A estrutura eVOLVER permite a cultura microbiana contínua de alto débito com alta resolução e controle dinâmico sobre parâmetros experimentais. Este protocolo demonstra como aplicar o sistema para realizar um experimento de condicionamento físico complexo, orientando os usuários a programar o controle automatizado sobre muitas culturas individuais, medindo, coletando e interagindo com dados experimentais em tempo real.
Os métodos contínuos da cultura permitem que as pilhas sejam crescidas condições ambientais quantitativamente controladas, e são assim amplamente úteis para medir fenótipos da aptidão e melhorar nossa compreensão de como os genótipos são dados forma pela seleção. Extensos esforços recentes para desenvolver e aplicar nicho de dispositivos de cultura contínua revelaram os benefícios da realização de novas formas de controle da cultura celular. Isso inclui definir pressões de seleção personalizadas e aumentar a taxa de transferência para estudos que vão desde a evolução experimental de longo prazo até seleções de bibliotecas de todo o genoma e caracterização de circuitos de genes sintéticos. A plataforma eVOLVER foi desenvolvida recentemente para atender a essa crescente demanda: uma plataforma de cultura contínua com alto grau de escalabilidade, flexibilidade e automação. o eVOLVER fornece uma única plataforma de padronização que pode ser (re) configurada e dimensionada com o mínimo de esforço para executar muitos tipos diferentes de experimentos de seleção de crescimento de alta taxa de transferência ou multidimensionais. Aqui, um protocolo é apresentado para fornecer aos usuários do Framework eVOLVER uma descrição para configurar o sistema para realizar um experimento de crescimento contínuo personalizado e em grande escala. Especificamente, o protocolo orienta os usuários sobre como programar o sistema para multiplex duas pressões de seleção — temperatura e osmolaridade — em muitos frascos eVOLVER, a fim de quantificar as paisagens de fitness de mutantes Saccharomyces cerevisiae em multa Resolução. Mostramos como o dispositivo pode ser configurado de forma programática, por meio de seu software baseado na Web de código aberto e fisicamente, organizando layouts fluídico e de hardware. O processo de configuração física do dispositivo, programação da rotina de cultura, monitoramento e interação com o experimento em tempo real pela Internet, amostragem de frascos para análise offline subsequente e análise de dados pós-experimento são detalhados. Isso deve servir como ponto de partida para pesquisadores em diversas disciplinas para aplicar o eVOLVER no projeto de suas próprias experiências de crescimento de células complexas e de alto rendimento para estudar e manipular sistemas biológicos.
Técnicas contínuas da cultura da pilha, desenvolvidas primeiramente quase 70 anos há1,2, estão apreciando um revival recente3,4. Isto é devido a uma confluência de factores. Em primeiro lugar, o desenvolvimento de técnicas de alta produtividade-ônicas, que tornaram possível a leitura e geração de grande número de genótipos5,6, criou uma demanda concomitante de técnicas experimentais que facilitam crescimento celular bem controlado e fenotipagem. Para este fim, a cultura contínua representa uma poderosa abordagem experimental para capitalizar os avanços genóricos emergentes. Ao facilitar as seleções de crescimento/experimentos em populações celulares em condições ambientais precisamente controladas (e dinâmicas), a cultura contínua fornece um meio para mapear rigorosamente os genótipos para os fenótipos7,8, caracterizar quantitativamente cepas e organismos projetados9, e rastrear alterações genéticas adaptativas nos estudos de evolução laboratorial10,11,12.
Em segundo lugar, o recente surgimento de técnicas de prototipagem acessíveis, como manufatura aditiva e elementos de hardware e software de código aberto, permitiu que um conjunto mais amplo de usuários projetem e construam suas próprias formas rentáveis de sistemas de cultura contínuos diretamente no laboratório. Tudo isso levou a uma empolgante variedade de dispositivos do tipo “faça você mesmo” (DIY) que executam funcionalidades contínuas de cultura, como o quimiostat13, o turbidostat14ou o morbidostat15. Infelizmente, embora bem sucedido em abordar problemas específicos (de nicho) para os quais eles foram projetados, essas soluções ad hoc geralmente não têm a capacidade de dimensionar na taxa de transferência e/ou complexidade de design experimental.
O sistema eVOLVER foi projetado com o objetivo de criar uma única plataforma que possa acomodar as crescentes necessidades experimentais da cultura contínua e corresponder à velocidade e escala das técnicas genómicas emergentes16 (Figura 1a). o design do eVOLVER implementa princípios comuns subjacentes a tecnologias altamente escaláveis de outras disciplinas17, incluindo pegadas padronizadas, componentes modulares e princípio de design de código aberto. Assim, as soluções para novas aplicações de nicho podem ser projetadas sem grandes modificações no sistema. Composto por wetware altamente modular e de código aberto, hardware, eletrônica e software baseado na Web, o eVOLVER é o primeiro sistema de cultura contínua automatizado que pode ser rentável e prontamente re-configurado para realizar praticamente qualquer tipo de experimento de crescimento de alta produtividade. Através de Smart Sleeves modulares e programáveis que abriam todos os sensores e atuadores necessários para controlar culturas individuais, o eVOLVER permite exclusivamente o dimensionamento da taxa de transferência e o controle individual das condições de cultura. Além disso, como uma plataforma baseada na Web, o eVOLVER troca dados e informações com computadores remotos em tempo real, permitindo o monitoramento simultâneo de centenas de culturas individuais e perturbações da cultura automatizada através de controle definido arbitrariamente Algoritmos.
No trabalho anterior16, o desempenho robusto do Evolver foi demonstrado em experimentos de longo prazo ao longo de centenas de horas de operação, e sua capacidade de cultivar vários organismos, de e. coli e s. cerevisiae a não domesticados Micróbios. Uma série de experimentos distintos de seleção de crescimento foi realizada, na qual foram aplicados gradientes de seleção multidimensionais programaticamente definidos em uma matriz de condições de cultura individuais e as paisagens de aptidão celular resultantes foram Quantificados. Aqui, o objetivo é fornecer aos usuários do eVOLVER uma descrição de como usar o sistema para projetar e esses tipos de experimentos. Como um exemplo ilustrativo, os métodos que quantificam a paisagem da aptidão de mutantes de S. cerevisiae através de um inclinação ambiental bidimensional compor da temperatura e do esforço osmótica são apresentados. O protocolo orienta os usuários através da configuração da estrutura eVOLVER para este experimento tanto programaticamente, usando o software para definir rotinas de controle de temperatura e turbidez personalizadas para cada uma das 16 culturas contínuas paralelas, e fisicamente, através do layout de fluínicos para rotear adequadamente as mídias de diferentes concentrações de sal. Este protocolo deve servir como uma rubrica geral para configurar o eVOLVER para executar uma ampla variedade de experimentos de cultura contínua automatizados para diversos estudos e disciplinas.
A seleção de crescimento é uma ferramenta indispensável na biologia, amplamente utilizada para gerar e caracterizar diferenças fenotípicas entre populações celulares. Enquanto as culturas de lote permitem a seleção de crescimento de forma limitada, as técnicas contínuas de cultura expandem drasticamente o grau de controle e previsibilidade desses experimentos, exercendo uma regulação precisa sobre a forma e a dinâmica de seleção para gerar resultados quantitativos e repetíveis22. A cultura contínua tem sido empregada para controlar rigorosamente a seleção de bibliotecas de alta diversidade20,23,24,25, e implementar sofisticados regimes adaptativos em experimental e evolução dirigida11,12,26,27. A cultura contínua igualmente permite a caracterização precisa das pilhas através de uma disposição de condições quantitativamente controladas para compreender melhor sistemas genéticos complexos e para aperfeiçoar tensões projetadas da bioprodução9,14 , a 28.
No entanto, não existe um protocolo universal para a cultura contínua, pois mudanças sutis nas condições seletivas podem levar a mudanças dramáticas nos desfechos biológicos4,29,30. Os experimentadores devem ser capazes de escolher entre os regimes de seleção e adaptar os protocolos experimentais e equipamentos em conformidade. Além de oferecer uma escolha entre os parâmetros de controle, esses sistemas seriam idealmente sofisticados o suficiente para gerenciar de forma independente vários parâmetros simultaneamente em experimentos altamente paralelos que são necessários para decifrar entradas interagindo em complexos sistemas biológicos (por exemplo, epistasis). o eVOLVER aborda esse desafio, permitindo que os usuários programem arbitrariamente o controle de feedback entre as condições de cultura e as funções fluímicas para especificar nichos ambientais altamente especializados.
Para superar as limitações na configuração atual e expandir ou alterar os parâmetros de controle, a luva inteligente pode ser facilmente redesenhada para adicionar novos sensores ou atuadores. Adicionalmente, reduzir o volume do frasco diminuiria as despesas dos meios, que podem ser significativas na cultura contínua. Quando o projeto atual permitir a medida e o controle da temperatura, da agitação da cultura, da indução clara, do turbidity, e do fluidics, outros parâmetros devem ser medidos externamente pela amostragem dos frascos. O trabalho atual inclui incorporar a capacidade de monitorar a atividade enzimática via luciferase e regular o oxigênio dissolvido e o pH diretamente nas culturas do eVOLVER. Além disso, embora não demonstrado neste trabalho, eVOLVER pode interface com novos dispositivos de multiplexação milifluídico16 que desenhar sobre os princípios de integração em grande escala (proveniente da eletrônica e adotado por Microfluidics), a fim de permitir uma manipulação fluídico mais complexa (por exemplo entradas fluídico multiplexados, transferências do frasco-à-frasco). Estes módulos do wetware podem ser projetados e manufacturados completamente no laboratório, permitindo que os usuários roteem líquidos programando programaticamente combinações diferentes de válvulas em rotinas fluídico automatizadas. Isto permite que os usuários superem os projetos fluídico rígidos usados tradicional na cultura contínua, mas igualmente para escalar capacidades fluídico ao elevado-throughput com um número menor de elementos de controle caros (por exemplo bombas peristáltica). Por fim, esperamos incorporar uma plataforma de autoamostragem que utilizará esses componentes de millifluidics e DIY, superando a limitação da interação manual durante experimentos mais longos e maiores, onde culturas de amostragem seriam complicadas.
Além de modificações físicas na plataforma, o software baseado na Web abre novos graus de liberdade, permitindo que os usuários escrevam, editem e compartilhem scripts do eVOLVER personalizados, gerando programas de cultura totalmente automatizados e habilitados para comentários (por exemplo, turbidostat). Os usuários podem varrer programaticamente entre intervalos de parâmetros em variações sutis no mesmo esquema de seleção ou conectar algoritmos de controle em novas combinações para especificar qualquer número de esquemas de seleção sofisticados. Além disso, a capacidade de monitorar facilmente culturas em tempo real transforma a maneira em que os experimentos são conduzidos. Com o monitoramento em tempo real, os usuários podem 1) verificar a consistência entre as execuções, um recurso crítico para aplicações de bioprodução e experimentos de alta produtividade, e 2) intervir durante experimentos, se necessário, para solucionar problemas de tensões desafiadoras que exibem crescimento deficiente ou formação de biofilme, ou diagnosticar erros do usuário (por exemplo, contaminação). Finalmente, com vários fluxos de dados sendo coletados e interpretados em tempo real para cada cultura individual, o eVOLVER gera uma alta densidade de dados, o que pode facilitar abordagens de aprendizado de máquina para a análise de novos downstream.
Além dos usos demonstrados para caracterização de condicionamento físico, seleção de bibliotecas e evolução laboratorial, vemos uma série de campos relacionados como maduros para implementação no eVOLVER com fluidics integrados. os experimentos Evolver com amostras de microbioma podem ensaiar a estabilidade da Comunidade em ambientes controlados31,32, explorar a composição da microbiota usando técnicas de culturomicina33, ou misturar dinamicamente espécies para Interrogue a dinâmica ecológica de colonização ou invasão34,35. Os métodos numerosos para a evolução dirigida contínua das biomoléculas podiam facilmente ser implementados no dispositivo também26,36,37, aumentando extremamente a acessibilidade e a taxa de transferência destes sistemas. A capacidade de otimizar as condições de crescimento, como composição de mídia, temperatura e tensões em uma natureza dinâmica e de alta taxa de transferência, pode ajudar na otimização de esforços para aplicações de biomanufatura industrial9. Nós imaginamos mais verticalmente integrando eVOLVER com outras técnicas da análise tais como a microscopia e a citometria do fluxo em uma forma Closed do laço, fornecendo um sistema inteiramente automatizado para o crescimento e a análise de culturas celulares na única pilha e na população Níveis. Além disso, com algumas modificações de hardware para a luva inteligente, tais como vedação do navio e o teor de gás de controle, eVOLVER poderia potencialmente ser adaptado para apoiar o crescimento de uma gama mais ampla de tipos de células, como a suspensão de células de mamíferos. Também é viável colocar toda a estrutura em uma câmara anaeróbia para cultura celular anaeróbia. Olhando para a frente, pretendemos construir a nossa estrutura de software em uma infra-estrutura de nuvem centralizada e acredito que isso permitiria aos usuários facilmente configurar, analisar e compartilhar seus dados remotamente, sem a necessidade de estar fisicamente presente no laboratório. Funcionando como curador de dados, a infraestrutura de nuvem também se emprestaria a análises de meta em grande escala em experimentos. Prevemos que o eVOLVER e esses futuros avanços expandirão enormemente o escopo de possíveis experimentos de seleção de crescimento facilitando a automação e a inovação na cultura contínua.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a B. Stafford por sua ajuda na concepção do sistema, e H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, e A. Cavale para ajudar na construção do sistema. Reconhecemos a Electronics design Facility (EDF), o centro de inovação de produtos de engenharia (EPIC) e o software & Application Innovation Lab (SAIL) no Instituto Hariri para computação da Universidade de Boston para os seus serviços. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de carreira NSF (MCB-1350949 a A.S.K.), e DARPA concede HR0011-15-C-0091 e HR0011-18-2-0014 (para A.S.K.). A.S.K. também reconhece o financiamento do novo prêmio inovador do diretor da NIH (1DP2AI131083-01), DARPA Young Faculty Award (D16AP00142) e NSF Expeditions in Computing (CCF-1522074).
5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
eVOLVER Unit | FynchBio | ||
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
Pipettes | Eppendorf | ||
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |