Den metode, der præsenteres her, bruger mikromønster sammen med kvantitativ billeddannelse til at afsløre rumlig organisation inden for pattedyrs kulturer. Teknikken er nem at etablere i et standard cellebiologi laboratorium og tilbyder et Tractable system til at studere mønstret in vitro.
Et grundlæggende mål i biologi er at forstå, hvordan mønstre opstår under udvikling. Flere grupper har vist, at mønstret kan opnås in vitro, når stamceller er rumligt begrænset til mikromønstre, hvorved der oprettes forsøgsmodeller, som giver enestående muligheder for in vitro at identificere de grundlæggende principper for biologisk organisation.
Her beskriver vi vores egen implementering af metodologien. Vi tilpassede en foto-møningsteknik for at reducere behovet for specialiseret udstyr for at gøre det lettere at etablere metoden i et standard cellebiologi laboratorium. Vi har også udviklet en gratis, open source og let at installere billedanalyse ramme for præcist at måle præference positionering af sub-populationer af celler inden for kolonier af standard former og størrelser. Denne metode gør det muligt at afsløre eksistensen af mønstret begivenheder selv i tilsyneladende uorganiserede populationer af celler. Teknikken giver kvantitativ indsigt og kan bruges til at afkoble påvirkninger fra omgivelserne (f. eks. fysiske signaler eller endogene signalering) på en given mønster proces.
I pattedyrs systemer er mønstret en fremtrædende egenskab ved den kollektive opførsel af celler, og derfor kan mønstre dannes in vitro, hvis der gives passende signaler til cellerne1,2,3,4, 5 , 6. en måde at afsløre den iboende evne af cellerne til selv at organisere in vitro er at tvinge cellerne til at danne grupper/kolonier af en defineret former og størrelser7,8,9,10 . En teknik, der muliggør dette er micropatterning11. Micropatterning gør det muligt præcist at definere placeringen, hvor ekstracellulære matrix (ECM) molekyler er deponeret på en overflade. Dette dikterer, hvor cellerne kan overholde og derfor styrer, hvordan cellerne spatialt organisere.
Micropatterning er en teknik med talrige anvendelser, for eksempel, micropatterning muliggør standardisering af de oprindelige betingelser forud for differentiering12. Det er vigtigt, at micropatterning gør det muligt nemt at kontrollere størrelsen, formen og afstanden af celle kolonier, og denne egenskab kan bruges til at udtænke eksperimenter, der tager sigte på at forhale den kollektive respons af cellerne til morphogen eller til fysiske signaler7 , 8 , 10 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Flere micropatterning metoder er blevet udviklet11. Photopatterning teknikker er måske de nemmeste metoder til at etablere18. Disse tilgange har også fordelen af præcision, da de kan bruges til at kontrollere formen af enkeltceller18,19,20. Men de kræver også dyrt specialiseret udstyr, herunder en spin Coater, et plasma kammer og en UVO (UV-ozon) renere, som generelt ikke er let tilgængelige i standard biologi laboratorier. For at lette vedtagelsen af teknikken har vi tilpasset protokollen, så den kun nødvendiggør UVO-lampen. Vi starter fra kommercielt tilgængelige plastik slides, som kan skæres med en saks eller med et hul punch til det ønskede format.
Et vigtigt nytte af mikromønstre er evnen til at standardisere kolonier for at sammenligne individuelle kolonier på tværs af flere replikater. Dette gør det muligt at spørge, i hvilket omfang mønster dannelsen inden for disse kolonier er reproducerbar, og at undersøge faktorer, der påvirker robustheden af mønsterprocessen. Det er vigtigt, at kvantificering af “gennemsnitlige” mønstre på tværs af flere standardiserede kolonier også kan afsløre mønster processer, der ellers ikke ville være synlige. Fordelen ved at kunne kvantificere mønstret på standardiserede kolonier afhænger af, at man præcist kan måle protein ekspression, ideelt set på enkelt celleniveau. Men celler på mikromønstre er ofte tæt pakket, hvilket gør dem vanskelige at segmentere med høj nøjagtighed. Celler organiserer også ofte sig selv i tre i stedet for to dimensioner, og det kan være udfordrende at opdage og bevare tredimensionale (3D) oplysninger under segmentering. Når cellerne er blevet segmenteret med succes, er der behov for beregningsmæssige metoder til at udtrække mønster oplysninger fra de resulterende datasæt.
Vi har udviklet segmenterings-og billedanalyse værktøjer til at hjælpe med at overvinde disse problemer. Denne analysemetode bruger kun gratis og open source-software og kræver ikke kendskab til kommandolinje eller programmering til at implementere. For at illustrere metoden her, bruger vi mus embryonale stamme (mES) celler, som spontant udtrykker en markør for tidlig differentiering brachyury (tbra)21,22. Mens ingen synlige rumlige arrangement er visuelt detekterbare, metoden giver mulighed for oprettelse af et kort over præference positionering af T + celler i kolonier. Vi viser også, at Tbra mønstret kontrasterer med fraværet af en præferentiel lokalisering af cellerne, der udtrykker Id1, en direkte udlæser af knoglen morfogenetisk protein (BMP) pathway23. Vi diskuterer også de nuværende begrænsninger af metoden, og hvordan denne teknik kan tilpasses andre eksperimentelle systemer.
Her beskriver vi en metode til at analysere emergent mønster i kulturer af celler. En forenklet mikromønstrings metode bruges til at standardisere formen og størrelsen af celle kolonier, og vi præsenterer billedanalyse værktøjer og R-scripts, der gør det muligt at påvise og kvantificere mønstre inden for disse kolonier.
Den rørledning, vi foreslår, svarer i nogen grad til en tidligere offentliggjort metode31 , hvor forfatterne fokuserer på dyrkningsforholdene ved hjælp af kommercielt tilgængelige mikromønstre for at opnå reproducerbar kimlagdannelse i ESC-kolonier til undersøgelse af tidlige gastrulation-hændelser in vitro. Vores mål er mere fokuseret på at tilvejebringe en generaliserbar rørledning til opdagelse af mønster dannelse in vitro, hvor den kollektive organisation af cellerne kun kan blive tydelig efter statistisk analyse. Af denne grund leverer vi et robust billede analyse workflow, som muliggør nøjagtig identifikation og analyse af nukleare position i 3D-rum over flere kolonier (Se også “fordel og begrænsninger af mønsteret opdagelse metode” i denne drøftelse). Vi har også besluttet at udvikle en enkel in-House mikromønvertilgang, som giver et mere fleksibelt og billigere alternativ til kommercielt tilgængelige løsninger på lang sigt, som vi håber vil være nyttige for Fællesskabet.
Endelig bemærker vi, at der under revisionen af dette manuskript, en ny pakke til analyse af mønstret in vitro svarende til vores R-scripts er blevet frigivet32. Denne nye pakke accepterer tabeller med celle funktioner som input, der kan fås fra high gennemløb Imaging platforme. Vi mener, at tabellen med kerner, der genereres i trin 7 i vores protokol, principielt kan tjene som input til denne nye pakke, selv om vi ikke selv har afprøvet denne mulighed.
Metodens tilpasningsevne til andre celletyper og koloni geometrier
Vi præsenterer denne tilgang i forbindelse med at studere fremkomsten af af transkriptionsfaktorer i kulturer af pluripotente celler i nærværelse af serum. Metoden er dog let at tilpasse til andre celletyper og til serum frie kulturer, selv om det kan være nødvendigt at optimere de koncentrationer af ECM/poloxamer 407 (Se tabel 1 for testede koncentrationer og tabel 2 for en fejlfindingsvejledning). Metoden kan også tilpasses til større eller mindre størrelser af mikromønstre og til en bred vifte af former i henhold til brugernes behov. Men samtidig med at fastsætte metoden, er det vigtigt at være opmærksom på, at ikke alle form/celletype kombinationer er optimale. For eksempel, mesc udtrykke høje niveauer af E-cadherin33,34 gør det muligt for disse celler til at danne kollektive strukturer spænder områder, der er blottet for ECM. Disse celler følger ikke strengt geometrier med skarpe vinkler, eller som omfatter små huller i mønsteret. Bemærk for eksempel, at på ringen af figur 3b, cellerne er i færd med at kolonisere det centrale område. I vores hænder et mindre centralt område ikke tvinge mESC til at danne Ringformede kolonier. Det anbefales derfor stærkt at inkludere en mangfoldighed af geometrier, mens designe Mask at være i stand til at teste og identificere de optimale størrelser og krumninger, som vil være egnet til celletype valg.
En anden vigtig faktor at tage hensyn til, er længden af forsøget og spredningen sats af cellerne. For nogle hurtigt prolifererende celletyper (herunder pluripotente celler) kan det være svært at vedligeholde celler på mikromønstre over mange dage (for mESC tre dage er et maksimum). Også, såning af celler på mikromønstre ikke altid forekomme optimalt for hver koloni, så det er tilrådeligt at frø et overskud af kolonier for at have reservedele.
Fordele og begrænsninger ved mønster detekterings metoden
En særlig fordel ved metoden er evnen til at detektere “gennemsnit” mønstre ved at kombinere billedanalyse resultater fra flere replikat kolonier (figur 5). Dette kan afsløre mønster hændelser, der ikke fremgår af inspektionen af de enkelte kolonier. En ulempe ved denne “averaging” tilgang er, at det kan gå glip af visse typer af gentagne mønstre, for eksempel små pletter eller smalle striber. Men disse typer af mønster kan i stedet blive afsløret med en kombination af nøje udvalgte mønster størrelser8. Også den analyse pipeline, der beskrives her, indeholder kvantitative data på både enkelt celle-og koloni opløsning, der giver mulighed for at undersøge niveauet af interkoloni variabilitet (figur 5) eller for at udføre nabo analyse ved flere skalaer10.
En anden vigtig fordel ved den gennemsnitligt metode er, at det giver mulighed for at kort den præferentielle placering af mange markører uden at være begrænset af tilgængelige fluorophorer af detekterings kanaler. Selv om vi gør brug af kun to markører for differentiering i det arbejde, der præsenteres her, muligheden for at standardisere kolonier og ekstrakt “gennemsnit” mønstre gør det muligt at sammenligne distributions kort fra forskellige sæt af kolonier sammen for at afsløre de generelle rumlige forhold af markører til hinanden.
Desuden, selv om vores fokus her har været at studere markører for differentiering, kan analysemetoden udvides til at studere andre biologiske processer, som nukleare markører er tilgængelige. For eksempel vil mikromønstring af en cellelinje, der indeholder en fluorescens ubiquitination celle cyklus indikator35 (fucci) gøre det muligt at studere, hvordan koloni niveau geometri kan påvirke celle cyklus begivenheder i gruppen.
Fremtidige retninger
Metoden er modtagelig for medium gennemløb billedanalyse, men billed erhvervelse er i øjeblikket ikke fuldt automatiseret og kan blive begrænsende for meget store eksperimenter. De regelmæssige arrangementer af kolonier bør gøre det muligt at skabe fuldt automatiserede erhvervelse rutiner svarende til, hvad der er udviklet til enkelt celle gennemsnit20. Men fordi størrelsen af det felt, der kræves for at billedet en koloni er stor, muligvis kræver mosaikning, og fordi kolonier er tredimensionale, er det meget ønskeligt at reducere både datasæt størrelse og erhvervelse tid ved billeddannelse kun relevante kolonier. Derfor kan den fremtidige indsats være dedikeret til at udvikle et “intelligent” mikroskop, der er i stand til at identificere relevante kolonier og tilpasse billed koordinater til hver prøve. Dette vil ikke kun reducere tid og kræfter, men også forhindre potentielle operatør bias.
Analyse pipelines kan også gøres mere effektive ved at reducere antallet af trin, som brugeren skal tage. Vi har planer om at opbygge en pipeline-bygning mekanisme og til at integrere R direkte i vores software (Se også spørgsmål pickcells-API # 3 og pickcells-rjava # 1 i spørgsmålet tracker af vores kode repositories [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). Den fulde automatisering af analyseproceduren vil reducere tid og kræfter og begrænse potentielle bruger fejl.
Endelig bemærker vi, at vores analysemetode endnu ikke fuldt ud fanger den dynamiske karakter af cellulært mønster. Nogle begrænsede dynamiske oplysninger kan udvindes ved at undersøge en tidsserie af snapshot billeder8,10,36. Men at være i stand til at registrere historien om cellen befolkning er meget ønskværdigt, hvis vi ønsker at bedre at forstå, hvordan mønstret opstår. En begrænsning er, at nøjagtig sporing af individuelle celler i en 3D-tæt cellepopulation fortsat er en meget udfordrende opgave37. Vores celle detekterings metode bruger den nukleare konvolut og udfører særlig godt på tætte og overlappende cellepopulationer28. Levende journalister af den nukleare konvolut er let tilgængelige28,38 og en fordel ved mikromønten teknik er, at det kan bruges til at forhindre cellerne i at bevæge sig uden for synsfeltet under langsigtet billeddannelse. Samlet set er vi overbeviste om, at automatiseret sporing af celler vil kunne opnås ved hjælp af en kombination af nyligt etablerede værktøjer28,39,40 , og at dette bør give ny indsigt i de grundlæggende principper for selvorganisering.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af et Sir Henry Wellcome postdoktorat stipendium (WT100133 til G.B.), et Wellcome Trust Senior Fellowship (WT103789AIA til S.L.), og et Wellcome Trust PhD Studentship til (108906/Z/15/Z til D.W.). Vi er også taknemmelig over for Dr. manuel thery for hans råd om at tilpasse teknikken til fotopatterning.
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |