이 더에이 버 프레임 워크는 실험적 파라미터에 대 한 높은 분해능과 동적 제어를 통해 고 처리량의 지속적인 미생물 배양을 가능 하 게 합니다. 이 프로토콜은 복잡 한 피트 니스 실험을 수행 하기 위해 시스템을 적용 하는 방법을 보여 주며, 사용자가 여러 개별 문화권에 대 한 자동화 된 제어를 프로그래밍 하 고, 측정 하 고, 수집 하 고, 실시간으로 실험 데이터와 상호 작용 하는 방법을 안내 합니다.
연속 배양 법은 세포가 정량적으로 제어 되는 환경 조건 하에서 성장할 수 있도록 하며,이에 따라 체력 표현 형을 측정 하 고 선택에 의해 유전형이 형성 되는 방식에 대 한 이해를 향상 시키는 데 광범위 하 게 유용 합니다. 틈새 연속 배양 장치를 개발 하 고 적용 하기 위한 광범위 한 최근의 노력은 새로운 형태의 세포 배양 제어를 수행 하는 장점을 밝혔다. 여기에는 장기적인 실험적 진화에서 게놈 전체 라이브러리 선택 및 합성 유전자 회로 특성화에 이르는 연구에 대 한 맞춤형 선택 압력 정의 및 처리량 증가 등이 포함 됩니다. 이 증가 하는 수요를 충족 하기 위해 향상 된 확장성, 유연성 및 자동화를 제공 하는 지속적인 문화 플랫폼을 개발 했습니다. 에 볼 브는 다양 한 유형의 고 처리량 또는 다차원 성장 선택 실험을 수행 하기 위해 최소한의 노력으로 (재) 구성 하 고 확장할 수 있는 단일 표준화 플랫폼을 제공 합니다. 여기서, 사용자에 게는 사용자가 대규모의 연속 성장 실험을 수행 하도록 시스템을 구성 하는 방법을 설명 하는에이 볼 프레임 워크를 제공 하는 프로토콜이 제시 된다. 특히,이 프로토콜은 사용자가 시스템을 프로그래밍 하는 방법에 대해 안내 하 여, 온도와 오 스몰 농도 같은 두 가지 선택 압력을 멀티플렉스 ( 사 카로 마 세레 비시 돌연변이의 피트 니스 풍경을 정량화 하기 위해 많은이에 대 한 바이 알에 걸쳐) 해상도. 유체 및 하드웨어 레이아웃을 배열 하 여 프로그래밍 방식으로, 오픈 소스 웹 기반 소프트웨어를 통해, 물리적으로 장치를 구성 하는 방법을 보여 줍니다. 물리적으로 디바이스를 설정 하 고, 배양 루틴을 프로그래밍 하 고, 인터넷을 통해 실시간으로 실험을 모니터링 하 고 상호 작용 하 고, 후속 오프 라인 분석을 위한 바이 알을 샘플링 하 고, 실험 후 데이터 분석을 자세히 설명 하는 프로세스입니다. 이는 생물학 시스템을 연구 하 고 조작 하기 위해 복잡 하 고 높은 처리량의 세포 성장 실험을 설계 하는 데 있어 다양 한 분야의 연구원 들이이를 시작 점으로 사용할 것입니다.
연속 세포 배양 기술은 거의 70 년 전에 처음 개발 된1,2는 최근 부흥3,4를 즐기고 있다. 이것은 요인의 합류 때문 이다. 첫째, 다량의 유전형을 판독 하 고 생성 하는 것을 가능 하 게 하는 고 처리량-omics 기법 개발은5,6,이를 촉진 하는 실험적 기술에 대 한 수반 되는 수요를 창출 잘 제어 된 세포 성장과 표현 형. 이를 위해, 지속적인 문화는 응급 게놈 진보를 활용 하는 강력한 실험적 접근법을 나타낸다. 지속적인 배양은 정밀 하 게 제어 되는 (그리고 동적인) 환경 조건에서 세포 집단에 대 한 성장 선택/실험을 촉진 함으로써, 유전자 형을 표현 형7,8에 엄격 하 게 매핑할 수 있는 수단을 제공 합니다. 정량적으로 엔지니어링 된 균 주와 유기 체9를 특성화 하 고 실험실의 진화 연구10,11,12에서 적응형 유전 변화를 추적 합니다.
두 번째로, 적 층 제조 및 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어 요소와 같은 접근 가능한 프로토타이핑 기술의 출현으로 광범위 한 사용자 들이 자체 비용 효율적인 형태의 연속 배양 시스템을 설계 하 고 구축할 수 있게 되었습니다. 실험실에서 직접. 이 모든 것은 화학 능력13, turbidostat14또는 morbidostat15와 같은 연속적인 문화 기능을 수행 하는 DIY 장치 들로 구성 된 흥미로운 배열을 이끌었습니다. 불행히도 설계 된 특정 (틈새) 문제를 해결 하는 데 성공 했지만 이러한 임시 솔루션은 일반적으로 처리량 및/또는 실험적 설계의 복잡성을 확장 하는 기능이 부족 합니다.
이 볼 시스템은 지속적인 문화의 증가 하는 실험적 요구를 수용할 수 있는 단일 플랫폼을 구축 하 고, 응급 게놈 기술16 (그림 1a)의 속도와 규모를 일치 시킬 목적으로 설계 되었습니다. 에 버 버의 설계는 표준화 된 풋프린트, 모듈식 구성품 및 오픈 소스설계 원칙을 포함 하 여 다른 분야의 고도로 확장 가능한 기술에 기초 하는 공통 텐서를 구현 합니다. 따라서 새로운 틈새 애플리케이션을 위한 솔루션은 시스템을 크게 수정 하지 않고도 설계할 수 있습니다. 고도로 모듈화 된 오픈 소스 웨어, 하드웨어, 전자 및 웹 기반 소프트웨어로 구성 된이 볼 브는 비용 효율적이 고 쉽게 재구성 될 수 있는 최초의 자동 연속 배양 시스템으로, 사실상 모든 유형의 높은 처리량의 성장 실험. 각 문화권을 제어 하는 데 필요한 모든 센서와 액추에이터를 제공 하는 모듈형의 프로그래밍 가능 스마트 슬리브를 통해,에이 더 스는 처리량과 개별 배양 조건의 제어를 모두 확장할 수 있습니다. 또한 웹 기반 플랫폼으로 서, 데이터와 정보를 원격 컴퓨터와 실시간으로 교환 하 여 수백 개의 개별 문화를 동시에 모니터링 하 고 임의로 정의 된 제어를 통해 자동화 된 문화 섭 동을 허용 합니다. 알고리즘.
이전 작업16에서,에 버 버의 강력한 성능은 장기간의 작동에 대 한 장기적인 실험에서 입증 되었으며, 대장균 및 s. 소 뇌 에서 다양 한 유기 체 를 육성 할 수 있는 능력을 증명 했습니다. 미생물. 일련의 뚜렷한 성장 선택 실험이 수행 되었고, 여기서 프로그래밍 방식으로 정의 된 다차원 선택 구배는 개별적인 배양 조건의 배열에 걸쳐 적용 되었고, 그 결과 셀룰러 피트 니스 풍경은 정량. 여기서 목표는 시스템을 설계 하는 데 사용 하는 방법에 대 한 설명과 이러한 유형의 실험을 제공 하는 것입니다. 예시 적인 예로서, 온도 및 삼투성 스트레스로 구성 된 2 차원 환경 구배에 걸친 s. 세레 비시 돌연변이 체의 피트 니스 지형을 정량화 하는 방법이 제시 된다. 이 프로토콜은 소프트웨어를 사용 하 여 16 개의 병렬 연속 배양 각각에 대 한 사용자 정의 된 탁도 및 온도 제어 루틴을 설정 하 고 물리적으로,이 실험에 대 한이 시험에 대 한 사용자를 구성 하는 과정을 안내 합니다. 유체 레이아웃을 통해 다른 염 농도의 매개체를 적절 하 게 라우팅합니다. 이 프로토콜은 다양 한 연구와 분야에 대 한 다양 한 자동화 된 연속 배양 실험을 실행 하기 위해에 버 버를 구성 하는 일반적인 루 브릭 역할을 해야 합니다.
성장 선택은 세포 집단 간의 표현 형 차이를 생성 하 고 특성화 하는 데 광범위 하 게 사용 되는 생물학에서 없어서는 안될 도구입니다. 배치 문화는 제한 된 방법으로 성장 선택을 허용 하지만, 연속 배양 기법은 이러한 실험의 제어 및 예측 가능성을 극적으로 확장 하 고, 선택의 형태와 역학에 대 한 정밀한 조절을 발휘 하 여 반복 가능한 정량적 결과22. 연속 배양은 고 다양성 라이브러리(20,23,24,25)에 대 한 선택을 엄격 하 게 제어 하 고, 복잡 한 적응 체계를 실험적으로 구현 하 고 진화 하는발전11,12,27. 또한 연속 배양은 정량적으로 제어 되는 다양 한 조건에서 세포를 정밀 하 게 특성화 하 여 복잡 한 유전 시스템을 더 잘 이해 하 고 설계 된 생체 생산 균 주를 최적화할 수 있습니다. , 28.
그러나, 선택적인 조건에 미묘한 변경은 생물학 결과에 있는 극적인 변경으로 이끌어 낼 수 있기 때문에 연속적인 문화를 위한 보편적인 프로토콜이없습니다,29,30. 실험 자는 선택 영역 사이에서 선택 하 고 실험적 프로토콜과 장비를 적절 하 게 조정할 수 있어야 합니다. 제어 매개 변수 중에서 선택할 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 시스템은 이상적으로 복잡 한의 상호 작용 입력을 해독 하는 데 필요한 고도의 병렬 실험에서 동시에 여러 매개 변수를 독립적으로 관리 할 수 있을 만큼 정교 합니다. 생물학적 시스템 (예: epistasis). 사용자가 고도로 전문화 된 환경 틈새 시장을 지정 하기 위해 문화 조건 및 유체 함수 간의 피드백 제어를 임의로 프로그래밍할 수 있도록 해 주는이 문제를 해결 합니다.
현재 설정의 한계를 극복 하 고 제어 매개 변수를 확장 하거나 변경 하기 위해 스마트 슬리브는 새로운 센서 또는 액추에이터를 추가 하기 위해 쉽게 재설계 될 수 있습니다. 추가적으로, 유리병 부피를 감소 시키는 것은 연속적인 문화에서 중요 할 수 있는 매체 지출을 감소 시킬 것입니다. 현재 설계는 온도, 배양 교 반, 광 유도, 탁도 및 유체 역학의 측정 및 제어를 허용 하지만 다른 매개 변수는 바이 알에서 샘플링 하 여 외부적으로 측정 해야 합니다. 현재 작업에는 루시퍼 라 제를 통해 효소 활성을 모니터링 하 고, 용 존 산소와 pH를 직접에 비에이 터로 조절 하는 기능이 포함 되어 있습니다. 또한,이 작품에서 설명 하지는 않았지만,에 비에 스는 새로운 millifluidic 다중화 장치 (16 )와의 인터페이스를 통해 대규모 통합 (전자에서 유래 하 고 마이크로 fluidics에 의해 채택)의 원칙을 도출 하 여 저렴 한 방식으로 더 복잡 한 유체 처리 가능 (예: 다중화 된 유체 입력, 바이 알 유리병 전송). 이러한 웨어 모듈은 실험실에서 완벽 하 게 설계 및 제조 될 수 있으므로 사용자는 자동화 된 유체 루틴에서 프로그래밍 방식으로 다양 한 밸브 조합을 구현 하 여 유체의 경로를 조정 합니다. 이를 통해 사용자는 전통적으로 지속적인 문화에 사용 되는 견고한 유체 설계를 극복할 수 있을 뿐만 아니라, 비용이 많이 드는 제어 요소 (예: 연동 펌프)를 사용 하 여 높은 처리량으로 유체 기능을 확장할 수도 있습니다. 마지막으로, 우리는 샘플링 문화가 복잡 한 더 길고 큰 실험 동안 수동 상호 작용의 한계를 극복, 이러한 밀리 유체 및 DIY 구성 요소를 활용 하는 자동 샘플링 플랫폼을 통합 하기를 바라고 있다.
플랫폼을 물리적으로 수정 하는 것 외에도 웹 기반 소프트웨어는 사용자가 사용자 정의를 작성, 편집 및 공유할 수 있도록 하 여 완전히 자동화 된 피드백 지원 문화 프로그램 (예: turbidostat)을 생성 하 여 새로운 자유도를 엽니다. 사용자는 동일한 선택 체계에서 미묘한 변형으로 매개 변수 범위를 프로그래밍 방식으로 스윕 하거나, 새로운 조합의 제어 알고리즘을 연결 하 여 원하는 수의 정교한 선택 구성표를 지정할 수 있습니다. 더욱이, 실시간으로 쉽게 배양을 모니터링 하는 능력은 실험이 수행 되는 방식을 변형 한다. 실시간 모니터링을 통해 사용자는 1) 실행 간의 일관성을 확인 하 고, 생물 생산 응용 분야의 중요 한 기능과 높은 처리량 실험을 수행 하 고, 필요한 경우 실험 중에 개입 하 여 발생 하는 도전적인 균 주를 해결할 수 있습니다. 성장 또는 생물 막 형성이 불량 하거나 사용자 오류 (예: 오염)를 진단 합니다. 마지막으로, 여러 데이터 스트림이 각 개별 문화권에 대해 실시간으로 수집 되 고 해석 되 면,이에 버 버는 고밀도의 데이터를 생성 하 여 새로운 다운스트림 분석을 위한 기계 학습 접근법을 촉진할 수 있습니다.
적합성 특성화, 라이브러리 선택 및 실험실 진화에 대 한 입증 된 용도 외에도, 우리는 통합 된 fluidics를 사용 하 여이 볼에 구현 하기 위해 잘 익은 관련 필드의 수를 봅니다. 미 생물군 유 전체 시료 실험을 통해 통제 된 환경에서 지역사회의 안정성을 분석 할 수 있습니다.31,32, 컬쳐로 마이크 기법을 사용 하 여 마이크로 바이오 타 조성33, 또는 동적으로 종을 혼합 하 여 식민지의 생태 역학을 심문 또는 침략34,35. 생체 분자의 연속 된 진화를 위한 수많은 방법 들이 장치 뿐만 아니라26,36,37에 쉽게 구현 될 수 있어 이러한 시스템의 접근성 및 처리량이 크게 향상 되었습니다. 동적이 고 높은 처리량의 자연에서 미디어 구성, 온도 및 긴장과 같은 성장 조건을 최적화 하는 능력은 산업 바이오 제조 응용 분야에 최적화 노력을 기울일 수 있습니다9. 우리는 또한 단일 세포와 인구 모두에서 세포 배양의 성장과 분석을 위한 완전 자동화 된 시스템을 제공 하는 폐 회로 방식으로 현미경 및 유 세포 분석기와 같은 다른 분석 기법과 수직적 통합을 구상 하 고 있습니다. 수준. 더욱이, 용기를 밀봉 하 고 가스 함량을 조절 하는 것과 같은 스마트 슬리브에 대 한 일부 하드웨어 수정으로,에이 볼은 잠재적으로 현 탁 포유류 세포와 같은 광범위 한 세포 유형의 성장을 지원 하도록 적응 될 수 있었다. 또한 혐 기성 세포 배양을 위한 혐 기성 챔버에 전체 프레임 워크를 배치 하는 것이 가능 하다. 앞으로는 중앙 집중식 클라우드 인프라로 소프트웨어 프레임 워크를 구축 하는 것을 목표로 하 고 있으며,이를 통해 사용자는 실험실에 물리적으로 존재할 필요 없이 데이터를 원격으로 쉽게 구성, 분석 및 공유할 수 있습니다. 데이터 큐레이터의 역할을 하는 클라우드 인프라는 실험에 대 한 대규모 메타 분석에도 큰 도움을 줄 것입니다. 지속적인 문화에서 자동화와 혁신을 촉진 하 여 가능한 성장 선택 실험의 범위를 크게 확대할 것으로 예상 됩니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 시스템의 설계에 그의 도움에 대 한 b. 스태퍼 드, 그리고 h. 칼 릴, a. 솔 타 니 탄, a. 일, s. 파이프 및 시스템의 건설에 대 한 도움을 위한. 우리는 전자 설계 시설 (EDF), 엔지니어링 제품 혁신 센터 및 서비스를 위해 보스턴 대학에서 컴퓨팅을 위한 하리리 연구소에서 소프트웨어 & 응용 프로그램 혁신 연구소 (항해)를 인정 합니다. 이 작품은 NSF 경력 상 (1350949에 A.S.K.)에 의해 지원 되었으며 DARPA는 HR0011-0091 및 HR0011 0014를 A.S.K.에 부여 합니다. A.S.K.는 또한 NIH 감독의 새로운 혁신 상 (1DP2AI131083-01), DARPA 젊은 교수진 상 (D16AP00142) 및 컴퓨팅에서의 NSF 원정 으로부터의 자금 조달을 인정 합니다 (1522074).
5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
eVOLVER Unit | FynchBio | ||
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
Pipettes | Eppendorf | ||
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |