Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Оценка опухолевой микросреды метастазов Doorway-Mediated Сосудистая проницаемость, связанная с распространением раковых клеток с помощью интравитального изображения и фиксированного анализа тканей

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59633
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,2,3,5, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

Summary

Мы описываем два метода оценки преходящей сосудистой проницаемости, связанной с микроокружением опухоли метастазов (TMEM) функции дверного проема и интравацией раковых клеток с использованием внутривенной инъекции высокомолекулярного веса (155 кДа) декентна у мышей. Методы включают интравитальная визуализация у живых животных и анализ фиксированной ткани с использованием иммунофлюоресценции.

Abstract

Наиболее распространенной причиной смертности, связанной с раком, является метастаз, процесс, который требует распространения раковых клеток от первичной опухоли до вторичных участков. Недавно мы установили, что распространение раковых клеток в первичном раке молочной железы и в метастатических участках в легких происходит только в дверях называется Опухолевая микроокружающая среда метастазов (TMEM). Номер дверного проема TMEM является прогностичным для отдаленного рецидива метастатических заболеваний у больных раком молочной железы. TMEM дверные проемы состоят из раковой клетки, которая чрезмерно выражает актин регуляторного белка Mena в прямом контакте с периваскулярным, проангиогенным макрофагом, который выражает высокий уровень TIE2 и VEGF, где обе эти клетки плотно связаны с кровью сосуд эндотелиальной клетки. Раковые клетки могут интравироваться через дверные проемы TMEM из-за преходящей сосудистой проницаемости, организованной совместной деятельностью ассоциированного макрофага TMEM и тМЭм-ассоциированной раковой клетки Mena. В этой рукописи мы описываем два метода оценки преходящей проницаемости ТМЭм: интравитальная визуализация и иммунофлуоресценция фиксированной ткани. Хотя оба метода имеют свои преимущества и недостатки, объединение этих двух методов может обеспечить наиболее полный анализ проницаемости сосудов, опосредованных ТМЭМ, а также микроэкологических предпосылок для функции ТМЭм. Поскольку метастатический процесс при раке молочной железы, и, возможно, другие виды рака, включает в себя распространение раковых клеток через tMEM дверные проемы, важно использовать хорошо зарекомендовавшие себя методы для анализа TMEM дверной проем деятельности. Два описанных здесь метода обеспечивают комплексный подход к анализу активности дверных проемов TMEM, как у наивных, так и в фармакологически обработанных животных, что имеет первостепенное значение для доклинических испытаний агентов, предотвращающих раковые клетки распространения через TMEM.

Introduction

Недавние достижения в нашем понимании метастазов рака обнаружили, что эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ) и индукции мигрирующих/инвазивных субпопуляций раковых клеток сами по себе не являются достаточными для распространения гематогенов 1. Действительно, ранее считалось, что метастазирующие раковые клетки интравируются через всю всю вызванное раком эндотелия, так как неваскулярность опухоли часто характеризуется низким охватом перицитов, и как таковой, очень проницаема и нестабильный2,3,4. Хотя очень наводящий дефектных функций в опухоли, сосудистые изменения во время канцерогенеза не дают доказательств как таковых, что опухолевые клетки могут проникать кровеносные сосуды легко и неконтролируемым образом. Исследования интражизненной визуализации (IVI), в которых опухолевые клетки флуоресцентно помечены и сосуды помечены через внутривенную инъекцию флуоресцентных зондов (таких как декренилий или квантовые точки), показывают, что, в то время как опухолевые сосуды равномерно проницаемый до низкого молекулярного веса декстранс (например, 70 кД), высокомолекулярный вес декстранс (155 кД) и опухолевые клетки могут пересекать эндотелий только на специализированных участках интравазации, которые преимущественно расположены в сосудистой точке5, 6 , 7. Иммуногистохимический (IHC) анализы с использованием моделей животных и человеческого человека, полученных материал омичи показали, что эти сайты являются "дверные проемы", которые специализируются на регулировании проницаемости сосудов, локально и преходяще, обеспечивая краткое окно возможность для мигрирующих/инвазивных раковых клеток для входа в кровообращение. Эти дверные проемы называются "Tumor Microenvironment of Metastasis" или "TMEM", и, вполне ожидаемо, их плотность коррелирует с повышенным риском развития метастатического заболевания у больных раком молочной железы8,9, 10.

Каждый дверной проем TMEM состоит из трех различных типов клеток: периваскулярный макрофаг, опухолевые клетки, чрезмерно выражающие актин-регуляторный белок млекопитающих включен (Mena), и эндотелиальной клетки, все в прямом физическом контакте друг с другом1, 5,9,10,11,12,13. Ключевым событием для функции TMEM как внутривазивного дверного проема является локализованное высвобождение сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) на основной сосуд периваскулярным макрофагом14. VEGF может нарушить гомотипические соединения между эндотелиальными клетками15,16,17,18,19, явление, которое приводит к переходной утечки сосудов, также известный как "взрыв" проницаемость, как описано в исследованиях IVI 5. TMEM макрофаги были показаны, чтобы выразить рецептор тирозинкиназы TIE2, который необходим для VEGF-опосредованной функции TMEM и самонаведения этих макрофагов в периваскулярной нише5,20,21 , 22. В дополнение к регулированию распространения раковых клеток и метастазов, TIE2и макрофаги, как было показано, центральные регуляторы опухолевого ангиогенеза21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Таким образом, макрофаги TIE2и представляют собой критический компонент микроокружения опухоли и основной регулятор метастатического каскада.

Для лучшей концептуализации TMEM-опосредованной сосудистой проницаемости (т.е. "взрыв"), очень важно отличить его от других способов проницаемости сосудов, которые не связаны с роспуском эндотелиальных клеточных соединений. В нетронутом эндотелии (тот, чьи тесные и адепты не нарушены), есть три основных типа проницаемости сосудов: а) пиноцитоз, который может или не может быть связан с трансцитозом проглоченного материала; b) транспортировка материала через эндотелиальную фенестру; и с) транспортировка материала по параклеточному пути, который регулируется эндотелиальными узкими соединениями15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Хотя дерегулированы во многих опухолей, вышеупомянутые способы проницаемости сосудов были описаны в основном в контексте нормальной физиологии тканей и гомеостаза, крайности которых являются ткани с ограниченной проницаемостью ( например, гематоэнцефалический барьер, гематоэнцефалический барьер), или обильная проницаемость (например, фенестрированные капилляры почечного гломерулярного аппарата)34,35,36,37.

Используя мультифотонную интравитальная визуализацию и мультиплексированную иммунофлуоресценционную микроскопию, мы можем различать проницаемость сосудов tMEM ("взрыв") и другие способы проницаемости сосудов при опухолях молочной железы. Для этого мы выполняем одну внутривенную инъекцию высокомолекулярного веса, флуоресцентно маркированного зонда у мышей. Спонтанное взрывное время событий может быть захвачено с помощью интравитентной визуализации у живых мышей; или, в качестве альтернативы, экстравазивание зонда может быть количественно путем совместного исследования локализации с сосудами крови (например, CD31 или Эндомуцин)и TMEM дверные проемы с использованием иммунофлюоресценции микроскопии. Представленные здесь протоколы описывают оба этих метода, которые могут использоваться либо самостоятельно, либо в сочетании друг с другом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с использованием живых животных должны проводиться в соответствии с руководящими принципами и правилами в отношении использования животных и ухода за животными. Процедуры, описанные в данном исследовании, были проведены в соответствии с национальными правилами здравоохранения, касающимися ухода и использования экспериментальных животных, а также с одобрения Медицинского колледжа и использования животных Колледжа Альберта Эйнштейна (IACUC).

1. Оценка "взрывной проницаемости" с использованием изображений живых животных

  1. Трансплантация сингенных опухолей молочной железы в хосты мыши с флуоресцентными макрофагами
    1. Генерировать кусочки опухолевой ткани, пригодные для трансплантации.
      1. Создание флуоресцентно помеченных опухолей в моделях рака молочной мыши мыши, пересекая спонтанной, аутохтонической, генетически инженерии мыши молочной модели MMTV-PyMT мышей с трансгенными мышами, выражающими флуоресцентные репортеры38, 39 (например, улучшенный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), улучшенный циановый флуоресцентный белок (ECFP), или Dendra2.
      2. Разрешить mMTV-PyMT мышей с флуоресцентно помечены опухоли расти до размера не более 2 см (примерно 10-12 недель).
      3. Эвтаназия опухоли подшипника MMTV-PyMT мышей, поместив их в камеру с 5% изофлуран до 30 секунд после того, как все дыхание остановить.
      4. Выполните вывих шейки матки.
      5. Удалить волосы из живота эвтаназии мыши с помощью актуальных депиляционных крем.
      6. Поместите чашку Петри с средой культуры клеток DMEM/F12 на льду.
      7. Поместите мышь и чашку Петри на лед в капот дыма.
      8. Обезвитрить живот мыши с 70% этилового спирта.
      9. Использование стерильных перчаток и хирургических инструментов (стерилизованные ножницы, щипцы и лезвие) удалить опухоли и поместить их в чашку Петри.
      10. Разрежьте опухоль на мелкие кусочки (2 мм х 2 мм х 2 мм в размерах), отбрасывая любые некротические части, в то время как они находятся в чашке Петри.
    2. Перегрузите опухолевые кусочки в принимающие реципиенты.
      1. Поднимите мышей с генетически модифицированными флуоресцентно маркированными макрофагами, например, MacGreen40 или MacBlue 41 мышами (Csf1r -GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. Разрешить FVB мышей с флуоресцентно помечены макрофаги расти до возраста 4-6 недель).
      3. Анестезия FVB мышей с флуоресцентно помечены макрофаги в камере с использованием 5% изофлуран с кислородом в качестве носителя газа.
      4. Уменьшить анестезию до 3% изофлуран и применять офтальмологические мази для глаз мыши, чтобы предотвратить сушки.
      5. Удалите волосы из более чем4-й молочной железы мыши.
      6. Очистите кожу бетадином. Важно поддерживать стерильные условия на протяжении всей процедуры. Это включает в себя использование стерилизованных инструментов и реагентов.
      7. Сделайте небольшой разрез на 2-3 мм, просто уступая4-й сосок.
      8. Вскрыть до тех пор, пока молочный жир подушечка подвергается.
      9. Возьмите кусок опухоли из чашки Петри и пальто в искусственной внеклеточной матрицы.
      10. Трансплантация опухолей под4-й молочной жировой площадки.
      11. Закройте разрез с помощью цианоакрилата клея.
      12. Постоянно следите за животным до полного выздоровления и способен поддерживать строгое затишье. Также не возвращать животное в компанию других животных до полного выздоровления.
      13. Чтобы свести к минимуму инфекции, добавьте 1 мл 100 мг/мл антибиотика энрофлоксацина в бутылку питьевой воды животного (8 fl oz).
      14. Разрешить опухоли расти до ощутимого (5 мм; 4 недели).
      15. В зависимости от эксперимента, выделить мышей в группы лечения, и выполнить соответствующие методы лечения, если это применимо.
  2. Настройка для интравитальной визуализации
    1. Включите двухфотонный лазер микроскопа и детекторы.
    2. Включите нагревательную коробку и предварительно разогрейте стадию x-y микроскопа.
    3. Поместите на заказ этапвую вставку42 в стадию x-y.
  3. Приготовление окна изображения
    1. Перед настройкой для визуализации, автоклав на заказ круговой каркас окна изображения42.
    2. Используйте пипетку или инсулиновый шприц, чтобы поместить тонкий слой клея цианоакрилата к оконной раме и прикрепить на месте 8 мм круглого стекла крышки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Важно, чтобы избежать получения остатков на ясной диафрагмы крышки стекла. 2) Важно придерживаться крышки стекла к оконной раме по крайней мере 1 ч перед использованием для визуализации.
    3. Тщательно протрите очистить любой избыток цианоакрилата на прозрачной диафрагме крышки стекла с помощью лабораторной протрите смачивают с небольшим количеством ацетона.
  4. Приготовление катетера хвостовой вены для введения жидкостей и флуоресцентных красителей во время визуализации
    1. Вырезать 30 см кусок полиэтиленовой трубки, чтобы построить катетер хвостовой вены.
    2. Отсоедините иглу часть иглы 30 G от его Luer конус, мягко согнув иглу вперед и назад, пока он не ломается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна быть проведена близко к Luer конус, а не кончик иглы. Это может быть выполнено с плоскогубцами или щипцами, чтобы схватить иглу для того, чтобы предотвратить травму иглы палкой.
    3. Вставьте тупой конец иглы в один конец полиэтиленовой трубки.
    4. Вставьте острый конец еще 30 G иглы, сохраняя его Luer конус прилагается, на противоположном конце трубки.
    5. Заполните 1 см шприц с фосфатами буферизированного сольника, прикрепите его к Luer конус собранного катетера, и промыть катетер хвостовой вены убедившись, что Есть нет пузырьков воздуха в системе.
    6. Для сосудистой маркировки заполните 1 см шприц 1 см 100 л 10 мг/кг 155 кДа dextran-тетраметилродамин (TMR) или квантовыми точками.
  5. Подготовка мыши для визуализации
    1. Анестезия мыши в клетке под (No 1 фут ниже) тепловой лампы с использованием 4%-5% изофлуран смешивается со 100% кислорода установить на поток 1,5-2 л на мин.
    2. Включите тепловую лампу над хирургической рабочей зоной. Этот шаг имеет решающее значение для поддержания основной физиологичной температуры тела мыши во время операции.
    3. Поместите мышь под тепловую лампу и опустите анестезию до 2%-3% на время операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте держать тепловую лампу на безопасном расстоянии (1 фут) от мыши, чтобы избежать перегрева.
    4. Поместите офтальмологическую мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание глаз и слепоту.
    5. Проверьте, что мышь обезвлеживается, выполняя тест на нос.-пинч. Если животное уходит, увеличьте дозировку изофлуран на 1% и повторно проверьте через 1-2 мин.
    6. Вставьте катетер хвостовой вены в самую дистальную точку на хвосте.
    7. Прикрепите катетер хвостовой вены к хвосту небольшим кусочком лабораторной ленты, которая обматывает сядки вокруг хвоста и прилипает к игле, чтобы убедиться, что она не выбита.
    8. Вводят 50 л л на ч PBS через катетер хвостовой вены, чтобы обеспечить адекватное увлажнение. Очень важно, чтобы избежать инъекций слишком много жидкости (не более 200 л на ч) или любые пузырьки в катетер, поскольку это может быть фатальным для мыши.
    9. Удалите волосы на животе на4-й и5-й молочные железы с помощью крема для депилатории.
    10. Очистите кожу бетадином и дайте коже высохнуть.
    11. Сделайте продольное разрез средней линии, начиная сразу же превосходит половых органов и нести разрез до уровня высшего аспект4-й молочной железы.
    12. Носите разрез поперечный к начальнику аспекту4-й молочной железы. Очень важно, чтобы избежать ущерба для кровоснабжения в этой точке.
    13. Вскрыть молочный жир площадку от peritoneum создания ткани лоскут с помощью стерильных щипцы и ножницы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кожа лоскут изображения восприимчива к значительным артефактов движения и обезвоживания тканей. Эти избежать, как описано ранее43,44, путем прикрепления жесткой кусок резины позади кожи стороне лоскута (для ужесточения мягких тканей и изолировать его от остальной части тела), а затем размещение опухоли в мелкой визуализации окно для сохранения гидратации. Это имеет решающее значение для стабильной визуализации, как опухоль и окружающие ткани в этой обстановке очень совместимы.
    14. Стабилизировать лоскут кожи путем крепления (с клеем цианоакрилата) небольшой кусочек жесткой резины размером 2 см х 2 см к стороне кожи лоскута. Опухоль должна быть в центре области стабилизируется резиной.
    15. Держите подвергаются ткани гидратированных с каплями PBS.
    16. Нанесите небольшую пленку цианоакрилата на внешний край специально сделанной кадровой рамы для окна изображения.
    17. Нанесите небольшую капельку PBS (10-20 л) на центр крышки стекла.
    18. Высушите окружающую ткань лоскута лабораторной салфеткой. Очень важно, чтобы убедиться, что цианоакрилат на оконной раме не вступает в контакт с PBS на стекле, так как это может привести к цианоакрилат полимеризации и установить преждевременно.
    19. Прикрепите небольшое окно изображения к лоскуту ткани с опухолью в центре ясной диафрагмы.
    20. Снимите нагревательную коробку со сцены.
    21. Перенесите анестезирующую мышь и катетер хвостовой вены на стадию микроскопа. Используйте крайнюю осторожность, чтобы убедиться, что катетер хвостовой вены не выпадает.
    22. Поместите мышь на сцену в положении склонного.
    23. Поместите носовой конус изофлюрани над мордой, чтобы обеспечить поддержание анестезии.
    24. Вставьте окно в отверстие на пользовательской пластине X-y.
    25. Поместите нагревательную коробку обратно на сцену для поддержания физиологической температуры.
    26. Мониторинг жизненно важных признаков животного путем присоединения пульс оксиметр зонд через датчик клипа к задней лапе.
    27. Медленно уменьшить изофларан до 0,5%-1% для поддержания адекватного кровотока и избежать более анестезии мыши.
  6. Интравитальная визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение мы описываем в этом разделе была выполнена на специально построенном двухлазерный мультифотоновый микроскоп, который был ранее описан5,39,45. Короче говоря, фемтосекундный лазер используется для генерации 90 фемтосекундный импульсный лазерный свет по центру на 880 нм. Флуоресценция света обнаруживается с тремя из четырех одновременно приобретающих детекторов (Синий No 447/60, Зеленый 520/65, и красный 580/60; центральная длина волны / пропускная способность) после отделения от возбуждающего света на дихротический (Chroma, 720DCXXR). Подставку микроскопа содержит объектив объективного объектива 25x, 1.05 NA (числовая диафрагма) с длинным рабочим расстоянием (2 мм). Важно отметить, что, хотя мы использовали специально созданный микроскоп, протокол, описанный ниже, может быть выполнен на любом коммерчески доступном мультифотонном микроскопе.
    1. Поместите каплю дистиллированной воды между 25x, 1,05 NA микроскоп цели и крышка окна стекла, чтобы оптический контакт.
    2. Используйте микроскоп окуляр, чтобы сосредоточиться на областях с флуоресцентными опухолевыми клетками рядом с поверхностью окна.
    3. Найти протекающих кровеносных сосудов и помечены макрофагов. Очень важно иметь протекающие кровеносные сосуды для оценки динамики сосудов.
    4. Переключите микроскоп в мультифотонный режим.
    5. Установите верхние и нижние пределы z-серии, которая измеряет приблизительно 50 мкм.
      1. Установите верхний предел z-серии, используя регулятор фокусировки для перемещения цели в нужное место начала, в наиболее поверхностном положении, и маркировка этой позиции как нулевая в программном обеспечении, нажав на кнопку «Положение Сверху».
      2. Установите нижний предел z-серии, перемещая цель к самому глубокому слою (обычно 50-70 мкм сверху для небольших опухолей) и нажимайте кнопку «Положение Нижний».
      3. Установите размер z-шага до 5 мкм.
    6. Нажмите кнопку Time-Lapse панели и установить временной интервал между приобретениями, по крайней мере 10 с, чтобы обеспечить достаточное время для пополнения воды над объективом цели. Это делается вручную с помощью пипетки на цель в течение длительного промежуток времени.
    7. Удалите шприц с PBS в катетере хвостовой вены и замените его другим шприцем, содержащим 155 kDa dextran-TMR (тетраметил родамин).
    8. Вводят 100 л из 155 kDa dextran-TMR через катетер хвостовой вены.
    9. После инъекции замените шприц ПМР шприцем на шприц PBS.
    10. Приобретите изображения замедленного промежутки z-stack, нажав на кнопки «Стек» и «Время-Lapse», а затем нажмем на кнопку записи.
    11. Вводят 50 л PBS каждые 30-45 мин для поддержания адекватной гидратации животного. Избегайте инъекций более 200 л во время, так как это может привести к перегрузке жидкости.
  7. Эвтаназии
    1. Увеличьте изолюран до 5% и держите животное под 5% изолюраном с носовым конусом на месте до 30 s после прекращения дыхания.
    2. Удалите мышь со сцены.
    3. Выполните вывих шейки матки.
  8. Обработка изображений
    1. Загрузите все изображения в ImageJ и отформатируйте их в 5-мерный гиперстек (x, y, z, t и цветной канал).
    2. Выполните разделение спектрального перекрытия (т.е.: GFP и CFP) и устранение дрейфа x-y от гиперстеков с помощью установленных методов38.
    3. Используйте регулировку яркости и контрастности для увеличения белого уровня канала крови, чтобы фоновый сигнал стал видимым.
    4. Для каждого z ломтик, тщательно проверять каждый фильм на наличие признаков переходной утечки сосудов ("взрыв"). Запуск фильмов с быстрой частотой кадров (40 кадров в секунду) может помочь этой идентификации.
    5. После того, как всплеск был определен, вернуть яркость для этого канала на нормальный уровень и обрезать гиперстек в этом регионе и z-ломтик.

2. Оценка внесосудистого экстран с использованием анализа фиксированной ткани

  1. Подготовка опухоли и образца
    ПРИМЕЧАНИЕ:2-й части этого протокола предполагает, что опухоли молочной железы были собраны из ортотопической трансплантации мыши модель рака молочной железы (т.е. MMTV-PyMT). Эта модель может быть такой же, как описанная в1-й части протокола, хотя флуоресцентно помеченные опухоли не являются необходимыми на данный момент.
    1. После прекращения экспериментального трубопровода (т.е. медикаментозного лечения и т.д.), выполнить хвостовую инъекцию 100 л 10 мг/мЛ 155 кДа dextran-tetramethyl родамин, 1 ч, прежде чем жертвовать мышей.
    2. Пожертвуйте мышами и собирайте урожай опухолей молочной железы.
    3. Исправить опухоли в 10% формалин для 48-72 ч и приступить к парафинам встраивания.
    4. Используя микротом, вырезать два 5 мкм толщиной последовательных слайдов из формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE) тканей. Один слайд используется для окрашивания декекрена, в то время как другой будет использоваться для выполнения TMEM тройной IHC, для справки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол TMEM тройной иммуногистохимии был описан в другом месте 10.
  2. ЕСЛИ окрашивание и сканирование для первого из двух последовательных секций
    1. Отправить слайды в стандартный протокол депарфинизации. Это включает в себя два последующих погружения в ксилен (10 мин каждый), а затем обезвоживание в последовательно разбавленных растворов алкоголя (100%, 95%, 70%, и 50% EtOH в H2O в течение 2 мин каждого погружения).
    2. Выполняйте извлечение антигена путем нагревания (близко к точке кипения) секций, погруженных в цитрат (pH 6.0-adjusted) в течение 20 мин.
    3. Дайте образцам остыть до комнатной температуры в течение 15-20 мин, а затем промыть в PBS 3x в течение 2 минут каждый стирку.
    4. Блок для 60-90 мин в блокирующем буфере (10% FBS; 1% BSA; 0.0025% желатин кожи рыб; 0.05% PBST, т.е. PBS с 0.05% Tween-20).
    5. Инкубировать образцы со смесью первичных крыс и кролика антитела, которые нацелены на эндомуцин и ПМР, соответственно, а затем мыть в PBST 3x, 2 мин каждый.
    6. Инкубировать образцы со смесью вторичных антител осла против крыс IgG (конъюгированный Alexa-647) и кролика IgG (конъюгированный Alexa-488), а затем мыть в PBST 3x 2 мин каждый.
    7. Выполните рутинное окрашивание DAPI (т.е. погружение в раствор DAPI в течение 5-6 минут), смонтируйте слайды с помощью «жесткого» монтажа без глицерола и храните в темном месте до сканирования.
    8. Для достижения оптимальных результатов сканирует слайды на цифровом сканере слайдов.
  3. Анализ изображений
    1. Захват 10 высокомощных полей (HPFs) в случае, используя любое программное обеспечение, подходящее для цифровой патологии.
    2. Сохранить эндомуцин (красный) и TMR (зеленый) каналы отдельно как TIFF.
    3. Используя ImageJ, загрузите файлы TIFF и преобразуйте их в 8-битные изображения.
    4. Забронируйте 8-битные изображения до уровня отрицательного контроля и создайте два бинаризированных изображения, показывающие «маски» Эндомуцина и ПМР.
    5. Из двоичных инструментов выберите заполнить отверстия на маске Endomucin.
    6. Создание и сохранение следующих пяти регионов, представляющих интерес: 1) Пороговое изображение декексна как "Dextran ROI" (ROI1), 2) пороговое изображение эндомуцина как "Сосудистая ROI" (ROI2), 3) перевернутое изображение эндомуцина как "Extravascular ROI" (ROI3), 4) пересекается " Внесосудистая рентабельность инвестиций" и "Dextran ROI" изображение (ROI1 - ROI3) как "Внесокулярная dextran ROI" (ROI4), и 5) все изображение как "Tumor ROI" (ROI5).
    7. Разделите область ROI4 на область ROI5 и умножайте на 100, чтобы создать процентную площадь, которую внесосудистое декетрен покрывает во всей опухоли.
    8. Повторите процесс для 10-20 HPFs в случае (в зависимости от наличия ткани) и генерировать средний внесосудистый Dextran (% области) для каждого случая.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экспериментальные процедуры, описанные в настоящей статье протокола, кратко обобщены и проиллюстрированы на рисунке 1A-C.

