Summary
이 더에이 버 프레임 워크는 실험적 파라미터에 대 한 높은 분해능과 동적 제어를 통해 고 처리량의 지속적인 미생물 배양을 가능 하 게 합니다. 이 프로토콜은 복잡 한 피트 니스 실험을 수행 하기 위해 시스템을 적용 하는 방법을 보여 주며, 사용자가 여러 개별 문화권에 대 한 자동화 된 제어를 프로그래밍 하 고, 측정 하 고, 수집 하 고, 실시간으로 실험 데이터와 상호 작용 하는 방법을 안내 합니다.
Abstract
연속 배양 법은 세포가 정량적으로 제어 되는 환경 조건 하에서 성장할 수 있도록 하며,이에 따라 체력 표현 형을 측정 하 고 선택에 의해 유전형이 형성 되는 방식에 대 한 이해를 향상 시키는 데 광범위 하 게 유용 합니다. 틈새 연속 배양 장치를 개발 하 고 적용 하기 위한 광범위 한 최근의 노력은 새로운 형태의 세포 배양 제어를 수행 하는 장점을 밝혔다. 여기에는 장기적인 실험적 진화에서 게놈 전체 라이브러리 선택 및 합성 유전자 회로 특성화에 이르는 연구에 대 한 맞춤형 선택 압력 정의 및 처리량 증가 등이 포함 됩니다. 이 증가 하는 수요를 충족 하기 위해 향상 된 확장성, 유연성 및 자동화를 제공 하는 지속적인 문화 플랫폼을 개발 했습니다. 에 볼 브는 다양 한 유형의 고 처리량 또는 다차원 성장 선택 실험을 수행 하기 위해 최소한의 노력으로 (재) 구성 하 고 확장할 수 있는 단일 표준화 플랫폼을 제공 합니다. 여기서, 사용자에 게는 사용자가 대규모의 연속 성장 실험을 수행 하도록 시스템을 구성 하는 방법을 설명 하는에이 볼 프레임 워크를 제공 하는 프로토콜이 제시 된다. 특히,이 프로토콜은 사용자가 시스템을 프로그래밍 하는 방법에 대해 안내 하 여, 온도와 오 스몰 농도 같은 두 가지 선택 압력을 멀티플렉스 ( 사 카로 마 세레 비시 돌연변이의 피트 니스 풍경을 정량화 하기 위해 많은이에 대 한 바이 알에 걸쳐) 해상도. 유체 및 하드웨어 레이아웃을 배열 하 여 프로그래밍 방식으로, 오픈 소스 웹 기반 소프트웨어를 통해, 물리적으로 장치를 구성 하는 방법을 보여 줍니다. 물리적으로 디바이스를 설정 하 고, 배양 루틴을 프로그래밍 하 고, 인터넷을 통해 실시간으로 실험을 모니터링 하 고 상호 작용 하 고, 후속 오프 라인 분석을 위한 바이 알을 샘플링 하 고, 실험 후 데이터 분석을 자세히 설명 하는 프로세스입니다. 이는 생물학 시스템을 연구 하 고 조작 하기 위해 복잡 하 고 높은 처리량의 세포 성장 실험을 설계 하는 데 있어 다양 한 분야의 연구원 들이이를 시작 점으로 사용할 것입니다.
Introduction
연속 세포 배양 기술은 거의 70 년 전에 처음 개발 된1,2는 최근 부흥3,4를 즐기고 있다. 이것은 요인의 합류 때문 이다. 첫째, 다량의 유전형을 판독 하 고 생성 하는 것을 가능 하 게 하는 고 처리량-omics 기법 개발은5,6,이를 촉진 하는 실험적 기술에 대 한 수반 되는 수요를 창출 잘 제어 된 세포 성장과 표현 형. 이를 위해, 지속적인 문화는 응급 게놈 진보를 활용 하는 강력한 실험적 접근법을 나타낸다. 지속적인 배양은 정밀 하 게 제어 되는 (그리고 동적인) 환경 조건에서 세포 집단에 대 한 성장 선택/실험을 촉진 함으로써, 유전자 형을 표현 형7,8에 엄격 하 게 매핑할 수 있는 수단을 제공 합니다. 정량적으로 엔지니어링 된 균 주와 유기 체9를 특성화 하 고 실험실의 진화 연구10,11,12에서 적응형 유전 변화를 추적 합니다.
두 번째로, 적 층 제조 및 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어 요소와 같은 접근 가능한 프로토타이핑 기술의 출현으로 광범위 한 사용자 들이 자체 비용 효율적인 형태의 연속 배양 시스템을 설계 하 고 구축할 수 있게 되었습니다. 실험실에서 직접. 이 모든 것은 화학 능력13, turbidostat14또는 morbidostat15와 같은 연속적인 문화 기능을 수행 하는 DIY 장치 들로 구성 된 흥미로운 배열을 이끌었습니다. 불행히도 설계 된 특정 (틈새) 문제를 해결 하는 데 성공 했지만 이러한 임시 솔루션은 일반적으로 처리량 및/또는 실험적 설계의 복잡성을 확장 하는 기능이 부족 합니다.
이 볼 시스템은 지속적인 문화의 증가 하는 실험적 요구를 수용할 수 있는 단일 플랫폼을 구축 하 고, 응급 게놈 기술16 (그림 1a)의 속도와 규모를 일치 시킬 목적으로 설계 되었습니다. 에 버 버의 설계는 표준화 된 풋프린트, 모듈식 구성품 및 오픈 소스설계 원칙을 포함 하 여 다른 분야의 고도로 확장 가능한 기술에 기초 하는 공통 텐서를 구현 합니다. 따라서 새로운 틈새 애플리케이션을 위한 솔루션은 시스템을 크게 수정 하지 않고도 설계할 수 있습니다. 고도로 모듈화 된 오픈 소스 웨어, 하드웨어, 전자 및 웹 기반 소프트웨어로 구성 된이 볼 브는 비용 효율적이 고 쉽게 재구성 될 수 있는 최초의 자동 연속 배양 시스템으로, 사실상 모든 유형의 높은 처리량의 성장 실험. 각 문화권을 제어 하는 데 필요한 모든 센서와 액추에이터를 제공 하는 모듈형의 프로그래밍 가능 스마트 슬리브를 통해,에이 더 스는 처리량과 개별 배양 조건의 제어를 모두 확장할 수 있습니다. 또한 웹 기반 플랫폼으로 서, 데이터와 정보를 원격 컴퓨터와 실시간으로 교환 하 여 수백 개의 개별 문화를 동시에 모니터링 하 고 임의로 정의 된 제어를 통해 자동화 된 문화 섭 동을 허용 합니다. 알고리즘.
이전 작업16에서,에 버 버의 강력한 성능은 장기간의 작동에 대 한 장기적인 실험에서 입증 되었으며, 대장균 및 s. 소 뇌 에서 다양 한 유기 체 를 육성 할 수 있는 능력을 증명 했습니다. 미생물. 일련의 뚜렷한 성장 선택 실험이 수행 되었고, 여기서 프로그래밍 방식으로 정의 된 다차원 선택 구배는 개별적인 배양 조건의 배열에 걸쳐 적용 되었고, 그 결과 셀룰러 피트 니스 풍경은 정량. 여기서 목표는 시스템을 설계 하는 데 사용 하는 방법에 대 한 설명과 이러한 유형의 실험을 제공 하는 것입니다. 예시 적인 예로서, 온도 및 삼투성 스트레스로 구성 된 2 차원 환경 구배에 걸친 s. 세레 비시 돌연변이 체의 피트 니스 지형을 정량화 하는 방법이 제시 된다. 이 프로토콜은 소프트웨어를 사용 하 여 16 개의 병렬 연속 배양 각각에 대 한 사용자 정의 된 탁도 및 온도 제어 루틴을 설정 하 고 물리적으로,이 실험에 대 한이 시험에 대 한 사용자를 구성 하는 과정을 안내 합니다. 유체 레이아웃을 통해 다른 염 농도의 매개체를 적절 하 게 라우팅합니다. 이 프로토콜은 다양 한 연구와 분야에 대 한 다양 한 자동화 된 연속 배양 실험을 실행 하기 위해에 버 버를 구성 하는 일반적인 루 브릭 역할을 해야 합니다.
Protocol
1. 미디어, 바이 알 및 접종 준비
참고: 이 프로토콜은 사용자가 이미에이 버 시스템을 보정 했으며 이전 작업16에 설명 된 스마트 슬리브 구성을 사용 한다고 가정 합니다. 스마트 슬리브는 쉽게 재설계 되거나 수정 되지만 볼륨 및 제어 매개 변수의 설정 세부 사항은 대체 구성에 따라 다를 수 있습니다.
- 실험 전날, 30 ° c에서 BY4741 이상 300으로 설정 된 진 탕 인큐베이터에서 r.p.m.의 참조 스트레인과 변형 균 주를 2 mL 밤새 액상 배양 하 여 준비 한다.
- 멸 균 된 YPD 매체를 튜브가 장착 된 깨끗 하 고, 오토 클레이 브 병으로 전달 합니다. 대안적으로, 매체는 튜브가 미리 장착 된 병에 직접 가압 멸 균 될 수 있다.
참고: 병은 캡에 구멍을 뚫 고 제자리에 고정 하기 위해 커넥터를 통해 튜브를 실행 하 여 튜브에 적합 합니다. 재료 표를 참조 하십시오. - 각 유리병에 교 반 바를 추가 하 고 유입 및 불렀습니다 빨 대가 장착 된 바이 알 뚜껑을 조입니다. 육안 검사를 통해 모든 구성품이 깨끗 한지 확인 합니다.
- 바이 알을 오토 클레이 버블 랙에 넣고, 호 일로 덮고, 20 분의 멸 균 단계에서 중력 또는 진공 사이클로 오토 클레이 브를 사용 하십시오.
2. 실험 설정
- 3 개의 큰 비 커에서 10% 표 백제 500, 200 mL의 10% 표 백제 및 300 mL의 70% 에탄올을 준비 하십시오.
- 에이 버 디바이스의 스위치를 사용 하 여, 컴퓨터에서 5v 전원 공급 장치를 켜고 5 초 동안 기다린 다음 12v 전원 공급 장치를 켭니다.
- 같은 미디어 병에서 여러 개의 튜브를 실행 하는 경우, 튜브 스플리터와 여러 미디어 입력 라인을 연결 합니다. 맞춤형 튜빙 스플리터는 Luer 컴포넌트로 구성할 수 있습니다.
- 제 1 표 백제 비 커에 미디어 입력 라인을 서브 머지 하 고, 제 2 표 백제 비 커에 매체 불렀습니다 라인을 한다. 두 번째 비 커에 미디어 입력 라인의 다운스트림 끝을 불렀습니다 라인으로 배치 합니다. 폐기물 carboy에 폐기물 라인을 배치 합니다.
- 실험 중에 생성 된 폐기물을 살 균 하는 큰 빈 폐기물 carboy에 표 백제를 1-2 L을 추가 합니다. 안전 코디네이터와 상의 하 여 폐기물의 적절 한 폐기를 보장 하십시오.
- 터치 스크린을 사용 하 여 설치 섹션으로 이동 하 고 20 초 동안 모든 펌프를 실행 하 여 유체 라인을 10% 표 백제로 채웁니다. 실행 중에는 모든 라인이 채워져 있고 펌프가 정상적으로 작동 하 고 있는지 육안 검사를 통해 확인 하십시오. 표 백제 들이 소독을 위해 30 분 이상 라인에 앉을 수 있도록 하십시오.
- 라인이 더 이상 침수 될 때까지 터치 스크린 응용 프로그램을 사용 하 여 다시 펌프를 실행, 가능한 한 표백의 많은 얻을 수 있는 라인을 통해 공기를 밀어.
- 상기와 같이, 에탄올로 라인을 충전 하 고 공기로 플러싱 하 여 상기와 같이 매체 입력 라인에 배치 한다.
참고: 에탄올이 빨리 죽 게 되 면 살 균을 위해 30 분을 기다릴 필요가 없습니다. - Luer 커넥터를 사용 하 여 미디어 병에 미디어 입력 라인을 부착 하 고 미디어가 완전히 라인을 통과할 때까지 펌프를 실행 하 여 잔류 에탄올을 배출 합니다.
- 소독 된 바이 알을에 그 라인의 스마트 슬리브에 부분적으로 삽입 하 고 선 위에 컬러 코딩에 따라 적절 한 위치에 라인을 연결 합니다. 짧은 유입 빨 대에 입력 라인을 부착 하 고 긴 불렀습니다 짚에 라인을 낭비 하 여 시작 합니다.
주의: 느슨한 연결 또는 잘못 라우팅된 회선을 확인 하는 것이 중요 합니다. 그렇게 하지 않으면 오버플로우가 발생 하 고 스마트 슬리브가 손상 될 수 있습니다. - 모든 펌프를 10 초 단위로 실행 하 여 바이 알을 미디어로 채웁니다. 육안 검사를 통해 불렀습니다 펌프는 오버플로 방지를 위해 불렀습니다 빨 대를 통해 미디어를 효율적으로 제거 합니다. 불렀습니다 빨 대가 효율적으로 작동 하지 않는 것으로 보이는 경우에는 유체 라인 연결과 연동 펌프를 점검 하십시오. 필요에 따라 부품을 수정 하거나 교체 합니다.
- 스마트 슬리브가 완전히 감싸 질 때까지 바이 알을 밀어 넣으십시오.
- 대화식 설정 페이지에서이 더 버 터치 스크린을 사용 하 여 실험적 파라미터에 대 한 초기 조건을 설정 합니다. 모든 바이 알에 대해 온도를 30°c로 설정 하 고 10으로 저 어 줍니다. 이것은 모든 바이 알을 선택 하기 위해 터치 스크린에서 손가락을 드래그 하 여 한 번에 모든 유리병에 대해 수행 할 수 있습니다.
3. 소프트웨어 구성 및 알고리즘 문화 루틴 프로그래밍
- 컴퓨터의에도 대시보드 대시보드에서 실험 관리자 페이지로 이동 합니다. 실험 탐색기 패널 또는 기존 실험에서 기본 실험을 시작 점으로 선택 하 고 새로 복제를 클릭 합니다.
참고: 실험 정의가 실험 관리자에 저장 되는 리포지토리에 GitHub 링크를 붙여넣어 다른 그룹의 실험을 사용할 수 있습니다. - 실험이 실행 되는 실험 이름과이에 대 한 장치를 지정 합니다. 페이지에서 이러한 필드를 수정 하 여 원하는 보정 설정을 선택 했는지 확인 합니다.
- 바이 알 선택기 및 매개 변수 정의 창을 사용 하 여 실험 조건을 설정 합니다. 예를 들어, 바이 알 0-4의 온도를 30°c로 설정 하려면 바이 알 선택기에서 바이 알을 선택 하 고 매개 변수 정의를 30으로 설정한 후 설정을클릭 합니다. OD에 대해이를 반복 하 여 각 바이 알에 대 한 상한 및 하 한 임계값을 설정 합니다.
- 실험적 매개 변수 정의가 완료 되 면 저장 을 클릭 하 여 실험을 저장 하 고 시작 을 클릭 하 여 실행 합니다.
4. 실시간으로 실험 및 모니터링 시작
- 실험이 진행 되 면 대화형 대시보드에서 실시간 데이터 패널로 이동 합니다. 각 바이 알에 대해 OD 값이 0으로 유지 되 고 있는지, 그리고 그래프를 탐색 하 여 온도가 프로그래밍 된 수준으로 진행 되는지 확인 합니다.
- 접종을 준비 하려면, 하룻밤 배양의 OD를 측정 하 고, 약 25 mL의 바이 알 부피를 가정 하 여 원하는 배 희석을 계산 하 고, 시료 채취 포트를 통해 접종 량을 바이 알에 피 펫 계산 합니다. 예를 들어, OD 2.0에 있는 하룻밤 배양 물에서 약 0.05의 배양 유리 병에서 원하는 시작 OD에 도달 하기 위하여, 세포의 625 μ l는 각 바이 알에 첨가 되어야 한다.
- 대시보드에서 그래프를 확인 하 여 그에 따라 OD 그래프가 업데이트 되었는지 확인할 수 있습니다. 원하는 시작 OD 근처에 증가 그래프에서 볼 수 있어야 합니다.
- 대시보드에서 해당 그래프를 탐색 하 여 실험 전반에 걸쳐 OD, 온도, 성장률, 세대 및 미디어 사용량과 같은 다양 한 데이터 유형을 추적 합니다. 이러한 값은 사용자 (예: 일정 timepoints)에 의해 실험적 결정을 알리거나 자동화 된 피드백을 수행 하기 위해 함수에 사용 될 수도 있습니다.
- 미디어 병 중간 실험을 바꾸려면 실험 관리자 패널에서 실험을 일시 중지 하 여 펌프 이벤트가 발생 하지 않도록 합니다. 빈 병에서 미디어 라인을 빠르게 풀고 새 병에 연결 하십시오. 오염을 방지 하기 위해 튜브의 끝을 만지지 마십시오. 실험 관리자에서 실험을 재개 합니다.
5 .에이 버 바이 알의 효 모 세포 채취
- 단백질 합성을 억제 하 고 유 세포 분석을 위해 효 모 세포를 고정 하는 사이클로 헥 이미 드 용액을 준비 한다. 15 mL 원추형 튜브에서, 5 초 동안 12 mL의 PBS 및 12 μ l의 20 mg/mL 사이클로 헥 사 미드와 소용돌이를 추가 합니다.
- 멀티 채널 파이 펫을 사용 하 여, 96-웰 라운드 바닥판의 각 웰에 분 취 액 100 μ l.
- 판을 알루미늄 호 일에 싸서 빛을 차단 하 고 필요할 때까지 4°c에서 보관 하십시오.
- 확장 된 길이 200 μ l 팁을 사용 하 여 바이 알 뚜껑의 샘플링 포트를 통해 파이 펫을 샘플로 추출 합니다.
- 100 μ l을 바이 알에서 고정 플레이트에 잘 넣고, 2 ~ 3 배를 파이 펫 팅으로 혼합 한 다음 호 일에 회복 하 고 4 ° c로 플레이트를 돌려줍니다.
6. 실험 분해 및 정리
- 대형 비 커에서 1l의 10% 표 백제 및 2 500 mL DI 워터 솔루션을 준비 하십시오.
- 실험 관리자 패널에서 stop 명령을 전송 하 여 실험을 중지 합니다. 데이터는 여전히 클라우드 지원 데이터베이스에 저장 되며 대시보드의 실시간 데이터 패널에서 나중에 보거나 오프 라인 분석을 위해 다운로드할 수 있습니다.
- 스마트 슬리브에 바이 알을 제거 하 고 오토 클레이 브 랙에 넣어 후속 단계에서 오버플로를 방지 하십시오.
- 미디어 병에서 용지 입력 라인을 풀고 10% 표 백제를 비 커에 넣습니다. 라인 및 바이 알을 살 균 하는 설치에서와 같이, 사용자 인터페이스에서 펌프를 실행 합니다.
- 디 워터에서 바이 알과 서브 머지 라인에서 라인을 분리 합니다. 펌프를 실행 하 여 모든 표 백제를 시스템에서 먼저 세척 한 다음 공기를 사용 하십시오.
- 먼저 12v 전원 공급 장치를 끄고 5 초 동안 기다린 다음 5v 전원 공급 장치를 꺼서에 대 한 기능을 해제 합니다.
- 볶음 바와 뚜껑을 10% 표 백제에 담근 다음 디 워터로 헹 궈 주세요. 그들을 통해 DI 물을 실행 하 여 각 캡의 유입 및 불렀습니다 빨 대를 씻어 해야 합니다. 필름이 벽에 형성 되어있는 경우 시험관 브러시를 사용 하 여 튜브를 스크럽.
- 폐기물을 적절 하 게 폐기 하 고 폐기 용기를 철저히 헹 굽 니다.
주의: 폐 용기는 10% 표 백제, 살 균 된 세포 배양 폐기물 및 미 량의 에탄올 혼합물을 함유 할 것 이다. 적절 한 취급 및 폐기는 안전 코디네이터에 게 문의 하십시오.
7. 분수 인구의 유 세포 분석을 이용한 체력 정량화
- 적절 한 형광 채널 및 검출기 (16)를 구비한 유 세포 측정기를 이용 하 여 섹션 5에서 수집 된 샘플을 분석 한다.
- 샘플 당 적어도 1만 이벤트를 획득 하 고 전방 및 측면 산란 데이터를 사용 하 여 온전한 세포를 게이트 합니다.
- 적절 한 형광 채널 (예컨대 GFP)에 기초한 게이트는 각 인구의 소수 분포를 결정 한다.
- 컴퓨터에서 ' 내보내기 ' 버튼을 클릭 하 여 실험 관리자 페이지에서 원하는 위치에 데이터를 저장 합니다.
- 에 대 한 데이터 파일에서 각 바이 알에 대 한 각 timepoint에 의해 완료 된 세대 수를 확인 합니다. 이에 대 한 코드에서 세대는 각 희석 이벤트 사이에 OD 데이터를 먼저 분할 하 여 계산한 다음 각 세그먼트가 각 세그먼트
에 대 한 기본 지 수 인 r, 성장률16에 적합 합니다. 다음 공식을 사용 하 여 기간 동안의 세대 수를 계산 합니다.
- 샘플을 촬영 한 시점에서 상기 계산 으로부터의 유동 세포 분석 데이터 대 생성 수 로부터 라벨링 및 비 표지 된 모집단의 로그 비율을 플로팅합니다. 선형 영역을 식별 하 고 다음 방정식에 따라 기울기를 맞춥니다. 이 슬로프는 일반적으로 경쟁력 있는 피트 니스18,19로 정의 됩니다.
에 대 한 기본 지 수 인 r, 성장률16에 적합 합니다. 다음 공식을 사용 하 여 기간 동안의 세대 수를 계산 합니다.
Representative Results
여기에 설명 된 프로토콜은 온도와 염도의 2 차원 응력 구배에 걸쳐 s. 세레 비시 의 유전 변종에 대 한 피트 니스 맵을 구성 하는 데 사용 되었습니다. 구체적으로, 각각의 변형 균 주에 대해, 우리는 16 개의 다른에 있는 형광 표지 된 기준 균 주 (통합 된 헌법 M신생아 그린 리포터와 BY4741)에 대 한 쌍별 경쟁 실험을 수행 하기 위해 사용 이러한 응력의 조합 (그림 1). 변이체의 경우, 2 개의 녹아웃 균 주가 응력 조건 축 중 하나에 민감 하다 고 예측 되는 각각의 것을 선택 하였으며, 높은 온도에서의 피트 니스 불량을 가지고 있는 것으로 보고 된 δ prx1 및 고 적합성 결함을 가진 δ p s 2 염 농도21. 제어 변형으로 서, 라벨이 없는 야생 형 BY4741 스트레인이 사용 되었으며, 레퍼런스 스트레인과 유사 하 게 수행 될 것으로 예상 된다. 전체적으로, 이러한 3 72 시간 경쟁 실험은 한 대의 컴퓨터에서 모두 실행 되는 세 가지에이 버 (16 개 바이 알) 장치에 걸쳐 48 바이 알에서 동시에 진행 되었습니다.
각 실험 중에 생성 되는 대량의 데이터를 탐색 하는 데 사용할 수 있는 대화식 대시보드가 제공 됩니다 (그림 2a). 도 2b에는 단일이 볼 디바이스의 16 개 바이 알 모두에 걸친 대표적인 OD 트레이스 들이 도시 되어 있다. 각 트레이스는 OD에 대 한 피드백을 사용 하 여 희석을 트리거하고 좁은 밀도 범위 (이 경우 0.2-0.3)에서 배양을 유지 하는 turbidostat 제어 알고리즘에서 특징적인 톱니 패턴을 표시 합니다. OD 및 온도 데이터는 지속적으로 측정 되 고, 클라우드 지원 데이터베이스로 스트리밍되고, 실시간으로 업데이트 됩니다. 지속적으로 스트리밍되는 데이터에서 상위 지표 (예: 성장률, 누적 세대)를 계산 하 여 대시보드 (그림 2c)에 표시 하 고 다른 선택 체계 (예: morbidostat)에서 피드백 파라미터로 사용할 수도 있습니다.
피트 니스 맵을 생성 하기 위해, 우리는 참조 변형이 유 세포 분석기 측정과에이 지 성장 데이터를 모두 통합 하 여 변형 변형 률과 경쟁 하는 속도를 측정 합니다. 특히, 인구 분 획은 각 timepoint 샘플의 유 세포 분석 데이터를 사용 하 여 참조 변형 률에 대 한 변형 변형의 로그 비율로 계산 됩니다. 각 문화권 및 시간 지점에 대 한 세대의 경과 된 수는 각 희석 기간에 대 한 증가 속도 데이터에서 보간됩니다. 세대에 대 한 로그 비율을 플로팅하 면 조건 간의 질적 차이가 나타나기 시작 합니다 (그림 3a). 피트 니스를 계산 하기 위해 기울기는 변형 변형이 참조 스트레인과 경쟁 하는 방식을 설명 하는 정량적 체력 값 (부호 및 비율 모두 포함)을 산출 하는 각 구획18의 선형 부분을 통해 맞습니다 ( 도 3B). 이 실험에서 음수 피트 니스 값은 변형 변형이 참조 변형에 의해 능가 된다는 것을 나타냅니다. 모든 피트 니스 계산에서 히트 맵을 구성 하는 것은 2 차원 피트 니스 풍경의 시각화를 가능 하 게 하 여 스트레인과 조건 사이의 성능에 미묘한 정량적 차이를 드러냅니다 (그림 3c).
피트 니스 히트 맵에서는 각 변형 변형이 다양 한 방식으로 나타나는 피트 니스 결함을 나타내는 것을 볼 수 있습니다. Δ Prx1 은 높은 온도에 주로 민감 하지만, 소금 스트레스는 체력 결함을 증가, 첨가제 효과를가지고 나타납니다. 반대로, δ Pbs2 는 온도 축을 따라 최소한의 차이로 높은 염 농도에 반응 하 여 주로 피트 니스 결함을 나타낸다. 이러한 결과는 특히 여러 환경 스트레스 요인의 상호 작용을 해독 하기 위한 고해상도 선택 실험의 효용을 강조 합니다,이는 첨가제를 가질 수 있는, 시너지, 또는에 피 착 효과.
마지막으로, 어떤 경우에는, 특히 심한 스트레스 조건에 대 한 피트 니스 계산은 과장 되거나 왜곡 된 결과를 초래할 수 있다는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다. 예를 들어, δ Pbs2 는 기준 스트레인에 대하여 39 ° c/1 M 염화 나트륨 조건에서 가파른 양의 기울기를 나타내는 것으로 나타난다 (도 3a). 이것은 야생 유형 데이터에 반영 되 고이 조건에서이 특정 메트릭의 유틸리티를 제한 하는 두 변형의 가난한 성장에 기인 합니다. 세대 수가 부족 하면 1) 지연 단계에서 발생 하는 확률 효과에 대 한 민감도 및 경사 피팅을 방해 하는 timepoints의 불량 한 분리가 초래 됩니다. 우리는이 연구에서 그렇게 하기로 선택 하지 않았지만, 실험 중에에 볼에 의해 수집 된 실시간 성장 데이터는 실험을 확장 하 고 약간의 노력으로이 조건에 대 한 추가 timepoints를 수집 하는 결정을 알리기 위해 사용 되었을 수 있습니다. 후속 실험에서, 시작 비율은 또한 포화가 발생 하기 전에 선형 영역의 길이를 확장 하도록 변조 될 수 있습니다.
그림 1:이 더 보기 프레임 워크 및 실험 설계 개요 (A)에 버 버는 배양 조건의 멀티 파라미터 제어가 가능 하도록 하는 자동화 된 연속 배양 플랫폼입니다. 이 플랫폼은 문화 조건을 제어 하는 센서와 액추에이터, 문화를 들어오고 나가는 미디어 및 폐기물을 위한 연동 식 펌프 어레이, 장치와 수동으로 상호 작용 하는 터치 스크린, 컴퓨터와 같은 스마트 슬리브로 구성 되어 있습니다. 플랫폼의 데이터가 스트리밍되는 클라우드 인프라와 상호 작용 하는 데 사용 됩니다. (B)는 다양 한 방법으로 구성 될 수 있다: 물리적으로, 셀 및 미디어 입력을 통해, 그리고 프로그래밍 방식으로 스마트 소매 배양 유리 병 모듈을 제어 하는 알고리즘을 조정. 이는 정의 된 시점에서 물리적으로 수집 된 셀 들로 구성 된 출력과 배양 데이터의 실시간 스트리밍을 통해 고해상도에서 다차원 선택/환경 구배를 프로그래밍 하는데 활용 될 수 있다. (C) 온도 및 삼투성 응력으로 구성 된 2 차원 선택 그라데이션에 걸쳐 성장 적합성 실험을 수행 하기 위해이 볼 버를 구성 합니다. 에 대 한 배양 바이 알은 참조 및 변형 효 모 균 주의 동등한 비율로 시드 되었다. Turbidostat 루틴은 정의 된 OD 창에서 지 수 위상의 모든 문화권을 유지 하도록 프로그래밍 되었습니다 (OD 0.2-0.3). 온도 및 매체 조건은 두 개의 독립적인 응력 구배를 형성 하기 위해 스마트 슬리브 어레이 전반에 걸쳐 변화 되었다. 기본 배지는 세균 오염에 대 한 예방 조치로 서 YPD (2% 글루코스) + 100 µ의 카 르 베 실린 + 25 µ의 클로 람 페니 콜로 구성 되었다. 배지 조성 물은 0 M, 0.6, 0.8 m 또는 1.0 M에 보충 염화 나트륨을 첨가 하 여 다양 하였다. 바이 알 온도는 30°c, 35 ° c, 37 ° c 또는 39 ° c의 4 가지 값 중 하나로 프로그래밍 되었다. (D) 3 개의 시험 된 조건에서 문화 OD 및 집단 분 획을 위한 원시 산출의 예. 경쟁 실험은 72 h를 유지 하였으며, 24 시간에 샘플링 하 여 실험을 마칠 때까지 12 시간 마다 연속적으로 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:에 버 버 실시간 데이터 분석 대시 보드. (A)에이 지 데이터는 클라우드 기반 소프트웨어를 통해 실시간으로 처리 되 고 스트리밍되어 대화형 대시보드로 제공 됩니다. 대시보드를 통해 사용자는 연결 된 컴퓨터에서 자신의 문화권 루틴을 정의 및 시작 하 고, 모든이 볼 버 장치에서 현재 실행 중인 실험을 모니터링 하 고, 필요한 경우 개별 유리병 또는 바이 알 세트에서 실험 조건을 수동으로 다양 하 게 변경할 수 있습니다. (B) 전체 실험 기간 동안 테스트 된 조건의 매트릭스에 걸쳐 각 바이 알에 대 한 OD 트레이스. 추적은 실시간으로 볼 수 있으므로 실험이 원하는 대로 실행 되 고 추가 분석을 위해 실험 후에 사용 됩니다. (C) 성장 속도 및 세포 세대는 실험 진행 상황을 추적 하기 위해 즉석에서 OD 트레이스 로부터 계산 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 피트 니스 표면의 건설. (A) 셀 모집단은 셀 세대에 대해 플롯 된 자연 로그 (변형 변형/참조 변형)입니다. 색상은 선택의 온도를 나타내며 대시는 염 농도를 구분 합니다. (B) 상기 기준 균 주에 대 한 변이체의 상대적인 적합성을 정량화 하기 위해, 피트 니스 메트릭은 세대에 걸쳐 세포 집단 분 율이 변화 하는 속도 로부터 도출 된다. 이 메트릭은 최소 3 개의 점을 사용 하 여 셀룰러 분수 플롯의 선형 영역에서 계산 됩니다. (C) 환경 스트레스 그라데이션에 대 한 피트 니스 표면을 구성 하기 위해 히트 맵에 상대적인 피트 니스 지표가 표시 됩니다. 야생 형 및 δ Pbs2 에 대 한 우측 상단 조건 (39 ° c/1.0 염화 나트륨)은 배양이 불충분 한 세대를 통과 함에 따라이 분석에 포함 되지 않는다 (대표 결과 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
성장 선택은 세포 집단 간의 표현 형 차이를 생성 하 고 특성화 하는 데 광범위 하 게 사용 되는 생물학에서 없어서는 안될 도구입니다. 배치 문화는 제한 된 방법으로 성장 선택을 허용 하지만, 연속 배양 기법은 이러한 실험의 제어 및 예측 가능성을 극적으로 확장 하 고, 선택의 형태와 역학에 대 한 정밀한 조절을 발휘 하 여 반복 가능한 정량적 결과22. 연속 배양은 고 다양성 라이브러리(20,23,24,25)에 대 한 선택을 엄격 하 게 제어 하 고, 복잡 한 적응 체계를 실험적으로 구현 하 고 진화 하는발전11,12,27. 또한 연속 배양은 정량적으로 제어 되는 다양 한 조건에서 세포를 정밀 하 게 특성화 하 여 복잡 한 유전 시스템을 더 잘 이해 하 고 설계 된 생체 생산 균 주를 최적화할 수 있습니다. , 28.
그러나, 선택적인 조건에 미묘한 변경은 생물학 결과에 있는 극적인 변경으로 이끌어 낼 수 있기 때문에 연속적인 문화를 위한 보편적인 프로토콜이없습니다,29,30. 실험 자는 선택 영역 사이에서 선택 하 고 실험적 프로토콜과 장비를 적절 하 게 조정할 수 있어야 합니다. 제어 매개 변수 중에서 선택할 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 시스템은 이상적으로 복잡 한의 상호 작용 입력을 해독 하는 데 필요한 고도의 병렬 실험에서 동시에 여러 매개 변수를 독립적으로 관리 할 수 있을 만큼 정교 합니다. 생물학적 시스템 (예: epistasis). 사용자가 고도로 전문화 된 환경 틈새 시장을 지정 하기 위해 문화 조건 및 유체 함수 간의 피드백 제어를 임의로 프로그래밍할 수 있도록 해 주는이 문제를 해결 합니다.
현재 설정의 한계를 극복 하 고 제어 매개 변수를 확장 하거나 변경 하기 위해 스마트 슬리브는 새로운 센서 또는 액추에이터를 추가 하기 위해 쉽게 재설계 될 수 있습니다. 추가적으로, 유리병 부피를 감소 시키는 것은 연속적인 문화에서 중요 할 수 있는 매체 지출을 감소 시킬 것입니다. 현재 설계는 온도, 배양 교 반, 광 유도, 탁도 및 유체 역학의 측정 및 제어를 허용 하지만 다른 매개 변수는 바이 알에서 샘플링 하 여 외부적으로 측정 해야 합니다. 현재 작업에는 루시퍼 라 제를 통해 효소 활성을 모니터링 하 고, 용 존 산소와 pH를 직접에 비에이 터로 조절 하는 기능이 포함 되어 있습니다. 또한,이 작품에서 설명 하지는 않았지만,에 비에 스는 새로운 millifluidic 다중화 장치 (16 )와의 인터페이스를 통해 대규모 통합 (전자에서 유래 하 고 마이크로 fluidics에 의해 채택)의 원칙을 도출 하 여 저렴 한 방식으로 더 복잡 한 유체 처리 가능 (예: 다중화 된 유체 입력, 바이 알 유리병 전송). 이러한 웨어 모듈은 실험실에서 완벽 하 게 설계 및 제조 될 수 있으므로 사용자는 자동화 된 유체 루틴에서 프로그래밍 방식으로 다양 한 밸브 조합을 구현 하 여 유체의 경로를 조정 합니다. 이를 통해 사용자는 전통적으로 지속적인 문화에 사용 되는 견고한 유체 설계를 극복할 수 있을 뿐만 아니라, 비용이 많이 드는 제어 요소 (예: 연동 펌프)를 사용 하 여 높은 처리량으로 유체 기능을 확장할 수도 있습니다. 마지막으로, 우리는 샘플링 문화가 복잡 한 더 길고 큰 실험 동안 수동 상호 작용의 한계를 극복, 이러한 밀리 유체 및 DIY 구성 요소를 활용 하는 자동 샘플링 플랫폼을 통합 하기를 바라고 있다.
플랫폼을 물리적으로 수정 하는 것 외에도 웹 기반 소프트웨어는 사용자가 사용자 정의를 작성, 편집 및 공유할 수 있도록 하 여 완전히 자동화 된 피드백 지원 문화 프로그램 (예: turbidostat)을 생성 하 여 새로운 자유도를 엽니다. 사용자는 동일한 선택 체계에서 미묘한 변형으로 매개 변수 범위를 프로그래밍 방식으로 스윕 하거나, 새로운 조합의 제어 알고리즘을 연결 하 여 원하는 수의 정교한 선택 구성표를 지정할 수 있습니다. 더욱이, 실시간으로 쉽게 배양을 모니터링 하는 능력은 실험이 수행 되는 방식을 변형 한다. 실시간 모니터링을 통해 사용자는 1) 실행 간의 일관성을 확인 하 고, 생물 생산 응용 분야의 중요 한 기능과 높은 처리량 실험을 수행 하 고, 필요한 경우 실험 중에 개입 하 여 발생 하는 도전적인 균 주를 해결할 수 있습니다. 성장 또는 생물 막 형성이 불량 하거나 사용자 오류 (예: 오염)를 진단 합니다. 마지막으로, 여러 데이터 스트림이 각 개별 문화권에 대해 실시간으로 수집 되 고 해석 되 면,이에 버 버는 고밀도의 데이터를 생성 하 여 새로운 다운스트림 분석을 위한 기계 학습 접근법을 촉진할 수 있습니다.
적합성 특성화, 라이브러리 선택 및 실험실 진화에 대 한 입증 된 용도 외에도, 우리는 통합 된 fluidics를 사용 하 여이 볼에 구현 하기 위해 잘 익은 관련 필드의 수를 봅니다. 미 생물군 유 전체 시료 실험을 통해 통제 된 환경에서 지역사회의 안정성을 분석 할 수 있습니다.31,32, 컬쳐로 마이크 기법을 사용 하 여 마이크로 바이오 타 조성33, 또는 동적으로 종을 혼합 하 여 식민지의 생태 역학을 심문 또는 침략34,35. 생체 분자의 연속 된 진화를 위한 수많은 방법 들이 장치 뿐만 아니라26,36,37에 쉽게 구현 될 수 있어 이러한 시스템의 접근성 및 처리량이 크게 향상 되었습니다. 동적이 고 높은 처리량의 자연에서 미디어 구성, 온도 및 긴장과 같은 성장 조건을 최적화 하는 능력은 산업 바이오 제조 응용 분야에 최적화 노력을 기울일 수 있습니다9. 우리는 또한 단일 세포와 인구 모두에서 세포 배양의 성장과 분석을 위한 완전 자동화 된 시스템을 제공 하는 폐 회로 방식으로 현미경 및 유 세포 분석기와 같은 다른 분석 기법과 수직적 통합을 구상 하 고 있습니다. 수준. 더욱이, 용기를 밀봉 하 고 가스 함량을 조절 하는 것과 같은 스마트 슬리브에 대 한 일부 하드웨어 수정으로,에이 볼은 잠재적으로 현 탁 포유류 세포와 같은 광범위 한 세포 유형의 성장을 지원 하도록 적응 될 수 있었다. 또한 혐 기성 세포 배양을 위한 혐 기성 챔버에 전체 프레임 워크를 배치 하는 것이 가능 하다. 앞으로는 중앙 집중식 클라우드 인프라로 소프트웨어 프레임 워크를 구축 하는 것을 목표로 하 고 있으며,이를 통해 사용자는 실험실에 물리적으로 존재할 필요 없이 데이터를 원격으로 쉽게 구성, 분석 및 공유할 수 있습니다. 데이터 큐레이터의 역할을 하는 클라우드 인프라는 실험에 대 한 대규모 메타 분석에도 큰 도움을 줄 것입니다. 지속적인 문화에서 자동화와 혁신을 촉진 하 여 가능한 성장 선택 실험의 범위를 크게 확대할 것으로 예상 됩니다.
Disclosures
저자 인 브랜든 g. 웡와 아마 트에 스 칼 릴은이 기사에서 사용 되는이 볼 리 플랫폼을 개발 하는 Fynch 바이오 사이언스 i n c .의 공동 설립자입니다.
Acknowledgments
우리는 시스템의 설계에 그의 도움에 대 한 b. 스태퍼 드, 그리고 h. 칼 릴, a. 솔 타 니 탄, a. 일, s. 파이프 및 시스템의 건설에 대 한 도움을 위한. 우리는 전자 설계 시설 (EDF), 엔지니어링 제품 혁신 센터 및 서비스를 위해 보스턴 대학에서 컴퓨팅을 위한 하리리 연구소에서 소프트웨어 & 응용 프로그램 혁신 연구소 (항해)를 인정 합니다. 이 작품은 NSF 경력 상 (1350949에 A.S.K.)에 의해 지원 되었으며 DARPA는 HR0011-0091 및 HR0011 0014를 A.S.K.에 부여 합니다. A.S.K.는 또한 NIH 감독의 새로운 혁신 상 (1DP2AI131083-01), DARPA 젊은 교수진 상 (D16AP00142) 및 컴퓨팅에서의 NSF 원정 으로부터의 자금 조달을 인정 합니다 (1522074).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
| a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
| Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
| Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
| CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
| Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
| Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
| Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
| eVOLVER Unit | FynchBio | ||
| Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
| Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
| Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
| High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
| Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
| Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
| SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
| Vial Only, Sample, 40 mL, Clear, 28 mm x95 mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |
References
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