें कि फ्लोरोसेंट-लेबल लक्ष्य-विशिष्ट PCR जांच (इसके बाद केवल "प्रोब्स" के रूप में संदर्भित) कुशलतापूर्वक नए अनुक्रम से बाध्य होगा. उन्हें बनाने के लिए आवश्यक प्राइमर के साथ-साथ, तिथि करने के लिए डिज़ाइन किए गए सम्मिलन अनुक्रम, टेबल्स 2 और S1में प्रदान किए जाते हैं। - एक वाणिज्यिक उच्च निष्ठा डीएनए polymerase, वांछित प्राइमर जोड़े (तालिका 2), और pSKAP टेम्पलेट का उपयोग कर एसडीएम प्रतिक्रियाओं तैयार करें। थर्मोसाइकिलर को निम्नलिखित कार्य करने के लिए सेट करें: 1) 30 s, 2) 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 15 s के लिए 56 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 3) दोहराने के चरण 2, 24 बार, 4) 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 5) 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
- पीसीआर के पूरा होने के बाद, प्रतिक्रिया करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम Dpn मैं जोड़कर pSKAP टेम्पलेट deplete. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
नोट: उत्पाद के आकार और शुद्धता को सत्यापित करने के लिए पीसीआर से उत्पादों को एक agarose जेल पर कल्पना की जानी चाहिए। एक नियंत्रण Dpn मैं पाचन unmodified pSKAP टेम्पलेट से मिलकर किया जा सकता है और बाद के चरणों में इस्तेमाल किया सुनिश्चित करने के लिए टेम्पलेट डीएनए पूरी तरह से पचा है. - निर्माता की सिफारिशों के अनुसार वाणिज्यिक रासायनिक रूप से सक्षम DH5 कोशिकाओं के 100 $L को बदलने के लिए चरण 1.15 से उत्पाद के 5 डिग्री एल का उपयोग करें।
- एलबी आगर प्लेटों पर फैले रूपांतरकों को रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 ग्राम/एमएल क्लोरएम्हेनिकॉल और इनक्यूबेट के साथ पूरक किया गया।
- रात भर प्लेटों से एक कॉलोनी (या कालोनियों) का चयन करें और व्यक्तिगत एलबी आगर प्लेटों पर लकीर का चयन करें जो 25 ग्राम/एमएल क्लोरैम्हेनिकॉल के साथ पूरक है और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। रात भर प्लेटों से एक कॉलोनी का चयन करें और एलबी शोरबा के 5 एमएल टीका करने के लिए उपयोग 25 ग्राम / लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट संस्कृति (एस)।
- रात भर संस्कृति (ओं) से प्लाज्मिड को शुद्ध करने के लिए एक वाणिज्यिक प्लाज़्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करें।
- M13 Forward अनुक्रम प्राइमर (तालिका2) का उपयोग करते हुए संगर अनुक्रम शुद्ध प्लाज्मिड्स । उत्परिवर्तित क्षेत्र की तुलना मूल प्लाज्मिड से करें और एसडीएम सम्मिलित सटीकता के लिए आकलन करें।
- बारकोड प्रविष्टि और सटीकता की पुष्टि करने के बाद, प्रत्येक बारकोड और प्लाज्मिड एक नाम असाइन करें।
नोट: आज तक उत्पन्न बारकोड को दो-अक्षर ों का पदनाम सौंपा गया है: ए.ए., एबी, एसी, ..., बीए, बी बी, बीसी, आदि। Barcoded plasmids pSKAP$AA, pSKAP]A, pSKAP]AC, ..., pSKAP]BA, pSKAP]BB, pSKAP]BC, आदि के रूप में निरूपित कर रहे हैं - डीएनए बारकोड की वांछित संख्या उत्पन्न करने के लिए चरण 1.14-1.21 दोहराएँ।
2. एस के क्रोमोसोम पर डीएनए बारकोड परिचय. टाइफिमुरियम
नोट: एस पर डीएनए बारकोड की प्रविष्टि Typhimurium गुणसूत्र एक allelic विनिमय विधि Datsenko और Wanner14 कि एस में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है द्वारा वर्णित का उपयोग करके हासिल की है. टायफिमुरियम।
- एस पर टिड्डी का निर्धारण करें। Typhimurium जीनोम जिस पर डीएनए बारकोड डालने के लिए (चित्र 3) .
नोट: गुणसूत्र के एक बड़े, अंतरजनित क्षेत्र का चयन करें। गैर-कोडिंग आरएनए का उत्पादन करने वाले क्षेत्रों से बचें। इस अध्ययन में अवशेषों के बीच डाल पी के डाउनस्ट्रीम का उपयोग किया 1,213,840 और 1,213,861 (जीनोम विधानसभा GCA से निर्धारित GCA]000022165.1). इस क्षेत्र में पहले आनुवंशिक रूप से जीनों के पारपूरकन में15के लिए हेरफेर किया गया है . वैकल्पिक रूप से, एक डीएनए बारकोड शुरू किया जा सकता है, जबकि एक साथ ब्याज की एक जीन को बाधित. ऐसा करने के लिए इस प्रोटोकॉल में कम से कम परिवर्तन की आवश्यकता होगी और उत्परिवर्ती निर्माण को कारगर बनाना होगा। - डिजाइन पीसीआर प्राइमर अद्वितीय बारकोड और FRT-फ्लैंक्ड kanamycin प्रतिरोध जीन वांछित pSKAP बारकोड युक्त प्लाज्मिड से बढ़ाना करने के लिए कदम 1.21 (तालिका 2)। प्रत्येक प्राइमर (तालिका 2) के 5 के अंत में चरण 2.1 में चयनित क्षेत्रके लिए समजात हैं कि 40-न्यूक्लिओटाइड एक्सटेंशन जोड़ें।
- एक वाणिज्यिक उच्च निष्ठा polymerase, कदम 2.2 से प्राइमर, और टेम्पलेट के रूप में वांछित pSKAP बारकोड युक्त प्लाज्मिड का उपयोग प्रवर्धन प्रदर्शन करते हैं। थर्मोसाइकिलर को निम्नलिखित कार्य करने के लिए सेट करें: 1) 30 s, 2) 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 3) 15 s के लिए 56 डिग्री सेल्सियस, 60 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, दोहराने के चरण 2-4 29 बार, 5) 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट, 6) 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
- पीसीआर के पूरा होने के बाद, चरण 1.15 में वर्णित के रूप में DpnI का उपयोग कर टेम्पलेट डीएनए deplete. शुद्ध और निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक डीएनए सफाई किट का उपयोग कर डीएनए ध्यान केंद्रित।
- एसमें म्यूटेंट बनाने के लिए पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल का संदर्भ लें। Typhimurium पीसीआर उत्पादों से 14028s तनाव14,16,17,18.
नोट: यह आवश्यक नहीं है कि कानामाइसिन प्रतिरोध जीन गुणसूत्र से निकाला जाता है। हालांकि, जीन का उच्छेदन जीवाणु गुणसूत्र के लिए न्यूनतम विघटनकारी है क्योंकि यह 129 बीपी निशान का परिणाम है जो संभावित डाउनस्ट्रीम जीन को फ्रेम में छोड़ देगा। यह अनुशंसा की जाती है कि कानामाइसिन प्रतिरोध जीन युक्त तनाव को बनाए रखा जाता है क्योंकि इसका उपयोग P22-मध्यस्थ ट्रांसडक्शन के माध्यम से उपभेदों के बीच बारकोड को स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है। - कदम दोहराएँ 2.3 - 2.5 उपयुक्त बारकोड के साथ वांछित उपभेदों बनाने के लिए.
नोट: बारकोड जंगली प्रकार एस में पेश किया जा सकता है। Typhimurium है कि तब आगे आनुवंशिक हेरफेर के अधीन किया जा सकता है, या बारकोड उपभेदों है कि पहले आनुवंशिक रूप से बदल दिया गया है में पेश किया जा सकता है.
3. जीवाणु विकास की स्थिति और इन विट्रो प्रतियोगिता परख
- बैक्टीरिया स्टॉक से, लकीर वांछित एस| Typhimurium उपभेदों कि प्रत्येक LB agar प्लेटों पर एक अद्वितीय डीएनए बारकोड बंदरगाह. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट प्लेटें।
- प्रत्येक तनाव से एक एकल कॉलोनी का चयन करें और एलबी शोरबा के 5 एमएल टीका। लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 एच के लिए इनक्यूबेट।
नोट: रात भर की संस्कृति का उपयोग करना, कदम 3.5 करने के लिए प्रत्येक बारकोड तनाव से शुद्ध जीनोमिक डीएनए (gDNA) इकट्ठा करने के लिए आगे बढ़ें. यह अनुभाग 6 में अनुवर्ती मान्यता और नियंत्रण प्रयोगों के लिए आवश्यक है। - प्रत्येक प्रतियोगिता परख के लिए, एक उचित आकार बाँझ ट्यूब में प्रत्येक रात संस्कृति के एक समान मात्रा हस्तांतरण. अच्छी तरह से कम से कम 5 s के लिए तेजी से भंवर द्वारा एक साथ उपभेदों मिश्रण.
नोट: प्रत्येक रात भर संस्कृति की मात्रा हस्तांतरण करने के लिए प्रत्येक शर्त और दोहराने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, साथ ही इनपुट मात्रा निर्धारित करने के लिए gDNA अलग करने के लिए. हालांकि यह पूरी तरह से संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए आवश्यक नहीं है क्योंकि इनपुट सूक्ष्मजीवों की पूर्ण संख्या डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जाएगा, प्रत्येक तनाव के लिए इनपुट बैक्टीरिया की संख्या लगभग बाधाओं से बचने के लिए बराबर होना चाहिए या प्रयोग के प्रारंभ में असमान प्रतिस्पर्धा। प्रतिनिधि प्रतियोगिता इस प्रोटोकॉल में assays 8 उपभेदों की वृद्धि दर एक साथ तुलना में. अतिरिक्त या कम उपभेदों व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आवश्यक हो सकता है. - मिश्रित इनोकुलम के 100 डिग्री सेल्सियस को 4.9 एमएल बाँझ एलबी शोरबा में स्थानांतरित करें। वांछित समय के लिए या एक वांछित ऑप्टिकल घनत्व के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा इनोकुलम की फसल 500 $L निकालें और सुपरनेंट को त्याग दें। कोशिकाओं के साथ अनुभाग 4 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
- वांछित समय बिंदुओं पर, 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर centrifugation द्वारा संस्कृति और फसल कोशिकाओं के 500 $L alicots निकालें. निकालें और supernatant त्यागें.
नोट: यदि एकाधिक timepoints पर alicots इकट्ठा, -20 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों फ्रीज या तुरंत प्रत्येक संग्रह के बाद 4.1 कदम के लिए आगे बढ़ना.
4. एस से इकट्ठा करने और परिमाणात्मक gDNA | Typhimurium (चरण 3.5 और 3.6 से)
- एक वाणिज्यिक gDNA शुद्धि किट का उपयोग कर कोशिकाओं से हार्वेस्ट gDNA. यदि उपलब्ध हो, तो वैकल्पिक आरएनए अवक्षय चरण निष्पादित करें।
नोट: आरएनए कमी आवश्यक नहीं है; हालांकि, आरएनए की उपस्थिति कृत्रिम रूप से डीएनए एकाग्रता में वृद्धि होगी, बाद के चरणों में aberant गणना करने के लिए अग्रणी. यदि एक वाणिज्यिक gDNA शुद्धि किट का उपयोग कर, स्तंभ डीएनए के साथ अधिभारित नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें. नमूना बाद के चरणों में परिमाणात्मक है, तो कोई न्यूनतम डीएनए एकाग्रता की आवश्यकता है. - प्रत्येक नमूने में डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें.
नोट: डीएनए किसी भी विश्वसनीय विधि का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. - निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करते हुए जीवाणु जीनोम आकार के आधार पर gDNA प्रतिलिपि संख्या की गणना करें जहां: ग् एनजी में डीएनए की मात्रा है और छ एक डबल-स्ट्रेंड डीएनए अणु (जीनोम आकार) की लंबाई है।
नोट: 660 g/mole 1 डीएनए बीपी के औसत द्रव्यमान के रूप में प्रयोग किया जाता है। जीव के न्यूक्लिओटाइड संघटन के आधार पर छोटी भिन्नताएं मौजूद हो सकती हैं। कई calculators गणना करने के लिए ऑनलाइन उपलब्ध हैं.
5. डिजाइन प्राइमर और dDigital पीसीआर के माध्यम से डीएनए बारकोड की मात्रात्मक जांच के लिए जांच
- एसके बारकोड क्षेत्र बढ़ाना करने के लिए प्राइमर डिजाइन करें। त्यम्मरियम गुणसूत्र पुटपी के नीचे की ओर (चित्र 3ै तथा सारणी 2)।
नोट: प्राइमर और जांच डिजाइन कई ऑनलाइन कार्यक्रमों (सामग्री की तालिका) द्वारा सुविधा प्रदान की जा सकती है। यदि सभी बारकोड एक ही loci पर डाला जाता है, प्रवर्धन प्राइमर का एक एकल सेट सभी बारकोड के लिए सार्वभौमिक है। - डिजाइन 6-कार्बोक्सीफ्लुओरेसिन (FAM)-आधारित और/या हेक्साक्लोरोफ्लोरेसिन (HEX) आधारित प्रत्येक बारकोड के लिए विशिष्ट जांच (तालिका2 और S1)।
नोट: इस प्रयोग में प्रयुक्त छोटी-छोटी पाठक मल्टीप्लेक्स अभिक्रिया में एक साथ FAM- और HEX-आधारित जांच दोनों का पता लगाने में सक्षम है। एचईएक्स का उपयोग करने के लिए FAM और 1/2 का उपयोग करने के लिए जांच के 1/ यह एक आवश्यक कदम नहीं है, लेकिन अगर लागू अभिकर्मक उपयोग और प्रयोगात्मक लागत कम हो जाएगा. - 20x प्राइमर-प्रोब मास्टर घोला जा सकता है युक्त 1) प्रत्येक आगे और रिवर्स प्रवर्धन प्राइमर के 20 एमएम, 2) एक भी FAM जांच के 10 mM, और 3) एक ही एचईएक्स जांच के 10 m (यदि मल्टीप्लेक्सिंग).
6. प्रत्येक जीनोमिक बारकोड डिजिटल पीसीआर का उपयोग करने के लिए प्रत्येक Pprimer-प्रोब सेट की संवेदनशीलता और विशिष्टता को मान्य करें
नोट: इस प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में आठ अद्वितीय जांच के साथ आठ अद्वितीय बारकोड मान्य का उपयोग करता है. उपयोग किए गए बारकोड की संख्या को विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइनों को समायोजित करने के लिए बढ़ाया या कम किया जा सकता है।
- एक के अलावा हर बारकोड शामिल है कि gDNA का एक पूल बनाएँ. एक शेष बारकोड युक्त gDNA के साथ एक कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रदर्शन करने के लिए diluent के रूप में इस पूल का प्रयोग करें (नमूना कमजोर पड़ने योजना चित्र 4में प्रदान की जाती है )।
नोट: एक diluent के रूप में जमा gDNA का उपयोग संवेदनशीलता का पता लगाने जबकि एक सुसंगत पृष्ठभूमि सुनिश्चित करता है. चरण 4.3 में निर्धारित प्रतिलिपि संख्याओं का उपयोग करके, gDNA को अनुशंसित डिजिटल PCR श्रेणी (1-100,000 प्रति 20 डिग्री सेल्सियस अभिक्रिया) के भीतर प्रतिलिपि संख्या को पतला कर देता है. ध्यान रखें कि श्रेणी प्रत्येक अद्वितीय लक्ष्य (बारकोड) के लिए सेट की गई है, न कि कुल gDNA. - जांच आधारित रसायन विज्ञान के लिए डिजाइन एक डिजिटल पीसीआर supermix का उपयोग करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार डुप्लिकेट में डिजिटल पीसीआर के लिए प्रतिक्रियाओं को तैयार करें। टेम्पलेट डीएनए के रूप में चरण 6.1 से मिश्रण का उपयोग करें. चरण 5.3 से 20x प्राइमर-प्रोब मास्टर मिश्रण का उपयोग करें जिसमें चरण 6.1 में पतला बारकोड के लिए जांच शामिल है।
- जांच आधारित रसायन विज्ञान के लिए डिजाइन एक डिजिटल पीसीआर supermix का उपयोग करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार डिजिटल पीसीआर के लिए नियंत्रण प्रतिक्रियाओं को दोहराने तैयार करें। प्रत्येक जाँच मिश्रण के लिए नियंत्रण प्रतिक्रियाओं में 1) कोई टेम्पलेट नियंत्रण (NTCs), 2) ऋणात्मक नियंत्रण, और 3) धनात्मक नियंत्रण शामिल नहीं होने चाहिए.
नोट: प्रतिकृति नियंत्रण प्रतिक्रियाओं की न्यूनतम संख्या दो है. इस उदाहरण प्रोटोकॉल चार NTCs, छह नकारात्मक नियंत्रण, और प्रत्येक बारकोड के लिए छह धनात्मक नियंत्रण का उपयोग करता है। नकारात्मक नियंत्रण परीक्षण किया जा रहा जांच करने के लिए इसी बारकोड को छोड़कर प्रत्येक बारकोड के साथ gDNA शामिल होना चाहिए. यह प्रत्येक जांच की विशिष्टता को मान्य करेगा। - प्रत्येक बारकोड किए गए gDNA नमूने के लिए डिजिटल PCR प्रतिक्रियाएँ बनाने के लिए चरण 6-1-6.3 दोहराएँ. चित्र 5में एक नमूना प्लेट व्यवस्था प्रस्तुत की गई है।
नोट: यह और बाद के कदम एक विशिष्ट डिजिटल पीसीआर मंच है कि बूंदों और प्रवाह आधारित प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल के आधार पर वर्णित हैं. चिप आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करने वाले वैकल्पिक डिजिटल पीसीआर प्लेटफॉर्म को आसानी से इस प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। चरण 6.4 सभी प्राइमर सेट को मान्य करने के लिए एक से अधिक 96-वेल प्लेट की आवश्यकता हो सकती है। QPCR के विपरीत, अलग प्लेटें डिजिटल पीसीआर द्वारा विश्लेषण आसानी से प्लेटों के बीच मानकीकृत संदर्भ कुओं के लिए आवश्यकता के बिना तुलना की जा सकती है. - निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक बूंद जनरेटर का उपयोग कर प्रत्येक प्रतिक्रिया हालत के लिए बूंदों उत्पन्न करते हैं।
- नई बनाई गई बूंदों को उपयुक्त 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। 5-50 डिग्री मल्टीचैनल पिपेट पर 200 डिग्री एल पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
नोट: जब pipeting बूंदों, पिपेट धीरे धीरे और आसानी से! डिजिटल पीसीआर उपकरण निर्माता एक विशेष निर्माता (जैसे, रैनिन) से केवल पिपेट और पिपेट युक्तियों का उपयोग करने की सिफारिश करता है। इन pipette युक्तियाँ कोई सूक्ष्म प्लास्टिक के टुकड़े है कि बूंदों को नष्ट कर सकते हैं या छोटी बूंद पाठक के microfluidics नुकसान के साथ एक चिकनी खोलने है. सुझावों के कई ब्रांडों की जांच की और विनिर्माण गुणवत्ता के एक स्पेक्ट्रम है मनाया गया. समतुल्य परिणाम pipette टिप विकल्प का उपयोग कर प्राप्त किया गया है; हालांकि, सावधानी का उपयोग किया जाना चाहिए जब निर्माता की सिफारिशों से अलग. - सभी बूंदों उत्पन्न और स्थानांतरित कर दिया गया है के बाद, एक पन्नी प्लेट सील के साथ थाली सील।
- निम्नलिखित साइकिल की स्थिति को निष्पादित करने के लिए निर्माता-अनुशंसित थर्मोसाइकिलर का उपयोग करें: 1) 10 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 2) 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 1 डिग्री सेल्सियस पर सेट रैंप दर; 3) 2 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, रैंप दर 1 डिग्री सेल्सियस पर सेट; 4) दोहराने के कदम 2 और 3 49 बार; 5) 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 6) 24 ज तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
नोट: एक छोटी बूंद प्रतिक्रिया में थर्मल हस्तांतरण मानक पीसीआर के रूप में ही नहीं है। प्रतिक्रिया की स्थिति में संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। - जबकि thermocycling प्रदर्शन किया जा रहा है, इस तरह के नमूना नाम के रूप में प्लेट सेटअप जानकारी के साथ डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर कार्यक्रम, प्रयोग प्रकार (निरपेक्ष परिमाणीकरण), supermix इस्तेमाल किया, लक्ष्य 1 नाम (FAM बारकोड नाम), लक्ष्य 1 प्रकार (NTC, सकारात्मक नियंत्रण, ऋणात्मक नियंत्रण, या अज्ञात), लक्ष्य 2 नाम (HEX बारकोड नाम), लक्ष्य 2 प्रकार (रिक्त, धनात्मक नियंत्रण, ऋणात्मक नियंत्रण, या अज्ञात). अंतिम प्लेट सेटअप जानकारी चित्र 5में दिखाई गई है।
- thermocycling पूरा होने के बाद, छोटी बूंद पाठक के लिए पूरा प्रतिक्रियाओं हस्तांतरण और निर्माता के निर्देशों के अनुसार पढ़ने की प्रक्रिया शुरू करते हैं।
7. एक प्रतियोगी सूचकांक प्रयोग में बैक्टीरिया की संख्या की मात्रा
- पतला gDNA अलग और ऊपर वर्णित के रूप में एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए खंड 4 से मात्रा निर्धारित.
- उपयुक्त supermix का उपयोग करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार डिजिटल पीसीआर के लिए प्रतिक्रियाओं को तैयार करें। टेम्पलेट के रूप में चरण 7.1 से डीएनए का उपयोग करें. प्रयोग में मौजूद संभावित बारकोड के लिए जांच (या दोनों FAM और हेक्स का पता लगाने अगर जांच) शामिल है कि एक 20x प्राइमर-प्रोब मास्टर मिश्रण का प्रयोग करें।
- सभी प्रयोगात्मक डिजाइन में उपयोग बारकोड का पता लगाया जा सकता है जब तक विभिन्न 20x प्राइमर-प्रोब मास्टर घोला जा सकता है का उपयोग कर चरण 7.2 में अतिरिक्त डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार।
- 6.3 में वर्णित प्रत्येक शर्त के लिए नियंत्रण शामिल करें. यह 1) कोई टेम्पलेट नियंत्रण (NTCs), 2) नकारात्मक नियंत्रण, और 3) धनात्मक नियंत्रण शामिल हैं।
- 6.5-6.10 चरणों में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें।
8. डिजिटल पीसीआर डेटा का विश्लेषण और निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या की गणना
- जब सभी कुएँ पढ़ ली गई हों और चलाएँ पूर्ण हो, तो डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके .Qlp डेटा फ़ाइल खोलें.
नोट: यहाँ वर्णित फ़ाइल प्रकार और डेटा विश्लेषण कार्यविधियाँ एक डिजिटल PCR निर्माता के लिए विशिष्ट हैं. वैकल्पिक डिजिटल PCR प्लेटफॉर्म्स का उपयोग करते हैं, तो फ़ाइल प्रकार और डेटा विश्लेषण कार्यविधियाँ उपयोग किए गए प्लेटफ़ॉर्म के लिए विशिष्ट होंगे और निर्माता की अनुशंसा किए गए विनिर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए। - एक ही प्राइमर-प्रोब मास्टर मिश्रण का उपयोग है कि सभी कुओं का चयन करें।
- ड्रॉपलेट टैब पर, प्रत्येक अच्छी तरह से (दोनों सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों) में विश्लेषित बूंदों की संख्या की जांच करें। 10,000 से कम कुल बूंदों है कि किसी भी अच्छी तरह से विश्लेषण से निकालें।
- 1D आयाम टैब पर ले जाएँ और सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के आयाम की जांच. सुनिश्चित करें कि वे दो अलग आबादी शामिल हैं.
- सॉफ्टवेयर के भीतर, दहलीज सुविधा का उपयोग करने के लिए प्रत्येक जांच है कि उपयोग किया गया था के लिए सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच एक कटऑफ बनाने के लिए (चित्र6).
नोट: चरण 5.3 से एक ही प्राइमर-प्रोब मास्टर मिश्रण का उपयोग करने वाले सभी कुओं में एक ही सीमा होनी चाहिए। - एक बार उपयुक्त सीमा सभी कुओं के लिए लागू किया गया है, सॉफ्टवेयर प्रत्येक प्रतिक्रिया में डीएनए प्रतियां की संख्या की गणना करेगा. आगे विश्लेषण की सुविधा के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए डेटा निर्यात करें।
नोट: डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने के लिए एक Poison वितरण करने के लिए फ़िट हैं जो धनात्मक और ऋणात्मक बूंदों की संख्या का उपयोग करता है। - चरण 8.6 से मानों का उपयोग करना, नमूने में प्रत्येक अद्वितीय जीनोमिक बारकोड की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या की गणना करें। ऋणात्मक नियंत्रण अभिक्रियाओं से माध्य मिथ्या धनात्मक दर निर्धारित की जाए तथा इस मान को प्रायोगिक अभिक्रियाओं में प्राप्त मानों से घटाइए। प्रत्येक प्रयोग (तालिका3) की स्थापना करते समय किए गए कमजोर पड़ने के आधार पर आवश्यकतानुसार मानों को गुणा करें।
9. डिजिटल पीसीआर से सीआई या सीओआई की गणना करके किसी जीव के सापेक्ष स्वास्थ्य का निर्धारण करना-आधारित बारकोड्ड ट्रेनों का परिमाणीकरण
- निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग कर एक बारकोड्ड तनाव के सीआई की गणना जहां: एकआउटपुट एक दिए गए समय बिंदु पर बारकोड्ड तनाव का निरपेक्ष परिमाणीकरण है, WTआउटपुट एक ही बारकोड किए गए जंगली-प्रकार बैक्टीरिया का निरपेक्ष परिमाणीकरण है timepoint, एकइनपुट बारकोड्ड तनाव के इनपुट inoculum की पूर्ण परिमाणीकरण है, WTइनपुट बारकोड्ड जंगली प्रकार बैक्टीरिया के इनपुट inoculum की पूर्ण परिमाणीकरण है, एक्सआउटपुट पर सभी उपभेदों का संकलन है एक ही timepoint, एक्सइनपुट सभी बारकोड्ड उपभेदों के कुल इनपुट inoculum का योग है.
नोट: लाभ, नुकसान, और प्रत्येक सूत्र का सबसे उपयुक्त उपयोग के लिए चर्चा देखें।
- सभी समय बिंदु पर प्रत्येक बारकोड किए गए तनाव के लिए चरण 9.1 दोहराएँ.
- यदि लागू हो, तो निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग करके सीओआई की गणना करें जहां:एक आउटपुट एक दिए गए समय बिंदु पर उत्परिवर्तित जीन ए के साथ एक बारकोड्ड तनाव का निरपेक्ष परिमाणीकरण है, एबीआउटपुट एक बारकोडकिए तनाव का निरपेक्ष परिमाणीकरण है उत्परिवर्तित जीन ए और बी के साथ एक ही समय बिंदु पर, एकइनपुट उत्परिवर्तित जीन एके साथ बारकोड्ड तनाव के इनपुट इनोकुलम का निरपेक्ष परिमाणीकरण है, एबीइनपुट इनपुट इनोकुलम का निरपेक्ष परिमाणीकरण है उत्परिवर्तित जीन ए और बीके साथ बारकोड्ड तनाव का , बीआउटपुट एक दिए गए समय बिंदु पर उत्परिवर्तित जीन बी के साथ बारकोड्ड तनाव का निरपेक्ष परिमाणीकरण है, और बीइनपुट इनपुट का निरपेक्ष परिमाणीकरण है उत्परिवर्तित जीन बीके साथ बारकोड्ड तनाव का संरोप
और/या
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Representative Results
इस पद्धति का उपयोग करने की आवश्यकता है कि उचित नियंत्रण प्रतिक्रियाओं संवेदनशीलता और लक्ष्य डीएनए की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक जांच की विशिष्टता को मान्य करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. इस प्रतिनिधि प्रयोग में, हम पहचान के लिए आठ इसी जांच के साथ आठ अद्वितीय डीएनए बारकोड मान्य. सभी आठ जांचों में एनटीसी और नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं (तालिका3) दोनों में झूठी सकारात्मकता की दर कम थी , यहां तक कि अत्यधिक समान डीएनए दृश्यों के बीच भी उनकी विशिष्टता पर प्रकाश डाला गया था। प्रत्येक शर्त की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए, एक अद्वितीय बारकोड युक्त gDNA सात शेष बारकोड दृश्यों में से प्रत्येक युक्त gDNA की एक निरंतर पृष्ठभूमि में क्रमिक पतला किया गया था। ऊपर उल्लिखित दृष्टिकोण के साथ, डिजिटल पीसीआर लगभग 2,000,000 समान डीएनए दृश्यों की पृष्ठभूमि में gDNA की 2 प्रतियां के रूप में कुछ भेद सकता है (तालिका 3)।
संवेदनशीलता और प्रत्येक जांच और डीएनए बारकोड अनुक्रम की विशिष्टता का निर्धारण करने के अलावा, सत्यापन अध्ययन में प्रदर्शन कमजोर पड़ने हमें जिसके परिणामस्वरूप डेटा से एक नकली प्रतिस्पर्धी सूचकांक की गणना करने की अनुमति दी. हालांकि इस प्रयोग के लिए कोई सही इनपुट या आउटपुट नहीं था, डेटा का विश्लेषण किया जा सकता है जैसे कि एक प्रतियोगिता प्रयोग किया गया है। ऐसा करने के लिए, हम एक आउटपुट के रूप में सीरियल कमजोर पड़ने में प्रत्येक मिश्रण पर विचार (एकआउटपुट) पतला बारकोड के लिए, जबकि कुल उत्पादन (Xआउटपुट), इनपुट (एकइनपुट), और कुल इनपुट (Xइनपुट) प्रत्येक तनाव से गणना की है सभी बारकोड शामिल किए गए हैं, जहां सकारात्मक नियंत्रण में परिमाणीकरण। प्रत्येक मिश्रण के लिए कमजोर पड़ने के कारक का उपयोग करते हुए सैद्धांतिक सीआई निर्धारित किया गया था और तालिका 3में बताया गया है। प्रत्येक बारकोड के लिए किया गया था कि कमजोर पड़ने श्रृंखला में से प्रत्येक में, औसत नकली CI प्रत्येक डुप्लिकेट कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए मानक विचलन के साथ रिपोर्ट किया गया है. सभी मामलों में, नकली सीआई कि गणना की गई सैद्धांतिक सीआई के समान है. परिकलित CIs के बहुमत से कम से कम 25% सैद्धांतिक सीआईए से विचलित. कम सैद्धांतिक CIs के मामलों में, परिकलित मान का विचलन 2-गुना से ऊपर था। उदाहरण के लिए, यह 0.000625 की एक सैद्धांतिक CI से 0.001220 की एक परिकलित CI के लिए कोई परिवर्तन का प्रतिनिधित्व किया। इन डेटा पर प्रकाश डाला है कि वर्णित विधि दोनों अत्यधिक सटीक और अत्यधिक सटीक है. उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता, सटीकता, और परिशुद्धता के संयोजन मज़बूती से अन्यथा किसी का ध्यान नहीं जा सकते हैं कि फिटनेस में मतभेद का पता लगाने के लिए इस प्रणाली को सक्षम.
जीनोमिक बारकोड का सही पता लगाया जा सकता है और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि मान्य करने के बाद, हम इन विट्रो प्रतियोगिता प्रयोगों में प्रदर्शन किया (तालिका 4)। पहले प्रतियोगिता प्रयोग आठ जंगली प्रकार एसका उपयोग किया. Typhimurium उपभेदों कि प्रत्येक एक अद्वितीय डीएनए बारकोड निहित. हर तनाव रात भर बड़ा हो गया था, और आठ संस्कृतियों के बराबर मात्रा में एक साथ मिलाया गया. इस मिश्रित इनोकुलम का 100 डिग्री सेल्सियस बाँझ एलबी शोरबा के 4.9 एमएल टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था और परिणामस्वरूप संस्कृति लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। प्रत्येक तनाव की सटीक इनपुट की गणना करने के लिए इनोकुलम से gDNA काटा गया था। 600 एनएम (ओडी600) पर अवशोषण को मापने के द्वारा संस्कृति के विकास की निगरानी की गई थी। OD600 में $ 0.5 (लघुगणकीय चरण), एक नमूना प्रत्येक संस्कृति से एकत्र किया गया था और gDNA काटा गया था. शेष संस्कृति को लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस कर दिया गया था जब तक 8 घंटे के बाद टीका जब एक अंतिम नमूना एकत्र किया गया था और gDNA काटा (स्थिर). परिणाम जमा संक्रमण के लिए संशोधित CI सूत्र का उपयोग कर गणना की गई. जैसा कि अपेक्षित था, सभी जंगली-प्रकार के उपभेदों में सीआई मान लगभग 1 (सारणी 4) के बराबर थे। इसी प्रकार की प्रतियोगिता का प्रयोग आठ उत्परिवर्ती एस. Typhimurium उपभेदों कि प्रत्येक एक एकल के अलावा अद्वितीय बारकोड था, डबल, या ट्रिपल-transketolase कमी18. जैसा कि पहले दिखाया गया है, सभी उपभेदों LB शोरबा में इसी तरह बढ़ी, केवल एक मामूली अंतराल ट्रिपल-transketolase कमी तनाव में मनाया के साथ. हालांकि, जब प्रत्येक तनाव के विकास सीआई का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया गया था, एक बहुत अधिक गहरा दोष transketolase कमी तनाव के लिए मनाया गया था (सीआई शॉ एट अल में विकास घटता की तुलना में किया गया था.18). इसके अलावा, इस प्रयोग ने हमें केवल गुणात्मक वृद्धि पैटर्न का वर्णन करने के बजाय प्रत्येक तनाव की वृद्धि विशेषताओं के लिए एक परिमाणात्मक मूल्य आवंटित करने की अनुमति दी। प्रत्येक तनाव के लिए CIs दोनों पारंपरिक सूत्र जहां प्रत्येक तनाव केवल जंगली प्रकार और संशोधित सूत्र जहां सभी इनपुट उपभेदों पर विचार किया गया था की तुलना में किया गया का उपयोग कर गणना की गई. जबकि परिवर्तन छोटे थे, ट्रिपल-transketolase कमी तनाव के सीआई कृत्रिम रूप से पारंपरिक सूत्र में कम था क्योंकि यह अन्य छह प्रतिस्पर्धा उपभेदों है कि सभी के पास प्रदर्शित के लिए खाता नहीं है-जंगली प्रकार फिटनेस.
उपभेदों | जीनोटाइप | स्रोत या संदर्भ |
एस टायफिमुरियम एटीसीसी 14028s | जंगली प्ररूप | एटीसीसी |
टीटी22236 | LT2 साल्मोनेला ले जाने pTP2223 | (27) |
डीएच 5 ] | F- [ 80लाख] M15 ] (लाख[YA-argF) U169 recA1 अंतA1 hsdR17 (rK-, mK+) phoA supE44 ]- thi-1 gyrA96 relA1 | (28) |
जेएएस18077 | putP::ए.ए.:एफआरटी | यह अध्ययन |
जेएएस18080 | putP::AD::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18083 | putP::एजी::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18088 | putP::AL::एफआरटी | यह अध्ययन |
जेएएस18091 | putP::एओ::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18096 | putP::एटी::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18099 | putP::AW::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18100 | putP::AX::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18122 | $tktA::FRT putP::AD::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18130 | $tktB::FRT putP::AL::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18138 | $tktC::FRT putP::AT::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18125 | ]tktA::FRT ]tktB::FRT putP::AG::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18133 | $tktA::FRT ]tktC::FRT putP::AO::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18141 | $tktB::FRT ]tktC::FRT putP::AW::FRT | यह अध्ययन |
जेएएस18142 | ]tktA::FRT ]tktB::FRT ]tktC::FRT putP::AX::FRT | यह अध्ययन |
Plasmids | ||
pKD13 | ब्ला FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K | (14) |
पीपीसीआर स्क्रिप्ट कैम एसके + | ColE1 ori; सीएमआर | स्ट्रैटजीन/ |
पीटीपी2223 | Plac लाम शर्त एक्सो टीईटीआर | (16) |
पीसीपी 20 | ब्ला बिल्ली cI857 पीआरflp pSC101 oriTS | (29) |
पी एस केएपी | ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी | यह अध्ययन |
पी एस केएपीजेडएए | ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; ए.ए. | यह अध्ययन |
पी.एस.के.पी.ए.डी. | ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; ई. | यह अध्ययन |
पी.एस.के.पी.ए.जी. | ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; एजी | यह अध्ययन |
पी.एस.के.पी.ए.एल. | ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; अल | यह अध्ययन |
पी.एस.के.पी.ए.ओ. | ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; एओ | यह अध्ययन |
पी.एस.के.पी.टी. | ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; पर | यह अध्ययन |
पी.एस.के.पी.ए.डब्ल्यू. | ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; ए डब्ल्यू | यह अध्ययन |
पी.एस.के.पी.ए.सी. | ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; कुल्हाड़ी | यह अध्ययन |
तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त तनाव और प्लाज्मिड।
नाम | अनुक्रम (5' - 3')1,2,3 |
pSKAP एसडीएम ए.ए. - एफ | AGAAGTCCTGCTGGTGCTTGAGT CGATTGTGATGGAGC |
pSKAP एसडीएम ए.ए. - आर | ACTCAAGCACCAGGAGACTCT CTCAAGACGGtAATGCTG |
पी.एस.के.पी. एसडीएम ई.- एफ. | AAGAGCACGGTGAGTAGTAGG CGATTGTGATGGAGC |
पी.एस.के.पी. एसडीएम ई. - आर. | सीसीटीसीटीसीसीसीटीसीसीटीटीटी CTCAAGACGGtAATGCTG |
pSKAP एसडीएम एजी - एफ | AGTAGTGTCCTGAGGAGCATGTGA CGATTGTGATGGAGC |
pSKAP एसडीएम एजी - आर | टीसीसीएटीजीसीसीएजीएसीएक्ट CTCAAGACGGtAATGCTG |
पी.एस.के.पी. एसडीएम अल - एफ | ACCACACTAGCTAGCT CTCAAGACGGtAATGCTG |
पी.एस.के.पी. एसडीएम अल - आर | AGAGCTAGTGCCTTCGATGTGTGGGGt CGATTGTGATGGAGC |
पी.एस.के.पी.एस.पी.एस.ए.एस.पी.एस.ओ. एफ. | जी.टी.सी.सी.ए.सी.ए.सी.ए.सी.ए.सी.ए.सी.ए.टी. CTCAAGACGGtAATGCTG |
पी.एस.के.पी.एस.पी.एस.एस.ए.एस.पी.एस.ओ. | AGTATCACTGAGGTGGTTGGGGGAC CGATTGTGATGGAGC |
पी.एस.के.पी. एसडीएम एटी - एफ | ACCAGTCCGTGACATGGCTAGAC CGATTGTGATGGAGC |
पी.एस.के.पी. एसडीएम एटी - आर | जी.टी.सी.टी.सी.टी.टी.टी.टी.सी.सी.सी.सी.सी.सी.सी.सी.सी.सी. CTCAAGACGGtAATGCTG |
पी.एस.के.पी. एसडीएम एडब्ल्यू - एफ | ACGACTGATGATGTGTGTGACG CGATTGTGATGGAGC |
पी.एस.के.पी. एसडीएम एडब्ल्यू - आर | CGTCACATCCACATCAGTCGT CTCAAGACGGtAATGCTG |
pSKAP एसडीएम कुल्हाड़ी - एफ | ACTATCGTGGGtACGACCGTG CGATTGTGATGGAGC |
pSKAP एसडीएम कुल्हाड़ी - आर | कैगसीटीजीजीटीटीसीकागाटैग CTCAAGACGGtAATGCTG |
M13 - एफ | GTAAACGACGGCA |
पी.टी.पी. पुनर्संयोजन - F |
तगगटगगगगगगगटतत्त्वताता टीजीसीएजीएसीसीटीसीसी |
पी.टी.पी. पुनर्संयोजन - R |
TACTGCGGGTATGCTGAAACATCACATTG सीसीटीव्हीच्या जागा |
क्यूपीसीआर बारकोड क्षेत्र बढ़ाना - F1 | TGCAGCATTACACCTTG |
क्यूपीसीआर बारकोड क्षेत्र बढ़ाना - R2 | TAGGAACTTCGAAGC |
बारकोड ए.ए. जांच - FAM | 6-FAM/AGAAGTC/जेन/CTGCTGGTGCTTGAGTC/IBFQ |
बारकोड ई. जांच - FAM | 6-FAM/AAGAGCACG/जेन/GTGAGGTTAGTAGGC/IBFQ |
बारकोड एजी जांच - FAM | 6-FAM/AGTAGTGTC/जेन/CTGGAGCATGTGAC/IBFQ |
बारकोड अल जांच - FAM | 6-FAM/AGAGCTAGT/जेन/GCCTTCGATGTGTGGTC/IBFQ |
बारकोड एओ जांच - हेक्स | HEX/AGTATCACT/जेन/GAGTGTGGGTGGGACC/IBFQ |
जांच में बारकोड - हेक्स | HEX/ACCAGTGTC/जेन/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ |
बारकोड AW जांच - हेक्स | HEX/ACGACTGAG/जेन/TGATGTGTGACGC/IBFQ |
बारकोड कुल्हाड़ी जांच - हेक्स | HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACCGGC/IBFQ |
1 रेखांकित न्यूक्लिओटाइड एसडीएम के बाद pSKAP पर डाला जाता है कि प्रत्येक डीएनए बारकोड के लिए पूरक दृश्यों से संकेत मिलता है। २ द्वि-रेखांकित न्यूक्लिओटाइड एसपर एक पूरक क्षेत्र का संकेत देते हैं . टायफिमरियम गुणसूत्र का उपयोग एलाइजा प्रतिस्थापन के लिए किया जाता है। 3 प्राइमटाइम क्यूपीसीआर जांच एक 5' फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल संकरीकरण ओलिगो हैं, या तो 6-carboxyfluorescein (6-FAM) या हेक्साक्लोरोफ्लोरेसिन (HEX), एक आंतरिक क्वेश्चर (जेन), और 3' क्वान्सर आयोवा ब्लैक® FQ (IBFQ). |
तालिका 2: इस अध्ययन में इस्तेमाल किया प्राइमर और जांच.
परिमाणीकरण (कॉपी/ | ||||||||
विवरण | Aa | विज्ञापन | एजी | अल | Ao | पर | ऐडवर्ड्स | Ax |
एनटीसी | एन/ए | 0.000 | 0.000 | 3.510 | एन/ए | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
एनटीसी | 3.600 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
एनटीसी | 3.510 | 0.000 | 1.280 | 1.180 | 2.340 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
एनटीसी | 2.290 | 0.000 | 0.000 | १.२०० | १.१.१० | 1.160 | 0.000 | 0.000 |
मतलब | 3.133 | 0.000 | 0.320 | 1.473 | 1.163 | 0.290 | 0.000 | 0.000 |
नकारात्मक | 5.130 | 1.156 | 0.000 | 1.124 | 3.745 | १.२९१ | 7.354 | 7.142 |
नकारात्मक | 5.270 | 0.000 | 0.000 | 1.087 | 1.666 | 1.643 | 7.746 | 2.269 |
नकारात्मक | 2.660 | 0.000 | 1.361 | 1.451 | 8.974 | 0.000 | एन/ए | 0.000 |
नकारात्मक | 6.090 | 0.000 | 0.000 | 2.251 | 0.000 | 2.531 | 8.700 | 3.495 |
नकारात्मक | 1.740 | 0.000 | 1.086 | 2.130 | 4-171 | 0.000 | 7.113 | 5.522 |
नकारात्मक | 6.220 | 3.581 | 0.000 | 4.022 | 1.175 | 1.341 | एन/ए | 5.950 |
मतलब | 4.518 | 0.789 | 0.408 | २.०११ | 3.288 | 1.133 | 7.728 | 4.063 |
सकारात्मक | 22281.540 | 42673.039 | 46442.242 | 45359.180 | 47885.625 | 15708.027 | 45325.906 | 20810.559 |
सकारात्मक | 23989.676 | 44625.523 | 47356.438 | 45790.660 | 47456.973 | 15096.601 | 47929.840 | 22455.234 |
सकारात्मक | 17846.824 | 38980.133 | 45633.809 | 44174.820 | 33875.039 | 15156.063 | 42536.270 | 21467.840 |
सकारात्मक | 21047.588 | 40140.848 | 41672.648 | 46028.496 | 47426.527 | 16718.000 | 46978.664 | 19876.473 |
सकारात्मक | 20218.238 | 44660.602 | 41718.707 | 45799.375 | 46495.602 | 14590.264 | 54741.023 | 22011.938 |
सकारात्मक | 18531.740 | 41620.801 | एन/ए | 48082.313 | 35645.199 | 15341.382 | 48950.992 | 21117.559 |
मतलब | 20652.601 | 42116.824 | 44564.769 | 45872.474 | 43130.827 | 15435.056 | 47743.783 | 21289.934 |
रिक्त घटाव | 20648.083 | 42116.035 | 44564.361 | 45870.463 | 43127.539 | 15433.923 | 47736.054 | 21285.871 |
Undiluted एक | 23024.961 | 44448.875 | 58897.510 | 51120.948 | 55450.191 | 18155.305 | 62844.068 | 27567.828 |
Undiluted बी | 18278.174 | 35252.586 | 54409.510 | 66022.396 | 43101.148 | 15732.609 | 60761.328 | 26581.979 |
1/50 ए | 521.670 | 755.035 | 1066.898 | 1287.187 | 1053.339 | 181.324 | 1278.336 | 580.961 |
1/50 बी | 435.326 | 634.215 | 1168.087 | 1383.537 | 991.040 | 165.443 | 1180.445 | 596.461 |
1/100 ए | 228.028 | 598.848 | 603.911 | 631.116 | 507.956 | 258.405 | 665.647 | 331.590 |
1/100 बी | 256.330 | 585.834 | 583.325 | 670.875 | 459.325 | 289.207 | 638.916 | 307.948 |
1/200 ए | 121.283 | 305.293 | 258.247 | 346.965 | 234.774 | 114.163 | 169.055 | 172.553 |
1/200 बी | 114.638 | 313.040 | 253.685 | 297.216 | 191.637 | 179.895 | 280.989 | 147.297 |
1/400 ए | 42.829 | 141.343 | 127.337 | 163.605 | एन/ए | 71.241 | 157.697 | 85.976 |
1/400 बी | 59.544 | 180.543 | 162.080 | 162.108 | 115.508 | 104.682 | 151.141 | 87.804 |
1/800 ए | 34.304 | 67.934 | 65.939 | 83.857 | 66.134 | 31.784 | 82.722 | 45.616 |
1/800 बी | 20.390 | 80.222 | 81.453 | 85.325 | 53.102 | 38.034 | 55.460 | 29.660 |
1/1600 ए | 15.405 | 44.505 | 47.672 | 39.613 | 33.027 | 18.006 | 37.655 | 20.988 |
1/1600 बी | 22.091 | 48.828 | 46.781 | 37.388 | 30.245 | 30.138 | 34.553 | 19.795 |
1/3200 ए | 12.333 | 22.104 | 16.850 | 18.403 | 11.460 | 10.535 | 21.245 | 9.218 |
1/3200 बी | 6.796 | 32.555 | 15.742 | 26.249 | 15.111 | 9.908 | 23.393 | 10.175 |
रिक्त घटाव | ||||||||
Undiluted एक | 23020.443 | 44448.086 | 58897.103 | 51118.937 | 55446.903 | 18154.172 | 62836.339 | 27563.765 |
Undiluted बी | 18273.655 | 35251.797 | 54409.103 | 66020.385 | 43097.860 | 15731.477 | 60753.600 | 26577.916 |
1/50 ए | 517.152 | 754.246 | 1066.490 | 1285.176 | 1050.051 | 180.192 | 1270.607 | 576.898 |
1/50 बी | 430.808 | 633.426 | 1167.679 | 1381.526 | 987.751 | 164.311 | 1172.717 | 592.398 |
1/100 ए | 223.509 | 598.059 | 603.503 | 629.105 | 504.668 | 257.272 | 657.918 | 327.527 |
1/100 बी | 251.812 | 585.044 | 582.918 | 668.864 | 456.036 | 288.074 | 631.187 | 303.885 |
1/200 ए | 116.765 | 304.503 | 257.840 | 344.954 | 231.486 | 113.030 | 161.327 | 168.490 |
1/200 बी | 110.120 | 312.251 | 253.277 | 295.205 | 188.348 | 178.762 | 273.261 | 143.234 |
1/400 ए | 38.310 | 140.554 | 126.929 | 161.594 | एन/ए | 70.108 | 149.968 | 81.913 |
1/400 बी | 55.026 | 179.753 | 161.672 | 160.097 | 112.219 | 103.549 | 143.413 | 83.741 |
1/800 ए | 29.786 | 67.145 | 65.531 | 81.847 | 62.846 | 30.651 | 74.994 | 41.553 |
1/800 बी | 15.872 | 79.433 | 81.045 | 83.314 | 49.813 | 36.901 | 47.732 | 25.596 |
1/1600 ए | 10.886 | 43.716 | 47.264 | 37.602 | 29.739 | 16.874 | 29.927 | 16.925 |
1/1600 बी | 17.573 | 48.039 | 46.373 | 35.377 | 26.957 | 29.005 | 26.825 | 15.732 |
1/3200 ए | 7.815 | 21.314 | 16.442 | 16.392 | 8.172 | 9.402 | 13.517 | 5.155 |
1/3200 बी | 2.278 | 31.765 | 15.334 | 24.238 | 11.822 | 8.776 | 15.664 | 6.112 |
नकली सीआई | ||||||||
Undiluted एक | 1.114895 | 1.055372 | 1.321619 | 1.114419 | 1.285650 | 1.176251 | 1.316329 | 1.294932 |
Undiluted बी | 0.885005 | 0.837016 | १.२२०९११ | 1.439279 | 0.999312 | 1.019279 | 1.272698 | 1.248618 |
1/50 ए | 0.025046 | 0.017909 | 0.023931 | 0.028018 | 0.024348 | 0.011675 | 0.026617 | 0.027102 |
1/50 बी | 0.020864 | 0.015040 | 0.026202 | 0.030118 | 0.022903 | 0.010646 | 0.024567 | 0.027831 |
1/100 ए | 0.010825 | 0.014200 | 0.013542 | 0.013715 | 0.011702 | 0.016669 | 0.013782 | 0.015387 |
1/100 बी | 0.012195 | 0.013891 | 0.013080 | 0.014582 | 0.010574 | 0.018665 | 0.013222 | 0.014276 |
1/200 ए | 0.005655 | 0.007230 | 0.005786 | 0.007520 | 0.005367 | 0.007323 | 0.003380 | 0.007916 |
1/200 बी | 0.005333 | 0.007414 | 0.005683 | 0.006436 | 0.004367 | 0.011582 | 0.005724 | 0.006729 |
1/400 ए | 0.001855 | 0.003337 | 0.002848 | 0.003523 | एन/ए | 0.004542 | 0.003142 | 0.003848 |
1/400 बी | 0.002665 | 0.004268 | 0.003628 | 0.003490 | 0.002602 | 0.006709 | 0.003004 | 0.003934 |
1/800 ए | 0.001443 | 0.001594 | 0.001470 | 0.001784 | 0.001457 | 0.001986 | 0.001571 | 0.001952 |
1/800 बी | 0.000769 | 0.001886 | 0.001819 | 0.001816 | 0.001155 | 0.002391 | 0.001000 | 0.001203 |
1/1,600 ए | 0.000527 | 0.001038 | 0.001061 | 0.000820 | 0.000690 | 0.001093 | 0.000627 | 0.000795 |
1/1,600 बी | 0.000851 | 0.001141 | 0.001041 | 0.000771 | 0.000625 | 0.001879 | 0.000562 | 0.000739 |
1/3,200 ए | 0.000378 | 0.000506 | 0.000369 | 0.000357 | 0.000189 | 0.000609 | 0.000283 | 0.000242 |
1/3,200 बी | 0.000110 | 0.000754 | 0.000344 | 0.000528 | 0.000274 | 0.000569 | 0.000328 | 0.000287 |
औसत सीआई (सैद्धांतिक) | ||||||||
अविचलित (1) | 0.999950 | 0.946194 | 1.271265 | 1.276849 | 1.142481 | 1.097765 | 1.294514 | 1.271775 |
1/50 (0.02) | 0.022955 | 0.016474 | 0.025067 | 0.029068 | 0.023625 | 0.011161 | 0.025592 | 0.027466 |
1/100 (0.01) | 0.011510 | 0.014046 | 0.013311 | 0.014148 | 0.011138 | 0.017667 | 0.013502 | 0.014832 |
1/00 (0.005) | 0.005494 | 0.007322 | 0.005735 | 0.006978 | 0.004867 | 0.009453 | 0.004552 | 0.007322 |
1/400 (0.0025) | 0.002260 | 0.003803 | 0.003238 | 0.003507 | 0.00260* | 0.005626 | 0.003073 | 0.003891 |
1/800 (0.00125) | 0.001106 | 0.001740 | 0.001645 | 0.001800 | 0.001306 | 0.002188 | 0.001285 | 0.001577 |
1/1,600 (0.000625) | 0.000689 | 0.001089 | 0.001051 | 0.000795 | 0.000657 | 0.001486 | 0.000594 | 0.000767 |
1/3,200 (0.000313) | 0.000244 | 0.000630 | 0.000357 | 0.000443 | 0.000232 | 0.000589 | 0.000306 | 0.000265 |
मानक विचलन | ||||||||
Undiluted | 0.11494 | 0.10918 | 0.05035 | 0.16243 | 0.14317 | 0.07849 | 0.02182 | 0.02316 |
1/50 | 0.00209 | 0.00143 | 0.00114 | 0.00105 | 0.00072 | 0.00051 | 0.00103 | 0.00036 |
1/100 | 0.00069 | 0.00015 | 0.00023 | 0.00043 | 0.00056 | 0.00100 | 0.00028 | 0.00056 |
1/200 | 0.00016 | 0.00009 | 0.00005 | 0.00054 | 0.00050 | 0.00213 | 0.00117 | 0.00059 |
1/400 | 0.00040 | 0.00047 | 0.00039 | 0.00002 | 0* | 0.00108 | 0.00007 | 0.00004 |
1/800 | 0.00034 | 0.00015 | 0.00017 | 0.00002 | 0.00015 | 0.00020 | 0.00029 | 0.00037 |
1/1,600 | 0.00016 | 0.00005 | 0.00001 | 0.00002 | 0.00003 | 0.00039 | 0.00003 | 0.00003 |
1/3,200 | 0.00013 | 0.00012 | 0.00001 | 0.00009 | 0.00004 | 0.00002 | 0.00002 | 0.00002 |
* एक ही प्रयोग से परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है. |
तालिका 3: निरपेक्ष परिमाणीकरण और नकली सीआई गणना।
हालत | प्रतियोगी सूचकांक1 | |||||||
प्रयोग 1 | ||||||||
डब्ल्यूटीए.ए. | डब्ल्यूटीई. | डब्ल्यूटीएजी | डब्ल्यूटीअल | डब्ल्यूटीएओ | डब्ल्यूटीएटी | डब्ल्यूटीएडब्ल्यू | डब्ल्यूटीएएक्स | |
लघुगणकीय | 0.927 ] 0.033 | 0.992 ] 0.031 | १.०९०९२२२ | 0.921 ] 0.02 | १.०९०९२२a 0.03 | १.०९१ ] 0.057 | १.०९०२२२२ | 0.929 $ 0.005 |
स्थिर | १.१] 0.021 | १.०९१] 0.053 | १.०९०९२२a 0.065 | 0.948 ] 0.02 | 0.98 ] 0.02 | 0.873 ] 0.044 | 0.97 ] 0.056 | १.०२१ ] 0.007 |
प्रयोग 2 | ||||||||
सीआई (पारंपरिक) | डब्ल्यूटीए.ए. | $AAD | $BAL | $CAT | $ABएजी | $ACAO | $BCAW | $एबीसीकुल्हाड़ी |
लघुगणकीय | 1 ] 0 | 0.802 ] 0.084 | 0.957 ] 0.02 | 0.989 ] 0.073 | 0.581 ] 0.153 | 0.86 ] 0.053 | 0.995 ] 0.011 | 0.695 ] 0.061 |
स्थिर | 1 ] 0 | 0.97 ] 0.063 | १.०९०९२a 0.058 | 0.99 $ 0.036 | 1.625 ] 0.589 | 0.835 ] 0.051 | 0.912 ] 0.047 | 0.477 ] 0.049 |
सीआई (पूल्ड इनोकुलम) | ||||||||
लघुगणकीय | १.१.१९९ ] 0.039 | 0.864 ] 0.074 | १.०९०९२२ | १.१ ] 0.068 | 0.633 ] 0.152 | 0.938 ] 0.056 | १.१.१११ ] 0.043 | 0.746 ] 0.06 |
स्थिर | १.०९०९२२a 0.039 | १.०९०९२२a 0.049 | १.१.१९९९ ] 0.093 | १.०९०९२२a 0.01 | 1.735 ] 0.613 | 0.876 ] 0.035 | 0.97 ] 0.045 | 0.49 ] 0.047 |
1 मान तीन या चार प्रतिकृति प्रयोगों के लिए CI - मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। |
तालिका 4: एसके बीच इन विट्रो प्रतियोगिता में प्रतिनिधि परिणाम| Typhimurium उपभेदों.
तालिका S1. उनके पता लगाने के लिए अतिरिक्त बारकोड दृश्यों और इसी फ्लोरोसेंट जांच बनाने के लिए वैकल्पिक प्राइमर. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
चित्र 1. pSKAP का उत्पादन. (ए) शुद्ध pKD13 हिंडIII और BamHI के साथ प्रतिबंध पाचन के अधीन किया गया था. (बी, सी) एक FRT-फ्लैंककिए हुए कानामी प्रतिरोध जीन युक्त ब्याज के 1,333 बीपी टुकड़ा शुद्ध किया गया था. (डी) पीपीसीआर स्क्रिप्ट कैम एसके + को भी हिंडIII और बम्ही के साथ पचाया गया था और पीकेडी13 (बी ) के टुकड़े को उत्पन्न करने के लिए (ई) pSKAP तैयार किया गया था । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: सम्मिलित साइट निर्देशित mutagenesis pSKAP करने के लिए. (क) पीसीआर का उपयोग करते हुए स्थिति 725 पर 25 बीपी डीएनए बारकोड का समावेश किया गया था। उस स्थान के लिए विशिष्ट अग्रेषित और रिवर्स प्राइमर को पूरक 25-न्यूक्लिओटाइड 5' एक्सटेंशन के साथ डिजाइन किया गया था (प्राइमर में लोअरकेस "ए") के रूप में निर्दिष्ट किया गया था। (बी) एसडीएम के परिणामस्वरूप एक सामान्य pSKAP]Barcode प्लाज्मिड डाला डीएनए बारकोड पर प्रकाश डाला नारंगी के स्थान के साथ दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: PPके Chromosomal पुनर्व्यवस्थित नीचे | (ए) जेड-रेड मध्यस्थता पुनर्संयोजन के बाद, चुनिंदा कानामाइसिन प्रतिरोध जीन (अंधेरे बैंगनी) एफआरटी साइटों (ग्रे) द्वारा flanked टिसी संकेत (क्रोमोसोमल पुनर्संयोजन साइट, लाल) के बीच गुणसूत्र पर डाला जाता है। अद्वितीय डीएनए बारकोड (नारंगी) बस FRT साइट के बाहर डाला जाता है. (बी) कानामाइसिन प्रतिरोध जीन को एफआरटी-मध्यस्थ चीरा द्वारा हटा दिया जाता है, जिससे गुणसूत्र (कुल सम्मिलित डीएनए, नीला) पर सम्मिलित डीएनए का एक अवशेष छोड़ दिया जाता है जिसमें डीएनए बारकोड और एक एफआरटी निशान होता है। (ग) सम्मिलित किए गए डीएनए के आस-पास संशोधित गुणसूत्र डीएनए अनुक्रम डिजिटल पीसीआर के लिए प्रयुक्त प्रवर्धन प्राइमिंग साइटों (हल्के बैंगनी) के साथ दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: फ्लोरोसेंट जांच संवेदनशीलता और विशिष्टता को मान्य करने के लिए विकास योजना। (ए) सात बारकोड्ड उपभेदों से शुद्ध gDNA को एक साथ बराबर मात्रा में मिलाया जाता है ताकि लोप किए गए बारकोड किए गए gDNA (ऊपर दिए गए उदाहरण में AX) को कम करने के लिए diluent बनाया जा सके. (बी) पहले वर्णित तैयार diluent का उपयोग कर के लोपित बारकोड gDNA (ऊपर उदाहरण में AX) के एक सीरियल कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं। अच्छी तरह से अगले ट्यूब को स्थानांतरित करने से पहले प्रत्येक ट्यूब की सामग्री मिश्रण. चित्र 4 BioRender के साथ बनाया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: संवेदनशीलता और प्राइमर-प्रोब सेट की विशिष्टता का विश्लेषण करने के लिए प्लेट लेआउट 1 और 2 सेट करता है। डिजिटल PCR प्रयोग में NTCs, धनात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण और प्रत्येक परीक्षण किए गए बारकोड के लिए कमजोर पड़ने की योजनाएँ शामिल होती हैं. प्राइमर-प्रोब सेट 3 और 4 को मान्य करने के लिए प्लेट उपयुक्त बारकोड ्ड gDNA का उपयोग करके एक ही पैटर्न में रखी गई है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: पतला ए.ए.-बारकोड gDNA के प्रतिनिधि डिजिटल पीसीआर परिणाम। ए.ए. बारकोड युक्त gDNA अन्य सभी बारकोडgd gDNA की पृष्ठभूमि में पतला किया गया था जैसा कि चित्र 4में वर्णित है . चैनल 1 ए.ए. बारकोड (शीर्ष पैनलों) के लिए FAM जांच का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि चैनल 2 एओ बारकोड (नीचे पैनलों) के लिए हेक्स जांच का प्रतिनिधित्व करता है. प्रत्येक जांच के परिणाम दोनों व्यक्तिगत छोटी बूंद फ्लोरोसेंट आयाम (बाएं पैनलों) और चयनित कुओं (दाएं पैनल) में सभी बूंदों की फ्लोरोसेंट तीव्रता की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व एक हिस्टोग्राम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. प्रत्येक स्थिति के लिए, सकारात्मक (उच्च फ्लोरोसेंट) और नकारात्मक (कम फ्लोरोसेंट) बूंदों दो अलग आबादी फार्म चाहिए. ए.ए. के मामले में है कि पतला था, और सबसे बूंदों नकारात्मक थे, हिस्टोग्राम (ऊपर सही पैनल) केवल एक ही आबादी को दर्शाती प्रतीत होता है. इसका कारण यह है कि सकारात्मक बूंदों काफी नकारात्मक बूंदों से outnumbered हैं; हालांकि, दो अलग आबादी अभी भी बाएँ पैनलों में छोटी बूंद फ्लोरोसेंट आयाम की जांच करके दिखाई दे रहे हैं. सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों को परिभाषित करने के लिए थ्रेशोल्ड सुविधा का उपयोग करके आबादी को अलग किया जाना चाहिए (गुलाबी रेखा द्वारा विज़ुअलाइज़ किया गया).। थ्रेसहोल्ड मूल्यों का इस्तेमाल किया गया था कि जांच के आधार पर अलग अलग होंगे, लेकिन सभी कुओं कि एक ही जांच मिश्रण का उपयोग समान दहलीज होना चाहिए. ए.ए. बारकोड gDNA पतला किया गया था के रूप में, सकारात्मक (उच्च फ्लोरोसेंट) बूंदों में कमी है, जबकि सकारात्मक एओ बूंदों की संख्या पृष्ठभूमि में स्थिर रहता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
सूक्ष्मजीवों की सही मात्रा निर्धारित करने की क्षमता सूक्ष्म जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए सर्वोपरि महत्व की है, और एक प्रारंभिक मिश्रित आबादी से अद्वितीय उपभेदों की गणना करने की क्षमता में फिटनेस और उग्र लक्षण का आकलन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण साबित हुआ है बैक्टीरिया. हालांकि, इसे पूरा करने की तकनीक आणविक जीव विज्ञान में आधुनिक विकास के साथ गति में प्रगति नहीं की है. एस सहित कई बैक्टीरिया के गुणसूत्रों को आसानी से संशोधित करने के लिए प्रौद्योगिकी। Typhimurium, लगभग दो दशकों के लिए उपलब्ध किया गया है14,अभी तक इस क्षमता शायद ही कभी अद्वितीय डीएनए दृश्यों के साथ आणविक टैगिंग उपभेदों के लिए उपयोग किया गया है. इन आणविक पहचानकर्ताओं का पता लगाने और परिमाणित करने के लिए सबसे अधिक अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी के साथ मिलकर, जीवाणु गुणसूत्र पर डाला अद्वितीय, न्यूनतम-विघ्नकारी डीएनए बारकोड के आधार पर आसानी से पहचाने जाने योग्य उपभेदों बनाने की क्षमता का शोषण करके ( यानी डिजिटल पीसीआर), हम एक प्रणाली है कि उत्तम संवेदनशीलता प्रदान करता है बनाया है, विशिष्टता, सटीकता, और आसानी से बैक्टीरिया की एक विविध आबादी के भीतर व्यक्तिगत उपभेदों परिमाणित करने के लिए परिशुद्धता.
ऊपर वर्णित के रूप में CIs और COIs की गणना करने के लिए सही जीवाणु गुणसूत्रों के लिए उपयुक्त संशोधन करने की क्षमता पर निर्भर करता है. सभी संशोधनों कोई यादृच्छिक उत्परिवर्तन हुआ है कि यह सुनिश्चित करने के लिए Sanger अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए. एक उच्च निष्ठा polymerase का उपयोग इन त्रुटियों को कम करेगा, लेकिन किसी भी ऐसे उत्परिवर्तन है कि हो सकता है तनाव का पता लगाने की क्षमता ख़राब होगा, जो इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू है. हालांकि हम प्रदर्शन किया है कि डिजिटल पीसीआर लगभग 2 लाख की पृष्ठभूमि में दो gDNA प्रतियां के रूप में कुछ के रूप में पता लगा सकते हैं, इस सीमा के बाहर उपभेदों उनके सटीक परिमाणीकरण के लिए अतिरिक्त कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, डीएनए बारकोड दृश्यों उच्च गुणवत्ता जांच दृश्यों के उपयोग की सुविधा के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए. जांच दृश्यों स्वयं के लिए प्रवृत्तियों के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए, फार्म hairpins, या अप्रभावी अपने लक्ष्य को बाँध. गुणवत्ता दृश्यों और जांच का उपयोग करने के महत्व minimalized नहीं किया जा सकता है, एक तथ्य यह है कि सावधान सत्यापन प्रयोगों है कि प्रत्येक जांच के साथ किया जाना चाहिए द्वारा सबूत है. इष्टतम डीएनए बारकोड बनाने के प्रयास इष्टतम डिजिटल पीसीआर परिमाणीकरण परिणाम पैदा करेगा।
जबकि ध्यान से डिजाइन आणविक टैग गुणवत्ता परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, परिणामों की व्याख्या इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू है. सीआई को उत्परिवर्ती विकृति और निर्गत में जंगली प्रकार के तनाव के बीच के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है जो इनपुट1,19,20में दो उपभेदों के अनुपात से विभाजित होता है। यह पारंपरिक सीआई अनुभाग 9 में प्रस्तुत उपयोगी है जब मिश्रित संक्रमण जंगली प्रकार बनाम केवल एक तनाव के होते हैं. हालांकि, मीडिया या जानवरों को टीका लगाने के लिए उपभेदों के बड़े पूल का उपयोग करते समय, उपभेदों न केवल जंगली प्रकार के खिलाफ प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं, लेकिन यह भी inoculum में मौजूद हर दूसरे तनाव के खिलाफ. पिछले अध्ययनों में , जो अनेक संक्रमित उपभेदों का प्रयोग करके प्रतिस्पर्धा प्रयोग करते थे , अपनी गणनाओं7,13में इसे ध्यान में रखने में असफल रहे हैं . मिश्रित संक्रमण की इस सुविधा के लिए खाते में, हम जमा संक्रमण के लिए संशोधित किया गया है कि CIs की गणना करने के लिए एक सूत्र पेश किया है। यह संभावना नहीं है कि सभी उपभेदों प्रतियोगिता के एक ही स्तर प्रदान करेगा एक जंगली प्रकार तनाव होगा. हालांकि, क्योंकि ज्यादातर जीवाणु जीन उग्रता पर थोड़ा प्रभाव पड़ता है, प्रतिस्पर्धी सूचकांक प्रयोग में इस्तेमाल उपभेदों की संख्या बढ़ जाती है के रूप में, संभावना है कि समग्र उग्रता जंगली प्रकार तनाव बढ़ जाती है की ओर जाते हैं. यह जरूरी नहीं कि ज्ञात उग्रता दोषों के साथ कई उपभेदों के पूल का उपयोग कर कुछ प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए मामला नहीं हो सकता है। हालांकि, यह संशोधित समीकरण में के लिए जिम्मेदार है क्योंकि परिणाम में कम प्रचुर मात्रा में उपभेदों (कम फिट) एक्सउत्पादनपर एक छोटे प्रभाव पड़ेगा. विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, ऐसे मामले हो सकते हैं जिनमें एक या अन्य सूत्र को प्राथमिकता दी जाती है। ज्यादातर मामलों में पूल्ड संक्रमण से जुड़े, तथापि, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि एक मिश्रित संक्रमण में, सभी उपभेदों एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा, न सिर्फ जंगली प्रकार के खिलाफ. परिणामों का विश्लेषण करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक सूत्र के पीछे तर्क अच्छी तरह से तनाव फिटनेस का सबसे सटीक व्याख्या करने के लिए समझ में आता है. परिणामों की रिपोर्ट करते समय, डेटा का विश्लेषण करने के तरीके का सटीक रूप से खुलासा करना समान रूप से महत्वपूर्ण है.
प्रोटोकॉल की धारा 9 में सीओआई का उपयोग करके जीन इंटरैक्शन निर्धारित करने में मदद करने के लिए सूत्र भी शामिल हैं। इस विश्लेषण के साथ, भविष्यवाणी निर्धारित करने के लिए कि क्या दो उग्र जीन स्वतंत्र रूप से या एक साथ काम किया जा सकता है. सीओआई को इनपुट1में दो उपभेदों के अनुपात से विभाजित आउटपुट में डबल उत्परिवर्ती के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है। सूत्र जीन अवरोधों के phenotypic जोड़िवता का पता लगाने के लिए बनाया गया है. यदि जीन उग्रता को बढ़ाने के लिए स्वतंत्र रूप से कार्य करते हैं, तो दोनों जीनों के विघटन के कारण अकेले किसी भी जीन के एकल व्यवधान की तुलना में फिटनेस में अधिक कमी होनी चाहिए। यदि जीन एक साथ कार्य उग्रता को बढ़ाने के लिए (जैसे जीन एक मार्ग में दो एंजाइमों एन्कोडिंग के रूप में), या तो जीन के विघटन दोनों जीन को बाधित के रूप में उग्रता पर एक ही प्रभाव होना चाहिए. फेनोटाइपिक एडजहांिक की पहचान करना उन मामलों में कठिन हो सकता है जहां एकल जीन के कारण क्षीणन का स्तर या तो बहुत अधिक या बहुत कम होता है। फिर भी, एक ही पशु प्रणाली के भीतर उपभेदों की प्रत्यक्ष तुलना कम परिवर्तनशीलता और जीन के बीच कार्यात्मक संबंध ों का एक अधिक विश्वसनीय खाता प्रदान करता है, और इस गणना एक बड़ा मिश्रित आबादी के भीतर दो उपभेदों से किया जा सकता है.
परिणामों की व्याख्या के लिए एक अंतिम महत्वपूर्ण पहलू जनसंख्या गतिशीलता के प्रभाव पर विचार करने के लिए है. कई उपभेदों है कि कुछ मिश्रित संक्रमण में, एक एकल तनाव यादृच्छिक जनसंख्या बहाव की वजह से या तो अधिक प्रभावी या कम फिट के रूप में उभर सकता है. जब अवरोध की घटनाएं घटित होती हैं तो इस परिघटना को परिलक्षित किया जा सकता है। यह इनपुट उपभेदों की एक बहुत बड़ी संख्या का उपयोग करने से कारण हो सकता है, inoculum में कुल बैक्टीरिया की एक बहुत छोटी संख्या, या दोनों का एक संयोजन. एक और हस्तक्षेप पहलू है कि मिश्रित संक्रमण से उठता है ट्रांस पूरकन की संभावना है. यह तब होता है जब एक फिट तनाव, जैसे जंगली प्रकार, कृत्रिम रूप से एक कम फिट तनाव की उग्रता को बढ़ाता है। इस का एक काल्पनिक उदाहरण के लिए एक एस की फिटनेस की तुलना होगी. Typhimurium रोगजननता द्वीप 2 (SPI2)-knockout तनाव सह एक जंगली प्रकार तनाव के साथ संक्रमित. SPI2 सक्षमबनाता है एस | Typhimurium मेजबान cytosol कि एक मैक्रोफेज के भीतर phagosome संशोधित में प्रभावक स्रावित द्वारा intracellularly जीवित रहने के लिए. इस प्रणाली के विघटन एसबनाता है. टाइफिमुरियम इंट्रासेल्यूलर हत्या के लिए अतिसंवेदनशील। हालांकि, क्योंकि मैक्रोफेज एक बार में दो या दो से अधिक बैक्टीरिया को घेरने में सक्षम हैं, इसलिए SPI2-नॉकआउट फिटनेस में काफी वृद्धि हो सकती है यदि यह एक जंगली प्रकार के एसके रूप में एक ही मैक्रोफेज में रह रहा है। Typhimurium कि मेजबान cytosol में effectors स्रावित कर रहा है. यादृच्छिक जनसंख्या गतिशीलता और ट्रांस पूरकन की संभावना किसी भी प्रतियोगिता प्रयोग की एक सीमा है. यदि ट्रांस पूरकन में संदिग्ध है, phenotypes अन्य पूरक तरीकों का उपयोग कर फिटनेस का आकलन करने की पुष्टि की जानी चाहिए. यादृच्छिक जनसंख्या गतिशीलता पर काबू पाने के लिए, प्रतिकृति प्रयोगों की संख्या में वृद्धि परिणामों में outliers की पहचान करने की संभावना बढ़ जाती है. सौभाग्य से, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल यह आसान समान प्रतिकृति प्रयोगों की एक बड़ी संख्या है क्योंकि प्रयोगात्मक स्थितियों की संख्या काफी कम है बनाता है.
ऊपर वर्णित सीआई तकनीक के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व लगभग किसी भी जीव और किसी भी प्रयोगात्मक डिजाइन है कि सूक्ष्मजीवों की सटीक परिमाणीकरण की आवश्यकता के लिए अनुकूलित करने की क्षमता है। यह करता है, तथापि, गुणसूत्र पर एक अद्वितीय डीएनए अनुक्रम को शामिल करने के लिए एक जीव के आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है. तकनीक की अनुकूलनशीलता के लिए प्रजातियों को आनुवंशिक रूप से आघात करने की आवश्यकता होती है और जीनोम को संशोधित करने के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल की पीढ़ी पर निर्भर करेगा (चरण 1 और 2)। टेबल्स 2 और S1 में सूचीबद्ध डीएनए बारकोड अधिकांश बैक्टीरिया के लिए पर्याप्त होना चाहिए; हालांकि, सभी मात्रात्मक पीसीआर प्रयोगों के रूप में, यह एक साधारण BLAST विश्लेषण द्वारा प्राइमर और जांच के बंद लक्ष्य बाध्यकारी के लिए न्यूनतम क्षमता सुनिश्चित करने के लिए जीवाणु जीनोम का विश्लेषण करने के लिए प्रासंगिक है। इस अध्ययन में इस्तेमाल डीएनए बारकोड दृश्यों कुछ मामलों में केवल 3-4 ठिकानों से अलग, जांच है कि गैर विशिष्ट बाध्यकारी के लिए क्षमता को कम करता है की अति सुंदर विशिष्टता पर प्रकाश डाला. फ्लोरोसेंट जांच की विशिष्टता के बावजूद, सभी नए बारकोड दृश्यों उचित रूप से चरण 6 में वर्णित के रूप में संवेदनशीलता और विशिष्टता के लिए मान्य किया जाना चाहिए। बारकोड्ड उपभेदों बनाने के बाद, यह ऊपर वर्णित के रूप में इन विट्रो प्रतियोगिता assays में अलावा प्रयोगों के कई प्रकार के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन संभव है. उपभेदों चूहों या अन्य पशु मॉडल प्रणालियों में vivo प्रतियोगिता assays में के लिए उपयुक्त हैं. केवल कम से कम संशोधनों पशु अंगों और ऊतकों से gDNA निकालने के लिए आवश्यक हैं, और इन संशोधनों को अच्छी तरह से ऐसे प्रयोजनों के लिए किट के निर्माताओं द्वारा वर्णित हैं. इसके अलावा, विवो प्रतियोगिता में के लिए मिश्रित संक्रमण के बड़े पूल सफलतापूर्वक पहले7का उपयोग किया गया है, एक भी प्रयोग के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने की क्षमता की पेशकश, जो न केवल उन प्रयोगों की लागत कम हो जाती है लेकिन यह भी पशु से पशु परिवर्तनशीलता के लिए क्षमता कम हो जाती है. इसी तरह, बारकोड्ड उपभेदों अन्य इन विट्रो परख में इस्तेमाल किया जा सकता है कि विभिन्न उपचार की स्थिति के लिए उपभेदों की संवेदनशीलता की जांच (जैसे एंटीबायोटिक दवाओं, एसिड संवेदनशीलता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन या नाइट्रोजन प्रजातियों, आदि द्वारा हत्या). इन प्रयोगों के लिए, विकास अवरोध का आकलन चरण 3.4 में विकास माध्यम के लिए वांछित रासायनिक जोड़कर और वर्णित के रूप में आगे बढ़ने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. जीवाणु मौत का आकलन करने के लिए, उपभेदों का एक बड़ा पूल मिलाया जा सकता है, और ऊपर वर्णित के रूप में इनपुट मात्रा निर्धारित. वांछित उपचार के लिए जोखिम के बाद, लाइव कोशिकाओं चुनिंदा जीवंतता पीसीआर के साथ डिजिटल पीसीआर परिमाणीकरण प्रक्रिया युग्मन द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है रहते हैं और मृत कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए21,22,23 , 24 , 25 , 26. ऐसे प्रयोगों के लिए थ्रूपुट में नाटकीय रूप से वृद्धि होगी क्योंकि प्रत्येक विकृति के लिए कमजोर पड़ने और प्रतिकृति प्लेटों को अधिक सुव्यवस्थित आण्विक तकनीकों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। अंत में, हालांकि विकासवादी जीव विज्ञान और जनसंख्या आनुवंशिकी का विश्लेषण इस कागज के दायरे से परे है, barcoded जीवों ऐसे अध्ययनों के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय हैं. अंत में, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बैक्टीरिया है कि अत्यधिक कई विविध प्रजातियों में और प्रयोगों के कई प्रकार में इसके उपयोग के लिए अनुकूलनीय है परिमाणीकरण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक विकसित करने के लिए किया गया था.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान जॉर्ज एफ Haddix राष्ट्रपति संकाय अनुसंधान कोष और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) के जनरल मेडिकल साइंस संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या GM103427 के तहत समर्थित किया गया था. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
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