Для измерения проницаемости сосудов TMEM ("всплесковой активности") и снижения экспериментального шума от других способов проницаемости сосудов (т.е. трансклеточных и параклеточных, как поясняется во введении), мы выполнили внутривенно (т.е.) инъекции зондов высокого молекулярного веса, таких как 155 kDa Dextran, спрягались с тетраметил родамином. Нижний молекулярный вес декстранса не отличал трех режимов проницаемости сосудов. Наш предыдущий опыт показал, что системная циркуляция 155 kDa TMR-Dextran эффективно помечены сосуды как нормальных тканей, таких как молочной железы и легких (Рисунок 2A, B), а также неопластических тканей, таких как первичный рак молочной железы и метастаза рака молочной железы в легких(Рисунок 2C,D). Как также подтверждено в предыдущих исследованиях5,46, 155 kDa TMR-Dextran, таким образом, подходящий зонд для измерения "взрыв" в первичных и вторичных участков опухоли. Характерный пример пиковой активности разрыва (пунктирная желтая область), с использованием многофотонных интравитальной визуализации в первичной опухоли молочной железы MMTV-PYMT иллюстрируется как серия неподвижных изображений(Рисунок 3A). Взрывная активность всегда отмечалась в связи с дверным проемом TMEM (пунктирный белый круг), характеризующимся пространственным сопоставлением Dendra2- опухолевой клетки CFPи эндотелия (рисунок3А). Как уже упоминалось, каждый дверной проем TMEM состоит из периваскулярного макрофага, Мены переэкспрессии опухолевой клетки, и эндотелиальной клетки, все в прямом физическом контакте друг с другом. Хотя Mena не был явно помечены в мышиных моделей, используемых в этих экспериментах, ранее было показано, чтобы стать overexpressed в поздней стадии PyMT карциномы47. Это упрощает идентификацию дверных проемов TMEM и устраняет необходимость явно маркировать Мену в опухолевых клетках.

Для оценки TMEM-зависимых сосудистых проницаемости в анализе фиксированной ткани, мы выполнили процедуру, описанную в этом протоколе у мышей, которые были пересажены с опухоли куски взяты из 14-недельного MMTV-PyMT донорских мышей. Когда мыши достигли соответствующего размера опухоли, они получили одну дозу i.v. 155-kDa TMR-Dextran, как описано в части 2 этого протокола, и были принесены в жертву через 1 час. Опухолевые ткани были собраны и подвергнуты анализу If. Эндомуцин флуоресцентный сигнал был использован в качестве маски исключения для декстран флуоресцентного сигнала, что позволяет дискриминации между высокопроницаемым и низким, или непроницаемый, кровеносные сосуды (Рисунок 3B). Как ранее описано в Karagiannis et al.48,последовательный слайд был также окрашен ранее установленным тройным пятном TMEM и выровнен с соответствующим слайдом IF. Используя этот подход, мы подтвердили, что высокопроницаемые кровеносные сосуды в ткани опухоли молочной железы имеют по крайней мере один связанный TMEM дверной проем(рисунок 3B).

Figure 1
Рисунок 1 . Резюме процедуры. (A) Dendra-2 помечены инвазивной карциномы груди (зеленый) взяты из трансгенного животного FVB/ N-Tg (MMTV-PyMT)муль-Tg (MMTV-iCre)Jwp-Tg (loxP-стоп-loxP-Pdendra2)Jwpи разрезать на мелкие кусочки. Один кусок затем ортотопически пересажены в другое трансгенное животное, чьи макрофаги были помечены циановых флуоресцентных белков (циан) -FVB /N-Tg (Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP). Ортотопически пересаженный в опухоль затем разрешается расти, после чего мышь выделяется на соответствующее лечение руку. (B) После того, как лечение закончено, мышь затем принимаются для интравитальной визуализации. После анестезии, кожа лоскут хирургии выполняется затем стабилизировалась с резиновой поддержкой. Неглубокое окно изображения затем прикреплены над опухолью. Наконец, мышь помещается на стадии микроскопа, где окно вписывается в пользовательские пластины этапе и изображения могут быть приобретены. (C) Кроме того, мышь из А вводят высокий молекулярный вес dextran и жертвуют после 1 часа. Опухоль затем удаляется, фиксируется и обрабатывается для встраивания парафина. Разделы ткани вырезаны, окрашены для TMEM в IHC и dextran и сосуды в IF, и сканируются на цифровом целом слайд сканера. Наконец, изображения из двух сканирований выровнены и отдельные поля зрения выбираются для анализа и количественной оценки утечки сосудов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 . Визуализация ПМР-Декексна помечена сосудами в здоровых и больных тканях. (A) Изображение здорового развивающегося молочной железы в трансгенных животных, сосуды которого помечены TMR-Dextran (красный), молочной протоковой эпителий помечены флуоресцентный белок Dendra-2 (зеленый), и макрофаги помечены циана флуоресцентный белок (синий) -FVB/N-Tg (loxP-stop-loxP-Pdendra2)Jwp-Tg (Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) (B) Здоровая легочная ткань, визуализированная через окно визуализации легких в мыши, сосуд ы нее помечен ПМР-Декексен (красный). Синий й SHG из коллагена волокон. (C) Dendra2 помечены инвазивных протоковых карциномы взяты из трансгенных животных -FVB / N-Tg (MMTV-PyMT)mulxTg (MMTV-iCre)Jwp-Tg (loxP-стоп-loxP-Pdendra2) макрофаги помечены голубой флуоресцентный белок (синий) -FVB/N-Tg (Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) и сосудами, маркированными TMR-Dextran (красный). (D) Метастаза легких через восемь дней после iv инъекции опухолевых клеток (E0771; помечены флуоресцентным белком Clover) в трансгенного животного, чьи макрофаги помечены синофлуоресцентным белком (циан) и сосуды помечены ПМР-Dextran (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 . Визуализация tMEM-опосредованной сосудистой проницаемости с помощью интравитальная визуализация и анализфиксированной ткани. (A) Кадры из замедленного интражизненной визуализации фильм 155-kDa TMR-Dextran маркировки нео-ангиогенных сосудов (красный) в Dendra-2 помечены инвазивной карциномы груди (зеленый) взяты из трансгенного животного (MMTV-iCre) Jwp-Tg (loxP-stop-loxP-Pdendra2)Jwpи ортотопически пересажены в другое трансгенное животное, где макрофаги были помечены циановым флуоресцентным белком (циан) -FVB/N-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) Пунктирная желтая линия обозначает контур переходной области утечки сосудов до (т 0'), во время (т No 17') и после (t No 52') события утечки (разрыва). Разбитый белый круг указывает на дверной проем TMEM, как это записано в живой визуализации. (B) Многоканальная иммунофлуоресценция эндомуцина (первая колонка), 155-kDa dextran-TMR (вторая колонка), их слитое изображение вместе с DAPI (третья колонка), пороговый кровеносный сосуд и внесосудистые дексеновые маски (четвертая колонка), а также соответствующая последовательность tMEM IHC (пятая колонна) у мышей MMTV-PyMT. Верхний ряд: Сосудистый профиль вдали от TMEM, появляющийся как "не-утечка" сосудистого профиля. Нижний ряд: TMEM-связанный сосудистый профиль, появляющийся как «липкий» сосудистый профиль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы намечаем два протокола, которые могут быть применены для визуализации и количественной оценки определенного типа сосудистой проницаемости, которая присутствует в дверных проемах TMEM и связана с нарушением сосудистой плотности и связей. Этот тип проницаемости сосудов является переходным и контролируется трехсторонним клеточным комплексом TMEM, как поясняется выше5. Способность выявлять и количественно определять сосудистую проницаемость, связанную tMEM, имеет решающее значение для оценки прометастатической микросреды раковых клеток, а также для доклинических исследований, которые исследуют влияние обычных цитотоксических терапии на опухоль микроокружение, а также антиметастатический потенциал целенаправленной и нецелевой терапии. Важно отметить, что мы продемонстрировали здесь, что эта оценка может быть сделано либо интравитальная визуализация или иммунофлуоресценции в фиксированных тканях. Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки. Интравитальная визуализация позволяет напрямую визуализировать динамический процесс проницаемости сосудов, но требует специализированного оборудования и обучения. С другой стороны, иммунофлуоресценция, выполняемая в стационарных тканях, предлагает только статическое изображение, но может регулярно выполняться в большинстве лабораторий.

Онкологические больные обычно лечатся с той или иной форме системной терапии, и успех системного лечения, как правило, оценивается по оценке параметров, связанных с выживаемостью раковых клеток, таких как апоптоз, пролиферация, или валовой размер опухоли. Тем не менее, не менее важно понять, как эти системные методы лечения влияют на распространение раковых клеток, учитывая, что большинство связанных с раком смертности происходит из-за метастаз, процесс, который включает в себя как распространение раковых клеток, а также раковые клетки распространение1. Например, последние исследования показали, что химиотерапия может вызвать значительное увеличение плотности TMEM дверные проемы у мыши и рака молочной железычеловека 48,49. Кроме того, было показано, что химиотерапия вызывает активность TMEM и приводит к гематогенового распространения раковых клеток, увеличение циркулирующих раковых клеток, и увеличение метастазов легких48. Химиотерапия индуцированного увеличения активности TMEM может быть заблокирован системного введения препарата, который подавляет функцию TIE2 и, следовательно, TMEM деятельности, называется rebastinib14,48. Таким образом, описанные здесь протоколы могут предложить ценные измерения конечной точки для влияния различных системных методов лечения на активность TMEM путем сравнения обработанных необработанных когорт мышей.

В последние годы концепция антиангиогенной терапии при раке была пересмотрена, предполагая, что сосудистая стратегия «нормализации» (т.е. переходная реконституция аномальной структуры и функции кровеносных сосудов) может быть предпочтительнее таргетинга кровеносные сосуды для уничтожения, так как это делает неваскуляр более эффективным для доставки лекарств50,51,52,53,54. В связи с этой формирующейся гипотезой, другие группы также разработали анализы для оценки проницаемости сосудов и для проверки эффективности стратегий нормализации сосудов55. Следует отметить, что в принципе эти методы используются для оценки TMEM-независимых режимов проницаемости сосудов. Таким образом, выбор наиболее подходящих сосудистых проницаемость анализ зависит от сферы исследования, и исследователи должны убедиться, что они поймывают применимость каждого из опубликованных сосудистых анализов проницаемости, прежде чем применять их к их Исследования.

Как уже упоминалось выше, каждый из двух описанных здесь методов имеет определенные преимущества по сравнению с другим. Например, измерение "взрывной проницаемости" in vivo предлагает ценную кинетическую информацию, но так как разрыв является редким событием, для получения достаточного количества данных могут потребоваться длительные сеансы визуализации продолжительностью в несколько часов каждый. Кроме того, интравитальная визуализация требует специализированного оборудования, которое может быть доступно не всем следователям. С другой стороны, оценка активности ТМЭм в стационарных тканях относительно проста в выполнении и требует только стандартного лабораторного оборудования. Кроме того, анализ активности ТМЭм в стационарных тканях легче интерпретировать, но не хватает кинетической информации. Кроме того, анализ фиксированной ткани является менее специфичным, так как он может захватить кумулятивной утечки декстран с течением времени от трансклеточной и параклеточной сосудистой проницаемости нетронутыми эндотелии, или даже внезапной утечки события из-за спонтанной сосудистой травмы. Таким образом, синергетический использование этих двух методов сделает более конкретным и более чувствительным толкование опосредоченной сосудистой проницаемости TMEM. Хотя мы не проверяли другие применения методов, представленных здесь, они могут оказаться полезными для исследования индуцированной проницаемости сосуда, например, инфекцией или фармацевтической терапией.

Таким образом, измерение сосудистой проницаемости, связанной с ТМЭм, изложенное в двух независимых методологиях здесь, обеспечивает полезные инструменты для оценки прометатической микросреды опухоли и связанной с ней активности TMEM, и может быть использовано для некоторых степени любой лаборатории. Эти методы особенно полезны в доклинической оценке влияния системной терапии на распространение раковых клеток. Кроме того, они могут быть использованы для оценки влияния агентов, которые могут блокировать химиотерапию индуцированной деятельности TMEM, и, наконец, эти методы могут быть использованы для оценки наилучшей комбинированной терапии, предшествующей фазе I испытаний пациента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не раскрывают никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Аналитический центр визуализации (AIF) в Медицинском колледже Альберта Эйнштейна за поддержку изображений. Эта работа была поддержана грантами NCI (P30CA0133330, CA150344, CA 100324 и CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Центр биофотоники Gruss-Lipper и его комплексная программа визуализации, а также Рут Грантштейн из Montefiore для исследования микроокружения опухоли (CA200561).

ГСК совместно писала рукопись, выполняла визуализацию для фигур 1С и 3В, разработала протокол анализа фиксированной ткани, проанализировала и интерпретировала все данные; JMP совместно написал рукопись, и выполнил операцию и интравитальной визуализации для рисунка 1B,2C и 3A; LB и AC выполнили операцию и интравитальной визуализации для Рисунок 2B; RJ выполнил операцию и интравитальной визуализации для Рисунок 2A; ОАО является соавтором рукописи, проанализировало и интерпретировало все данные; MHO совместно написал рукопись и проанализировал и интерпретировал все данные; и DE выполнили операцию и интравитальной визуализации для рисунка 2D, соавтором рукописи, разработал и разработал анализ фиксированной ткани и внутрижизненной протоколы визуализации, а также проанализировали и интерпретировали все данные.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Tags

Опрокидительное действие выпуск 148 интравитальная визуализация иммунофлуоресценция проницаемость кровеносных сосудов микроокружение опухоли метастаза (ТМЭМ) высокомолекулярный вес декесцента иммунофлуоресценция метастаз
Оценка опухолевой микросреды метастазов Doorway-Mediated Сосудистая проницаемость, связанная с распространением раковых клеток с помощью интравитального изображения и фиксированного анализа тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karagiannis, G. S., Pastoriza, J.… More

Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter