Den eVOLVER rammeverket muliggjør høy gjennomstrømming kontinuerlig mikrobiell kultur med høy oppløsning og dynamisk kontroll over eksperimentelle parametere. Denne protokollen demonstrerer hvordan du bruker systemet til å gjennomføre en kompleks fitness eksperiment, guiding brukere på programmering automatisert kontroll over mange individuelle kulturer, måling, innsamling, og samspill med eksperimentelle data i sanntid.
Kontinuerlig kultur metoder gjør det mulig for celler å bli dyrket under kvantitativt kontrollerte miljøforhold, og er dermed bredt nyttig for å måle fitness fenotyper og forbedre vår forståelse av hvordan genotyper er formet av utvalg. Omfattende siste innsats for å utvikle og anvende nisje kontinuerlig kultur enheter har avdekket fordelene med å gjennomføre nye former for cellekultur kontroll. Dette inkluderer å definere tilpasset utvalgs trykk og økt gjennomstrømming for studier som spenner fra langsiktige eksperimentelle evolusjon til Genova bibliotek utvalg og syntetisk gen krets karakterisering. EVOLVER-plattformen ble nylig utviklet for å møte denne økende etterspørselen: en kontinuerlig kultur plattform med en høy grad av skalerbarhet, fleksibilitet og automatisering. eVOLVER gir en enkelt standardisering plattform som kan (re)-konfigurert og skalert med minimal innsats for å utføre mange forskjellige typer høy gjennomstrømming eller multi-dimensjonale vekst utvalg eksperimenter. Her presenteres en protokoll for å gi brukerne av eVOLVER-rammeverket en beskrivelse for konfigurering av systemet for å gjennomføre en tilpasset, storstilt kontinuerlig vekst eksperiment. Nærmere bestemt protokollen guider brukerne om hvordan du programmere systemet til multiplex to utvalg press-temperatur og OSMOLARITETSSYSTEM-på tvers av mange eVOLVER hetteglass for å kvantifisere fitness landskap av Saccharomyces cerevisiae mutanter på fine Oppløsning. Vi viser hvordan enheten kan konfigureres både programmatisk, gjennom sin åpen kildekode-Web-basert programvare, og fysisk, ved å arrangere fluidic og hardware oppsett. Prosessen med fysisk å sette opp enheten, programmering kulturen rutine, overvåking og samhandling med eksperimentet i sanntid over Internett, prøvetaking ampuller for påfølgende offline analyse, og etter eksperimentdata analyse er detaljert. Dette bør tjene som et utgangspunkt for forskere på tvers av ulike disipliner å anvende eVOLVER i utformingen av sin egen komplekse og høy gjennomstrømming cellevekst eksperimenter for å studere og manipulere biologiske systemer.
Kontinuerlig cellekultur teknikker, først utviklet nesten 70 år siden1,2, nyter en fersk vekkelse3,4. Dette skyldes en samløpet av faktorer. For det første, utvikling av høy gjennomstrømning-omics teknikker, som har gjort det mulig å lese ut og generere et stort antall genotyper5,6, har skapt en samtidig etterspørsel etter eksperimentelle teknikker som letter godt kontrollert cellevekst og bestemmelse av fenotype. For dette formål, kontinuerlig kultur representerer en kraftig eksperimentell tilnærming til å kapitalisere på emergent genomisk fremskritt. Ved å tilrettelegge for vekst utvalg/eksperimenter på cellulære populasjoner i nøyaktig kontrollerte (og dynamiske) miljøforhold, gir kontinuerlig kultur et middel til å nøye kartlegge genotyper til fenotyper7,8, kvantitativt karakteriserer konstruerte stammer og organismer9, og spore adaptive genetiske endringer i laboratoriet Evolution Studies10,11,12.
For det andre, den nylige fremveksten av tilgjengelig prototyping teknikker, slik som additiv produksjon og åpen kildekode maskinvare og programvareelementer, har aktivert et bredere sett av brukere til å designe og bygge sine egne kostnadseffektive former for kontinuerlig kultur systemer direkte i laboratoriet. Alt dette har ført til et spennende utvalg av gjør-det-selv (DIY) enheter som utfører kontinuerlig kultur funksjonalitet, slik som chemostat13, turbidostat14, eller morbidostat15. Dessverre, men lykkes i adressering spesifikke (nisje) problemer som de ble utformet, disse ad hoc løsninger generelt mangler muligheten til å skalere i gjennomstrømning og/eller eksperimentell design kompleksitet.
Den eVOLVER systemet ble utviklet med det mål å skape en enkelt plattform som kan imøtekomme den økende eksperimentelle behovene til kontinuerlig kultur og matche hastigheten og omfanget av emergent genomisk teknikker16 (figur 1a). eVOLVER design implementerer felles læresetninger underliggende svært skalerbare teknologier fra andre disipliner17, inkludert standardiserte fotavtrykk, modulære komponenter, og åpen kildekode-design prinsipper. Således, løsninger for ny nisje søknadene kan designet uten større modifiseringer å systemet. EVOLVER består av svært modulære og åpen kildekode-wetware, maskinvare, elektronikk og webbasert programvare, og er det første automatiserte, kontinuerlige kultur systemet som kan være kostnadseffektivt og enkelt re-konfigurert til å utføre praktisk talt alle typer vekst eksperiment med høy gjennomstrømming. Gjennom modulære og programmerbare smart ermer som huset alle sensorer og aktuatorer som trengs for å styre individuelle kulturer, eVOLVER unikt muliggjør skalering av både gjennomstrømning og individuell kontroll av kultur forhold. Videre, som en Web-basert plattform, eVOLVER utveksler data og informasjon med eksterne datamaskiner i sanntid, tillater samtidig overvåking av hundrevis av individuelle kulturer og automatisert kultur forstyrrelser gjennom vilkårlig definert kontroll Algoritmer.
I tidligere arbeid16, eVOLVER ‘ s robuste ytelse ble demonstrert i langsiktige eksperimenter over hundrevis av timer med drift, og dens evne til å dyrke ulike organismer, fra E. coli og s. cerevisiae å undomesticated Mikrober. En rekke forskjellige vekst utvalg eksperimenter ble utført, der programmatisk definerte multi-dimensjonale utvalg gradienter ble brukt på tvers av en rekke individuelle kultur forhold og den resulterende cellulære fitness landskaper ble Kvantifisert. Her er målet å gi eVOLVER brukere en beskrivelse av hvordan man bruker systemet til å designe og disse typer eksperimenter. Som et illustrerende eksempel metoder kvantifisere fitness landskapet av S. cerevisiae mutanter over en todimensjonal miljømessige gradient sammensatt av temperatur og osmotisk stress presenteres. Protokollen veileder brukerne gjennom konfigurering av eVOLVER-rammeverket for dette eksperimentet både programmatisk, ved bruk av programvaren for å sette tilpassede turbiditet-og temperaturkontroll rutiner for hver av 16 parallelle sammenhengende kulturer, og fysisk, gjennom fluider layout til hensiktsmessig rute medier av ulike salt konsentrasjoner. Denne protokollen skal fungere som en generell vurderingsmatrise for å konfigurere eVOLVER til å utføre et bredt utvalg av automatiserte, kontinuerlige kultur eksperimenter for ulike studier og disipliner.
Vekst utvalg er et uunnværlig redskap i biologi, grovt brukes til å generere og karakterisere fenotypiske forskjeller mellom cellulære populasjoner. Mens satsvise kulturer tillater vekst utvalg i en begrenset måte, kontinuerlig kultur teknikker dramatisk utvide graden av kontroll og forutsigbarhet av disse eksperimentene, ved å øve presis regulering over form og dynamikk av utvalget til å generere kvantitative resultater22. Kontinuerlig kultur har vært benyttet for å nøye kontrollere utvalget for høy-mangfold biblioteker20,23,24,25, og å gjennomføre sofistikerte adaptive regimer i eksperimentell og regissert evolusjon11,12,26,27. Kontinuerlig kultur muliggjør også presis karakterisering av celler over en rekke kvantitativt kontrollerte forhold for å bedre forstå komplekse genetiske systemer og optimalisere konstruert bioproduction stammer9,14 , 28og andre.
Det finnes imidlertid ingen universell protokoll for kontinuerlig kultur, ettersom subtile endringer i de selektive forholdene kan føre til dramatiske endringer i biologiske utfall4,29,30. Forskere må kunne velge mellom utvalgs regimer og tilpasse eksperimentelle protokoller og utstyr tilsvarende. I tillegg til å tilby et valg mellom kontrollparametere, ville slike systemer ideelt sett være sofistikerte nok til selvstendig administrere flere parametre samtidig i svært parallelle eksperimenter som er nødvendig for å dechiffrere samspill innganger i komplekse biologiske systemer (f.eks. epistasis). eVOLVER løser denne utfordringen ved å gjøre det mulig for brukere å vilkårlig programmere feedback-kontroll mellom kultur forhold og fluidic funksjoner for å spesifisere høyt spesialiserte miljø nisjer.
For å overkomme begrensningene i det gjeldende oppsettet og utvide eller endre kontrollparametere, kan smart Sleeve lett bli redesignet for å legge til nye sensorer eller aktuatorer. I tillegg ville redusere hetteglass volum redusere Media utgifter, som kan være betydelig i kontinuerlig kultur. Mens dagens design tillater måling og kontroll av temperatur, kultur agitasjon, lys induksjon, turbiditet og fluider, må andre parametre måles eksternt ved prøvetaking fra hetteglassene. Nåværende arbeid omfatter å innlemme evnen til å overvåke enzymatisk aktivitet via luciferase og regulere oppløst oksygen og pH direkte i eVOLVER kulturer. I tillegg, mens ikke demonstrert i dette arbeidet, kan eVOLVER grensesnitt med romanen millifluidic multipleksing enheter16 som trekker på prinsipper for stor skala integrering (som stammer fra elektronikk og vedtatt av materialer) for å muliggjør mer kompleks fluidic håndtering (f.eks. multiplekset fluidic innganger og overføringer av hetteglass til hetteglass). Disse wetware modulene kan være utformet og produsert helt i laboratoriet, slik at brukerne kan rute væsker ved programmatisk actuating forskjellige kombinasjoner av ventiler i automatiserte fluidic rutiner. Dette tillater brukere å overvinne den stive fluidic design tradisjonelt brukt i kontinuerlig kultur, men også å skalere fluidic evner til høy gjennomstrømming med et mindre antall kostbare kontrollelementer (f. eks peristaltisk pumper). Til slutt, vi håper å innlemme en autosampling plattform som vil benytte disse millifluidics og DIY komponenter, overvinne begrensningen av manuell interaksjon under lengre og større eksperimenter der prøvetaking kulturer ville være tungvint.
I tillegg til fysiske modifikasjoner på plattformen, åpner den nettbaserte programvaren nye frihetsgrader ved å la brukerne skrive, redigere og dele tilpassede eVOLVER-skript, generere helautomatisk, tilbakemeldings aktiverte kulturprogrammer (f.eks. turbidostat). Brukere kan programmatisk feie over parameter områder i subtile variasjoner på samme utvalgs skjema eller koble kontroll algoritmer i romanen kombinasjoner for å angi et antall sofistikerte utvalg ordninger. Videre kan evnen til enkelt å overvåke kulturer i sanntid forvandler måten eksperimenter blir utført. Med sanntids overvåking, brukere kan 1) se etter konsistens mellom kjøringer, en kritisk funksjon for bioproduction applikasjoner og høy gjennomstrømming eksperimenter, og 2) gripe inn under eksperimenter om nødvendig, for å feilsøke utfordrende stammer som viser dårlig vekst eller biofilm dannelse, eller diagnostisere bruker feil (f.eks. forurensning). Til slutt, med flere datastrømmer som samles inn og tolkes i sanntid for hver enkelt kultur, eVOLVER genererer en høy tetthet av data, som kan forenkle maskinlæring tilnærminger for romanen nedstrøms analyse.
Utover demonstrert bruk for fitness karakterisering, bibliotek utvalg, og laboratorium evolusjon, viser vi en rekke relaterte felt som moden for gjennomføring i eVOLVER med integrert fluider. eVOLVER eksperimenter med mikrobiomet prøver kunne analysen samfunnet stabilitet i kontrollerte miljøer31,32, utforske bakterieflora sammensetning ved hjelp av culturomics teknikker33, eller dynamisk blanding arter å avhøre økologiske dynamikken i kolonisering eller invasjon34,35. Tallrike metoder for kontinuerlig rettet utvikling av biomolekyler kan lett bli implementert på enheten også26,36,37, sterkt økende tilgjengelighet og gjennomstrømning av disse systemene. Evnen til å optimalisere vekstforhold som for eksempel medie sammensetning, temperatur og belastninger i en dynamisk, høy gjennomstrømnings natur kan hjelpe til med optimaliserings arbeid for industrielle biomanufacturing applikasjoner9. Vi videre envision vertikalt integrere eVOLVER med andre analyse teknikker som mikroskopi og flyt flowcytometri i en lukket sløyfe mote, og gir et helautomatisk system for vekst og analyse av cellulære kulturer på både enkelt celle og befolkning Nivåer. Videre, med noen hardware modifikasjoner til smart Sleeve som tetting fartøyet og kontrollerende gass innhold, eVOLVER kan potensielt være tilpasset for å støtte veksten av et bredere spekter av celletyper, for eksempel suspensjon pattedyrceller. Det er også mulig å plassere hele rammeverket i en anaerob kammer for anaerob cellekultur. Ser frem, vi tar sikte på å bygge vår programvarerammeverk til en sentralisert skyinfrastruktur og tror dette ville tillate brukere å enkelt konfigurere, analysere og dele sine data eksternt uten å måtte fysisk være til stede i laboratoriet. Som en data kurator vil skyinfrastrukturen også låne seg til store meta-analyser på tvers av eksperimenter. Vi forventer at eVOLVER og disse fremtidige fremskrittene i stor grad vil utvide omfanget av mulig vekst utvalgs eksperimenter ved å tilrettelegge for automatisering og innovasjon i kontinuerlig kultur.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker B. Stafford for hans assistanse i utformingen av systemet, og H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, og A. Cavale for hjelp med bygging av systemet. Vi erkjenner at Electronics design Facility (EDF), ingeniør produkt Innovation Center (EPIC), og programvaren & Application Innovation Lab (SAIL) ved Hariri Institute for Computing ved Boston University for sine tjenester. Dette arbeidet ble støttet av en NSF karriere Award (MCB-1350949 til A.S.K.), og DARPA tilskudd HR0011-15-C-0091 og HR0011-18-2-0014 (til A.S.K.). A.S.K. erkjenner også finansiering fra NIH Director ‘ s nye innovatør Award (1DP2AI131083-01), DARPA unge fakultet Award (D16AP00142), og NSF ekspedisjoner i Computing (CCF-1522074).
5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
eVOLVER Unit | FynchBio | ||
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
Pipettes | Eppendorf | ||
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |